技术领域
本发明涉及一种产氢相关蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
十八世纪世界工业革命以来建立的化石能源体系如今正面临着两大挑战：1)化石能源储量日益减小，面临着枯竭的危险；2)化石燃料的燃烧产生了大量污染物质，特别是CO2等温室气体的排放引起的温室效应，给人类赖以生存的环境带来巨大的威胁。因此，开发可持续发展的可再生清洁能源，逐步替代化石能源是关系国家能源安全、环境安全及社会稳定和平发展的重要战略课题。
氢能作为极具潜力的未来替代清洁能源之一，是高效的能源载体，具有能量密度高、清洁、可再生、燃烧产物为水和无污染等特点，是十分理想的可再生能源。目前，氢气主要来自化石燃料的重整转化(占氢气来源的96％)和电解水制氢(占4％)，未能摆脱对原有的化石能源的依赖。因此，如何利用可再生资源持续地获取氢气受到人们的广泛的关注。生物制氢是解决这一问题的重要途径之一。生物制氢具有常温常压反应、条件温和、对环境友好、可利用废弃生物物质为底物等优点，可以和环境污染治理、减少污染排放相联系，是十分理想的制氢方法。
现代生物制氢的研究始于20世纪70年代的能源危机，90年代以来，随着人们对温室效应的进一步认识，生物制氢作为可持续发展的制氢方法更加引起了人们的广泛重视。生物制氢技术包括光驱动过程和厌氧发酵两种路线。前者利用光合细菌或藻类直接将太阳能转化为氢气，是一个非常理想的过程，但是由于光利用效率很低，光反应器设计困难等因素，近期内很难推向应用。后者采用的是产氢菌厌氧发酵，它的优点是产氢速度快、反应器设计简单、且能够和废弃生物的利用相结合，相对于前者更容易在近期内实现工业应用。
发酵法制氢始于六十年代中期，九十年代受到重视，但进展并不大。九十年代末到本世纪初，人们意识到发酵制氢更容易在近期内实现产业化，大大增加了暗发酵制氢方面的科研投入，产生了一批有关培养工艺的基础性研究结果。近年来与废弃生物质处理相结合的制氢过程的研究大为增加，其中一些达到了中试水平，但主要集中在反应器类型设计、工艺研究上，且混合培养产氢效率低于纯培养，总的转化率都不高，这也正是发酵制氢的瓶颈所在。解决发酵制氢瓶颈的关键，是实现技术突破，提高氢气得率。研究表明，仅从工艺的角度，无法从根本上突破产氢效率低的问题，必须注重高效产氢菌种的研究与开发。
多年以来，暗发酵制氢中应用的产氢菌种主要包括肠杆菌属(Enterobacter)、梭菌属(Clostridium)、埃希氏菌属(Escherichia)和芽孢杆菌属(Bacillus)，其中尤以肠杆菌属和梭菌属的相关研究最多。梭菌属产氢率最高可达到2.36mol/mol葡萄糖，产气肠杆菌属产氢率最高可达3mol/mol葡萄糖(即6mol/mol蔗糖)[Kumar，N.and Das，D.Bioprocess Engineering 23，205-208(2000)]，[Kumar，N.andDas，D.Process Biochemistry 35，589-593(2000)]。以梭菌(Clostridium sp)为代表的专性厌氧菌发酵产氢的机理为：葡萄糖酵解后生成丙酮酸，在形成醋酸过程中，一部分电子通过铁氧还蛋白在氢酶作用下形成氢气。一摩尔的葡萄糖可形成4摩尔氢气和2分子醋酸。因此，专性厌氧菌发酵产氢的同时，必然伴随醋酸等有机酸的形成。兼性厌氧产氢菌E.aerogenes通过糖解途径和三羧酸循环(TCA)途径产生NADH和ATP，氢酶通过NADH将质子转换为氢气，产氢理论转换率为1摩尔葡萄糖形成12mol氢气，远远大于专性厌氧菌的氢得率。因此，E.aerogenes是开发高效发酵制氢工艺的重要菌种。
随着生物技术的飞速发展，单纯的菌种筛选和培养工艺的优化已不能满足提高产氢效率的需求。发酵制氢的研究需要进入细胞内部，通过对氢酶及其代谢网络的改造来强化产氢过程。目前在基因库上已经可以获得超过100种氢酶的基因序列[Paulette M.Vignais，Bernard Billoud，Jacques Meyer.FEMS MicrobiologyReviews 25，455-501(2001)]，但仍有大量已知产氢菌株的氢酶基因尚未被克隆，寻找更多的氢酶基因是生物制氢研究的重要方向[Kalia，V.C.，Lal，S.，Ghai，R.，Mandal，M.and Chauhan，A.Trends in Biotechnology 21，152-156(2003)]。不同的氢酶具有不同的功能，和其它酶系相比，人们对氢酶的认识还十分有限。
