技术领域
本发明涉及基因工程及发酵工程领域，具体地，本发明涉及一种脂肪酶EALIP及其基因和应用。
背景技术
脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)又称为甘油三酯水解酶，能催化天然底物油脂水解生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯，被广泛应用于食品、饲料、油脂加工、医药、洗涤等工业，是一种重要的工业酶制剂，具有十分广阔的应用前景。
不同来源的脂肪酶的氨基酸顺序和分子大小差别很大，但都是以相同的方式进行折叠的，即α/β折叠。这种结构包含一个被α螺旋包围着的以平行β-片层结构为主的核，β-折叠片之间通过α螺旋相连接。
脂肪酶作为一种重要的工业用酶制剂，其应用主要表现在以下几个方面：
1、食品工业
脂肪酶在食品工业中的应用主要包括：
(1)用于脂肪或油脂的加工，改变其物理、化学性状或提高其营养价值。
(2)改善食品风味或品质，延长面包、糕点等产品的保质期，控制非酶褐变，增大面包等产品的体积等。
2、饲料工业
脂肪酶作为一种饲用酶制剂，可以有效地提高猪、鸡、鸭、鱼等在生长过程中对脂肪的吸收和利用，提高动物饲粮中能量的利用率，同时还可补充部分必需的营养物质。
3、日化洗涤行业
在洗涤剂中加入5-500U/g的脂肪酶，能提高洗涤剂的去污能力并降低表面活性剂和三聚磷酸钠的用量，减少去污剂对环境的污染。另外，在废水处理时加入一定量的脂肪酶，可高效除去脂肪，减少废水处理的成本和降低二次污染。
此外，脂肪酶还可应用于造纸、医药、环保等行业。
脂肪酶广泛存在于动植物和微生物中，植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，动物体内含脂肪酶较多的则是胰脏和脂肪组织。能产脂肪酶的微生物很多，主要集中在黑曲霉、假丝酵母、根霉、假单胞菌、链霉菌等菌株。
由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，而且具有比动物更广泛的pH值、温度范围以及底物专一性，因此微生物脂肪酶成为工业用脂肪酶的重要来源。
目前国内脂肪酶的生产仍然面临着发酵水平低、应用效果不强、生产成本高等问题，因此大力加大脂肪酶的研发力度，尽快推出合适的脂肪酶产品，成为我国酶制剂行业的一个亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种脂肪酶EALIP。
本发明的另一目的是提供编码上述脂肪酶的基因EGALip。
本发明的另一目的是提供包含上述脂肪酶的重组载体EGALip-pPICZaA。
本发明的另一目的是提供包含上述脂肪酶基因EGALip的重组菌株。
本发明的另一目的是提供制备上述脂肪酶EALIP的方法。
本发明的另一目的是提供上述脂肪酶EALIP的应用。
本发明所提供的脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：
该脂肪酶酶蛋白由291个氨基酸组成，其N端前20个氨基酸序列为信号肽序列，理论pI/Mw：4.92/30972，成熟的脂肪酶EALIP序列如下SEQ ID No.2所示：
本发明还提供了编码上述脂肪酶的基因EGALip，该基因的序列如SEQ ID No.3所示：
整个基因序列为876bp，其中1-60bp为信号肽序列，成熟蛋白的编码序列如SEQ ID No.4所示。
本发明的脂肪酶的最适反应温度为50℃，最适反应pH为6.0，该脂肪酶在75℃前耐热性能良好，当处理温度超过75℃后，酶活有一定程度的损失，Ca2+、Mg2+、Co2+对酶活有一定的激活作用，K+、Zn2+、Fe2+、Mn2+对酶活影响不大，Fe3+、Cu2+则对酶活有一定程度的抑制作用。