目前，研究的比较清楚的是大肠杆菌的氢酶I、II、III和IV的基因，它们都属于Ni-Fe氢酶，其中氢酶III和IV和产氢有关[Andrews，S.C.，Berks，B.C.，Mcclay，J.，Ambler，A.，Quail，M.A.，Golby，P.and Guest，J.R.Microbiology143，3633-3647(1997)]，而I、II和吸氢过程相关。梭菌属的氢酶都属于铁氢酶，三梭菌的铁氢酶已有测序结果，但是关于其附属基因、调控机制还不清楚。已经克隆到梭菌的铁氢酶基因，并在光合细菌内获得了异源表达，强化了光合菌的产氢过程。梭菌的铁氢酶基因在大肠杆菌中的表达却没有成功，可能是由于梭菌和大肠杆菌对于铁氢酶表达的附属基因系统不相同造成的[Yasuo Asada，Yoji Koike，JorgSchnackenberg，Masato Miyake，Ieaki Uemura，Jun Miyake.Biochimica etBiophysica Acta 1490，269-278(2000)]。最近，Mishra J.等通过铁氢酶保守序列设计的方法从E.cloacae IIT-BT08中克隆出450bp左右的铁氢酶，并在不产氢的大肠杆菌中异源表达，验证了其功能，结果显示这个氢酶位于细胞质内[Mishra，J.，Kumar，N.，Ghosh，A.K.and Das，D.International Journal of Hydrogen Energy27，1475-1479(2002)]，[Mishra，J.，Khurana，S.，Kumar，N.，Ghosh，A.K.andDas，D.Biochemical and Biophysical Research Communications 324，679-685(2004)]。产气肠杆菌E.aerogenes的前期研究表明，在其细胞膜上，氢酶与细胞内产生的NADH作用生成氢气[Nakashimada，Y.，Rachman，M.A.，Kakizono，T.andNishio，N.International Journal of Hydrogen Energy 27，1399-1405(2002)]。因此研究该菌属的氢酶特性、基因及其功能解析，对于实现提高产气肠杆菌产氢得率的技术突破具有重要意义。
对大肠杆菌产氢过程的研究表明，大肠杆菌可直接利用甲酸，也可以在同化糖类物质代谢过程中产生的甲酸为底物，在甲酸裂解酶系的作用下，分解甲酸生成CO2和H2。[Akihito Yoshida，Taku Nishimura，Hideo Kawaguchi，1 Masayuki Inui，andHideaki Yukawa*.Appl Environ Microbiol.71：6762-6768(2005)]。甲酸产氢途径是产氢速度最快的途径。
产气肠杆菌是兼性厌氧菌，生长速度快，在厌氧条件下可以产生氢气，且具有利用底物范围广，生长适应性强等优点，是具有优良工业性状的菌株。已有许多关于产气肠杆菌产氢的报道，但多是在工艺及培养方面[E.Palazzi，B.Fabiano，P.Perego.Bioproeess Eng.22：205-213(2000).]，有关产氢相关的基因还没有任何报道。研究表明，产气肠杆菌具有和大肠杆菌相似的利用甲酸产氢的能力[Tatsuo，K.，Shigeharu，T.Mar Biotechnol.7：112-118(2005).]，而且其具有吸氢过程，即有吸氢酶的存在[Y.L Ren.，X.H.Xing.，C.Zhang.，and Z.X.Gou.Biotechnol Lett.27(14)：1029-1033(2005).]。代谢分析表明，在以葡萄糖为底物进行发酵制氢时，其代谢终产物中，乳酸的浓度接近70％，这也是引起发酵过程中培养基pH下降过快，从而抑制菌体生长及降低了发酵时对底物更有效利用的主要原因。
发明内容
本发明的目的是提供一种产氢相关蛋白及其编码基因与应用。
本发明提供的产氢相关蛋白，名称为LdhD，来源于产气肠杆菌E.aerogenesIAM1183，是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与产氢相关的由序列1衍生的蛋白质。
为了使(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列 Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH FLAG 8 DYKDDDDK Strep-tag II 8 WSHPQFEK c-myc 10 EQKLISEEDL
上述(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
所述蛋白的编码基因(ldhd)也属于本发明的保护范围。
所述蛋白的编码基因具体可为如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)其编码序列是序列表中序列2所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
含有所述蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
本发明还保护一株产氢工程菌，是灭活E.aerogenes IAM1183中所述ldhd基因得到的。
所述灭活是通过同源重组实现的，具体是通过双亲本亲和的单交换实现的。
所述同源重组具体可将自杀性载体pGP704-ldhd导入E.aerogenes IAM1183实现；所述自杀性载体pGP704-ldhd是在pGP704的多克隆位点插入序列表中序列2自5′末端第363至898位脱氧核糖核苷酸得到的重组载体。
本发明还保护自杀性载体pGP704-ldhd，是在pGP704的多克隆位点插入序列表中序列2自5′末端第363至898位脱氧核糖核苷酸得到的重组载体。
含有所述自杀性载体pGP704-ldhd的转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
所述的工程菌可应用于生物制氢。
本发明以具有高效产氢潜力的产气肠杆菌(E.aerogenes)为出发菌株，通过对产气肠杆菌(E.aerogenes)中的ldhd基因进行灭活，获得了一株产氢能力提高、利用葡萄糖能力强的工程菌，可应用于生物制氢，对利用产气肠杆菌制氢，具有巨大的指导意义。
本发明获得的工程菌具有以下优点：
1)出发菌株E.aerogenes IAM1183是兼性厌氧菌，在好氧、厌氧条件下均能快速生长，对环境适应性强；利用其进行生物制氢具有利用底物范围广、利用底物能力强和产氢较高的优点，是具有潜在应用于工业化生物制氢的优良菌株。
2)本发明获得的工程菌，除了具有原始菌1)的优点外，还具有底物利用能力更强，产氢能力进一步提高的特点。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
附图说明
图1为ldhd基因的PCR电泳图
图2为自杀载体pGP704-ldhd的PCR鉴定图
图3为工程菌E.aerogenes IAM1183-Δldhd的单抗和双抗筛选图
图4为工程菌E.aerogenes IAM1183-Δldhd的PCR鉴定图
图5为工程菌E.aerogenes IAM1183-Δldhd的生长曲线
图6为工程菌E.aerogenes IAM1183-Δldhd生长过程中的pH变化曲线
图7为工程菌E.aerogenes IAM1183-Δldhd的产氢情况
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明中所用到的引物如下：
Ldh-fw：ATGAAAATCGCSGTTTATAG；
Ldh-rw：TTAGACGATGGCGTTCGGAC；
Ldh-E-fw：cgGAATTCCCGCGCTTACCAGCGTACC；
Ldh-E-rw：cgGAATTCGTCAGGAAAGCCTGATGCCC；
Primer-Pgp-1-fw：CATGCGCTCCATCAAGAAGA；
Primer-Pgp-2-rw：GTGGGTCTCGCGGTATCATT。
以下实施例中所涉及的培养基配方及用途如下：
(1)LB培养基(L-1)：蛋白胨10g、酵母浸粉5g、NaCl 10g、琼脂粉15g(固体培养基时添加)；用于菌种短期保藏和活化培养。
(2)葡萄糖培养基(L-1)：葡萄糖15g、蛋白胨5g、K2HPO4·3H2O 14g、KH2PO4 6g、(NH4)2SO4 2g、MgSO4·7H2O 0.2g；用于发酵制氢。
实施例1、产气肠杆菌ldhd基因的获得
根据已经发表的D-乳酸脱氢酶(D-lactate dehydrogenase)基因序列，设计一对兼并引物Ldh-fw和Ldh-rw。以产气肠杆菌(E.aerogenes IAM1183)(购自日本东京大学应用微生物研究所(IAM)菌种库)的基因组DNA为模板进行PCR扩增。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图见图1。图1中，1：PCR产物；2：Marker。
结果表明，得到了分子量约为900bp的条带。将该PCR产物4℃保存，送上海Invitrogen Corporation测序，测序结果表明，扩增到的核苷酸序列见序列表的序列2，编码氨基酸序列是序列表的序列1的蛋白质。