本发明还提供了包含上述脂肪酶基因EGALip的重组载体，优选为EGALip-pPICZaA。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的脂肪酶基因EGALip插入到质粒pPICZaA上的EcoR I和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，获得重组酵母表达载体EGALip-pPICZaA。
本发明还提供了包含上述脂肪酶基因EGALip的重组菌株，优选重组菌株为毕赤酵母菌株X33。
本发明还提供了一种高效表达上述脂肪酶基因EGALip的方法，具体包括以下步骤：
1)用上述重组载体采用电转化法转化毕赤酵母感受态细胞X33，筛选获得重组菌株EGALip-pPICZaA–X33；
2)采用筛选获得的重组毕赤酵母菌株在25L发酵罐中进行发酵，诱导该脂肪酶的表达；以及
3)发酵结束后，回收并纯化所表达的该脂肪酶进行相关测试。
其中，重组菌株在发酵罐中的发酵过程可分为3个阶段：
第一阶段为菌体培养阶段，按10％的比例接入种子，培养16-20小时，以补完葡萄糖、pH及DO上升为标志；
第二阶段为饥饿阶段，当葡萄糖补完之后，不流加任何碳源，当溶氧上升至80％以上即表明该阶段结束，为期约30-60min；
第三阶段为诱导表达阶段，流加诱导培养基，并且保持溶氧在20％以上，整个培养时间为180-200小时之间。
发酵结束后，发酵液可通过陶瓷膜去除菌体及超滤膜处理后获得浓缩的粗酶液。利用本发明的方法高效表达上述的脂肪酶，可达到15000U/mL左右的发酵水平，而且酶的稳定性能好，大大降低了脂肪酶的生产成本，有利于该脂肪酶的推广应用。
附图说明
图1、重组脂肪酶在25L罐中的发酵过程曲线
图2、重组脂肪酶的最适反应温度曲线
图3、重组脂肪酶的最适反应pH曲线
图4、重组脂肪酶的耐温性能曲线
图5、重组脂肪酶在室温下保存稳定性的测定结果
图6、各种离子对脂肪酶酶活力的影响
具体实施方式
以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实验材料和试剂：
1、菌株与载体
大肠杆菌菌株Topl0、毕赤酵母X33、载体pPICZaA均购自Invitrogen公司。
2、酶与试剂盒
逆转录酶SuperScriptTM III购自Invitrogen公司。RNA提取试剂盒、质粒DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、连接酶、限制性内切酶购自上海生工公司。
3、培养基
基础盐培养基(BSM)：磷酸二氢铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、氢氧化钾0.1％、消泡剂0.03％。0.1MPa、121℃灭菌30min，冷却后每升加4.4毫升无机盐溶液(PTM1)。
微量无机盐溶液(PTM1)配制：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％、一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、六水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、浓硫酸0.5％、生物素0.02％
实施例1、黑曲霉菌株脂肪酶基因的克隆
培养产脂肪酶黑曲霉菌株(Aspergillus Niger)，运用RNA提取试剂盒，提取黑曲霉ACCC30132的总RNA，按照逆转录酶SuperScriptTM III Reverse Transcriptase操作说明合成第一链cDNA。以cDNA为模板，设计引物进行PCR扩增。
扩增所用引物如下：
LIP-S(EcoRI)：
5’GCACTGAATTCAAGGTCGGATTTCGTACTC 3’
LIP-A(NotI)：
5’GCACTGCGGCCGCTTACAAAAGCGACGAAGA3’