经网上比对，序列2和Klebsiella pneumoniae subsp的D-lactatedehydrogenase基因具有84％的最高同源性，序列1和Klebsiella oxytoca和Klebsiella pneumoniae subsp的D-lactate dehydrogenase蛋白具有最高同源性。将核苷酸序列如序列2所示的DNA命名为ldhd基因，将氨基酸序列如序列1所示的蛋白质命名为LdhD蛋白。
实施例2、产气肠杆菌E.aerogenes IAM1183-Δldhd的获得
一、自杀载体pGP704-ldhd的构建
设计一对带有EcoR I酶切位点的引物Ldh-E-fw、Ldh-E-rw。以产气肠杆菌(E.aerogenes IAM1183)的基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到540多bp的片段。EcoRI酶切PCR产物，与EcoR I酶切的pGP704[Kolter，R.Inuzuka，M.and Helinski，D.(1978).Cell 15：1199-1208，Miller，V.and Mekalanos，J.(1988).J.Bact.170：2575-2583]连接。连接产物转化E.coli DH5α(大连宝生物公司)，在LB氯霉素(24mg/mL)抗性平板筛选，挑取正确的转化子，提取质粒进行PCR鉴定，具体如下：
根据pGP704上的序列设计一对引物Primer-Pgp-1-fw和Primer-Pgp-2-rw。用引物Ldh-E-fw和Primer-Pgp-2-rw对重组质粒进行PCR鉴定，见图2的泳道1。同样，用引物Primer-Pgp-1-fw和Ldh-E-rw对重组质粒进行PCR鉴定，见图2的泳道2。图2中，泳道3为pGP704质粒，泳道4为Marker。结果表明，得到了预期的重组质粒，将其命名为pGP704-ldhd自杀载体。
二、产气肠杆菌E.aerogenes IAM1183-Δldhd的获得
1、将pGP704-ldhD自杀载体，通过电转化的方式，导入原始菌E.aerogenesIAM1183。
2、将转化后的E.aerogenes IAM1183，37℃复壮45分钟，涂布在含有氯霉素(24mg/mL)的LB固体平板上进行筛选。
3、挑取在含有氯霉素抗性平板上生长的菌落，转接到含有氨苄青霉素(100mg/mL)和氯霉素(24mg/mL)的双抗性LB平板上，培养12h。将在双抗性平板上生长的菌落，挑取到新的双抗性LB平板。
单抗筛选和双抗筛选的结果见图3。图3中，左图为双抗筛选的结果，右图为单抗筛选的结果。观察发现2#菌和5#菌的生长良好。
提取2#菌和5#的基因组DNA，分别用引物Ldh-E-fw和Primer-Pgp-2-rw(A)；Primer-Pgp-2-fw和Ldh-E-rw(B)；Ldh-E-fw和Ldh-E-rw(C)作为引物对2#和5#的DNA进行PCR进行鉴定，结果如图4所示。图4中，1：2#转化子用引物A进行PCR的产物；2：2#转化子用引物B进行PCR的产物；3：2#转化子用引物C进行PCR的产物；4：5#转化子用引物A进行PCR的产物；5：5#转化子用引物B进行PCR的产物；6：5#转化子用引物C进行PCR的产物。
结果表明：2#转化子与预期的结果相一致，是正确的转化子；5#转化子没有得到预期的特征带，为假阳性菌体。将2#菌命名为工程菌E.aerogenes IAM1183-Δldhd。
实施例3、工程菌的生长特性、产氢性能及代谢流
一、摇瓶培养条件下工程菌的生长特性、产氢性能及代谢流
分别将工程菌E.aerogenes IAM1183-Δldhd和野生菌E.aerogenes IAM1183进行摇瓶培养，检测它们的生长特性、产氢性能和代谢流，具体步骤如下：
在70mL血清瓶中装20mL葡萄糖培养基，将活化后的工程菌接入培养基，进行摇瓶培养；同时将活化后的野生菌进行同样条件的摇瓶培养，作为对照。
(1)种子培养：将活化的工程菌(或野生菌)接种至含5ml LB培养基的15ml离心管，37℃、170rpm、空气浴培养过夜，得到种子菌。
(2)厌氧摇瓶培养：将种子菌接种至含20ml葡萄糖培养基的70ml血清瓶(预先用氮气置换培养瓶顶部及培养基中的空气)，接种量为2.5％(v/v)。37℃、170rpm、空气浴培养24小时。
利用分光光度计(UV-1206，SHIMADZU公司(日本))测定菌体的生长情况；利用pH计(CHN060(828)，ORION公司(美国))测定pH的变化情况。培养16小时后对代谢产物进行检测。将发酵物离心取上清后，过滤。利用高压液相色谱测定代谢物的产量和组成。高压液相气谱为(HPLC-10A，SHIMADZU公司(日本)。试验设三次重复，所有结果均为三次重复的平均值，用平均值±标准差表示。
工程菌和野生菌的OD600的变化见图5，工程菌和野生菌的培养液的pH变化见图6。工程菌和野生菌的产氢情况变化见图7；工程菌的代谢流分析结果见表2。
表2E.aerogenes IAM1183-Δldhd工程菌的代谢流分析(n＝3)
结果表明：1)工程菌的OD600明显提高。2)工程菌的pH值下降速度小于野生菌，且在pH＝5.5时，不再下降。3)工程菌葡萄糖的利用率达到100％，高于野生菌的利用率57.7％，说明Δldhd的灭活能有效增加产氢代谢途径的通量，从而提高细胞产氢得率。3)工程菌乳酸的生成量远小于野生菌。5)工程菌的2，3-丁二醇、琥珀酸和乙醇的得率均比野生菌有所增加，而上述物质都是依赖胞内NADH而产生的代谢产物，显示出胞内可利用的还原力的增加，而这是有利于产氢的一个重要条件。6)工程菌的乙酸和乙醇产量之和比野生型菌株有一定幅度的提高，表明甲酸产氢途径在产氢过程中被强化，达到了预期的产氢的效果。
二、罐发酵
为了检测工程菌E.aerogenes IAM1183-Δldhd的产氢能力和底物利用能力及代谢流向，进行如下操作：
将活化好的E.aerogenes IAM1183-Δldhd工程菌，接种到30mL的LB培养基中，过夜培养，得到种子液。将60mL种子液接种到含有3L葡萄糖培养基的5L发酵罐中，37℃进行厌氧发酵。检测生产的氢气量和代谢产物，方法同步骤一。野生菌的操作同上，作为对照。结果见表3。
表3 E.aerogenes IAM1183-Δldhd工程菌的产氢量及代谢流分析
结果表明：1)工程菌氢气的产量是野生菌的1.9倍。2)工程菌的生长情况好于原始菌，终OD600是原始菌的1.5倍。3)工程菌pH下降速度远小于野生菌，且当下降到5.5时，则不再下降，随着培养时间的延长，pH值略有回升，说明产生的有机酸被部分消耗。4)工程菌葡萄糖的利用率可达98.9％，远大于野生菌的85.8％。5)工程菌乳酸的生成量远远小于野生菌。6)工程菌琥珀酸、甲酸、乙酸、2，3-丁二醇、乙醇的产量大于野生菌。
试验表明，对靶基因的灭活会引起胞内相应酶活性的变化，进而改变代谢通量，增加目标产物的产量。工程菌株E.aerogenes IAM1183-Δldhd的发酵制取氢气的生物性状远远好于野生菌，是极具潜力制氢菌种。
序列表
<110>清华大学
<120>一种产氢相关蛋白及其编码基因与应用
<130>CGGNARY81498
<160>2
<210>1
<211>329
<212>PRT
<213>产气肠杆菌(E.aerogenes)
<400>1
Met Lys Ile Ala Val Tyr Ser Thr Lys Gln Tyr Asp Lys Lys Tyr Leu
1 5 10 15
Gln His Val Asn Asp Thr Tyr Gly Phe Glu Leu Glu Phe Phe Asp Phe
20 25 30
Leu Leu Thr Glu Lys Thr Ala Lys Thr Ala Asn Gly Cys Glu Ala Val
35 40 45
Cys Ile Phe Val Asn Asp Asp Gly Ser Arg Pro Val Leu Glu Glu Leu
50 55 60
Lys Ala Tyr Gly Val Lys Tyr Ile Ala Leu Arg Cys Ala Gly Phe Asn
65 70 75 80
Asn Val Asp Leu Asp Ala Ala Lys Glu Leu Gly Leu Arg Val Val Arg
85 90 95
Val Pro Ala Tyr Ser Pro Glu Ala Val Ala Glu His Ala Val Gly Met
100 105 110
Met Met Ser Leu Asn Arg Arg Ile His Arg Ala Tyr Gln Arg Thr Arg
115 120 125
Asp Ala Asn Phe Ser Leu Glu Gly Leu Thr Gly Phe Thr Met His Gly
130 135 140
Lys Thr Ala Gly Val Ile Gly Thr Gly Lys Ile Gly Val Ala Thr Leu
145 150 155 160
Arg Ile Leu Lys Gly Phe Gly Met Arg Leu Leu Ala Phe Asp Pro Tyr