PCR结束后，将PCR产物纯化并用限制性内切酶EcoRI和NotI进行双酶切，然后与经过同样双酶切的载体pPICZaA相连接，连接产物转化大肠杆菌Topl0感受态细胞，经抗生素Zeocin筛选后，获得阳性克隆。提取阳性克隆的质粒，该质粒载体命名为EGALip-pPICZaA，并送样到上海生工公司测序。测序结果表明，该编码脂肪酶的基因全长876bp，编码291个氨基酸。
实施例2、含脂肪酶基因EGALip的毕赤酵母工程菌的构建
将上述重组表达载体EGALip-pPICZaA采用SacI进行线性化，线性化后的重组载体电击转化毕赤酵母X33感受态细胞，电转化后涂布于含Zeocin的YPD平板上进行筛选，筛选得到高产脂肪酶的毕赤酵母重组菌株EGALip-pPICZaA-X33。
实施例3、脂肪酶菌株的发酵培养
采用筛选获得的脂肪酶重组菌株EGALip-pPICZaA-X33进行高密度液体发酵培养。
配制10L基础盐培养基，在25L液体发酵罐中高温灭菌后，冷却至常温。用氨水调节发酵液的pH值为4.60，接入1L液体种，发酵温度设定为30℃，调节转速和空气流量控制整个发酵过程中溶氧大于20％以上。
整个发酵过程分3个阶段：
第一阶段为菌体培养阶段，流加已灭菌的2L 50％的葡萄糖，培养20-24小时，流加葡萄糖完后结束；
第二阶段为饥饿阶段，葡萄糖流加完之后，当溶氧上升至80％以上、pH上升即表明该阶段结束，为期约30min；
第三阶段为诱导表达阶段，流加甲醇进行诱导表达，并且保持溶氧在20％以上，培养时间在180小时左右。
在发酵过程中的定时取样测定酶活，发酵过程中脂肪酶的表达情况如附图1所示，发酵192h的发酵液酶活为14965U/mL。
实施例4、脂肪酶的性质测定
脂肪酶的酶活力检测
酶活单位定义：1g固体酶粉，于40℃、pH7.5条件下，水解脂肪每分钟产生1微摩尔(μmol)的脂肪酸，即为1个脂肪酶单位，以U/g表示。
1、最适反应温度测定
参照脂肪酶的检测方法，设定不同的检测温度，以最高酶活力为100％，其它温度下测得的酶活与之相比，即得到该温度下的相对酶活。
该脂肪酶的最适反应温度曲线见图2，其最适反应温度为50℃左右。
2、最适反应pH测定
配制不同pH值的缓冲液(pH1.5-10)，分别在不同pH条件下进行酶活测定，以最高酶活为100％，其他检测结果与之相比，即得到不同pH检测条件下的相对酶活。
该脂肪酶最适反应pH曲线见图3，其最适反应pH为6.0左右。
3、耐温性能测试
采用发酵获得的脂肪酶样品(固体，总含水量为17％左右，相当于饲料制粒时的水分含量)，在不同温度下(60-100℃)处理10min，然后按照脂肪酶的检测方法，测定经不同温度下处理的样品酶活，以未处理的样品酶活为100％，其它检测结果与之相比，即得到该脂肪酶经不同温度处理的相对酶活。
该脂肪酶的耐温性能曲线见图4。检测结果表明，该脂肪酶在75℃前耐热性能良好，当处理温度超过75℃后，酶活有一定程度的损失。
4、脂肪酶的保存稳定性测定
将脂肪酶固体样品置于室温下贮存，每月定时取样，按照脂肪酶的检测方法，检测不同保存时间的样品酶活，以初始酶活为100％，不同时间取样所测酶活与之相比，即得到该脂肪酶在不同保存时期的相对酶活。
该脂肪酶的稳定性测定结果见图5。结果显示该脂肪酶的稳定性能良好，在室温条件下保存半年，剩余酶活仍可达到92％以上。
5、各种离子对脂肪酶活力的影响
将含有1mM K+、Mg2+、Ca2+、Fe2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Cu2+的磷酸缓冲液与稀释适当倍数的酶液混合，室温放置1h，以未处理的酶液为对照，结果如图6所示。结果表明，Ca2+、Mg2+、Co2+对酶活有一定的激活作用，K+、Zn2+、Fe2+、Mn2+对酶活影响不大，Fe3+、Cu2+则对酶活有一定程度的抑制作用。