165 170 175
Pro Ser Ala Ala Ala Leu Asp Leu Gly Val Glu Tyr Val Asp Leu Pro
180 185 190
Thr Leu Tyr Ala Gln Ser Asp Val Ile Ser Leu His Cys Pro Leu Thr
195 200 205
Glu Glu Asn Tyr His Leu Leu Asn His Ala Ala Phe Glu Gln Met Lys
210 215 220
Asp Gly Val Met Val Ile Asn Thr Ser Arg Gly Ala Leu Ile Asp Ser
225 230 235 240
Gln Ala Ala Ile Asp Ala Leu Lys His Gln Lys Ile Gly Ala Leu Gly
245 250 255
Met Asp Val Tyr Glu Asn Glu Arg Asp Leu Phe Phe Glu Asp Lys Ser
260 265 270
Asn Asp Val Ile Gln Asp Asp Val Phe Arg Arg Leu Ser Ala Cys His
275 280 285
Asn Val Leu Phe Thr Gly His Gln Ala Phe Leu Thr Ala Glu Ala Leu
290 295 300
Ile Ser Ile Ser Gln Thr Thr Leu Asp Asn Leu Arg Gln Val Asp Ala
305 310 315 320
Gly Glu Thr Cys Pro Asn Ala Ile Val
325
<210>2
<211>990
<212>DNA
<213>产气肠杆菌(E.aerogenes)
<400>2
atgaaaatcg ccgtttatag tacgaagcag tacgataaaa agtaccttca gcatgttaat 60
gatacatatg gctttgaact cgaatttttc gacttcctgt taaccgaaaa aaccgcgaaa 120
acggccaacg gctgtgaagc cgtgtgcata tttgtcaacg atgacggcag ccgtccggtg 180
ctggaagagc tgaaagcata cggggtgaag tacatcgccc tgcgctgcgc cgggtttaac 240
aacgtcgatc tggatgcggc aaaagagctg ggtctgcgcg ttgtccgcgt tcccgcctat 300
tcgccggaag ccgtggctga acatgccgtc ggcatgatga tgtcgttgaa ccgccgcatc 360
caccgcgctt accagcgtac ccgcgatgct aacttctcgc tggaaggctt aaccggcttt 420
accatgcacg gtaaaaccgc cggggtgatc gggaccggca aaatcggcgt cgccacgctg 480
cgtattctga aagggtttgg catgcgcctg ctggcgttcg atccctatcc aagcgccgca 540
gcgctggatc tcggcgtcga gtatgttgat ttgccgacgc tgtatgcaca gtccgatgtg 600
atctccctgc actgtccgct gacggaagag aactaccatc tgctgaatca tgcggcgttt 660
gagcaaatga aagacggcgt gatggtgatc aacaccagcc gcggggcgct gattgattct 720
caggcggcga tcgatgcgct gaaacaccag aaaatcgggg cgctgggcat ggacgtgtat 780
gagaacgaac gcgacctgtt cttcgaagat aagtccaatg acgtgattca ggatgacgtc 840
ttccgtcgcc tgtctgcctg tcataacgtg ttgttcaccg ggcatcaggc tttcctgacc 900
gccgaagcgc tgatcagcat ttcacaaacg accctggata acctgcgcca ggtcgatgct 960
ggcgaaacct gtccgaacgc catcgtctaa 990