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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710081107.7 (22)申请日 2017.02.15 (71)申请人 江苏食品药品职业技术学院 地址 223000 江苏省淮安市经济技术开发 区枚乘东路4号食品学院 (72)发明人 翟玮玮孙兆远侯会绒 (74)专利代理机构 南京纵横知识产权代理有限 公司 32224 代理人 董建林 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) (54)发明名称 一种红椒根际促生菌液体发酵的方法 (57)摘要 本发明公开了一种红椒根际促生菌液体发 酵的方法， 包含以下。
2、步骤： 取红椒根际促生菌菌 株接种至种子培养基中， 制成种子液； 将发酵培 养液灭菌后装入三角瓶中， 装样量为25-75ml， 发 酵培养液中加入1%-10%的种子液， 在30-40恒 温振荡箱中培养24-72h后即得； 所述发酵培养液 包括碳源和氮源， pH值调节至5-7， 所述碳源包括 葡萄糖、 木糖、 蔗糖、 果糖、 甘露醇和乳糖中的一 种或几种， 所述氮源包括蛋白胨、 酵母粉、 硝酸 钾、 谷氨酸、 硫酸铵、 硝酸铵中的一种或几种。 本 发明所提供的一种红椒根际促生菌液体发酵的 方法， 能够使PGPR菌株达到较高的生长量和较高 的IAA产量， 可用于PGPR生物菌肥的大规模开发。 权利。
3、要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 106754564 A 2017.05.31 CN 106754564 A 1.一种红椒根际促生菌液体发酵的方法， 其特征在于， 包含以下步骤： 取红椒根际促生菌菌株接种至种子培养基中， 制成种子液； 将发酵培养液灭菌后装入 三角瓶中， 装样量为25-75ml， 发酵培养液中加入1%-10%的种子液， 在30-40恒温振荡箱中 培养24-72h后即得； 所述发酵培养液包括碳源和氮源， pH值调节至5-7， 所述碳源包括葡萄糖、 木糖、 蔗糖、 果糖、 甘露醇和乳糖中的一种或几种， 所述氮源包括蛋白胨、 酵母粉、 硝酸钾、 谷氨酸、 硫酸 铵、 硝酸铵中的。
4、一种或几种。 2.根据权利要求1所述的一种红椒根际促生菌液体发酵的方法， 其特征在于， 所述红椒 根际促生菌分离自淮安红椒根际。 3.根据权利要求1所述的一种红椒根际促生菌液体发酵的方法， 其特征在于， 所述碳源 为1% （W/V） 的蔗糖。 4.根据权利要求1所述的一种红椒根际促生菌液体发酵的方法， 其特征在于， 所述氮源 为1% （W/V） 的酵母粉。 5.根据权利要求1所述的一种红椒根际促生菌液体发酵的方法， 其特征在于， 所述发酵 培养液中加入的种子液中活菌含量大于108CFU/mL， 接种浓度为5%。 6.根据权利要求1所述的一种红椒根际促生菌液体发酵的方法， 其特征在于， 所述发酵。
5、 培养液pH值为6， 装液量50 ml， 接种后培养时间60 h， 培养温度35。 7.根据权利要求1所述的一种红椒根际促生菌液体发酵的方法， 其特征在于， 所述种子 液的制备方法为： 将接种了红椒根际促生菌菌株的种子培养基在温度30， 转速150r/min 的恒温振荡箱中培养60h。 8.根据权利要求1所述的一种红椒根际促生菌液体发酵的方法， 其特征在于， 所述种子 培养基包括蛋白胨l0g， 酵母提取物5g， 氯化钠l0g， 琼脂20g， 蒸馏水1000ml， pH7.0-7.2， 121 灭菌20min。 9.根据权利要求1所述的一种红椒根际促生菌液体发酵的方法， 其特征在于， 所述发酵 。
6、培养液包括L-色氨酸100mg、 (NH4)2SO42g、 NaH2PO40.50g、 K2HPO40.50g、 MgSO40.20g、 CaCl20.10g、 蒸馏水1000mL。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106754564 A 2 一种红椒根际促生菌液体发酵的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种红椒根际促生菌液体发酵的方法， 属于生物发酵技术领域。 背景技术 0002 植物根际促生细菌(Plant growth-promoting rhizobacteria， PGPR)是指自由生 活在土壤或附生于植物根际的一类可促进植物生长、 增加作物产量、 防治病害的有益菌类。 PGPR。
7、能够通过解磷、 自生固氮和螯合三价铁离子等方法给植物提供更多的营养物质以达到 促进植物根茎生长、 改变根形态， 增加根毛度、 根毛数、 侧根数、 根重量及根表面积的作用。 PGPR还可以分泌IAA(吲哚乙酸)等植物激素， 提升细胞壁的疏松度和可塑性， 促进RNA和蛋 白质的合成， 溶解细胞壁糖， 改变细胞内环境， 进而起到促进细胞生长， 增加细胞体积和质 量的作用。 0003 我国生物学家早在1953年就从陕西径阳县老苜蓿根系土壤中分离出 “5406” PGPR 菌株(细黄链霉菌乳糖变种)， 经诱变处理制成生物菌肥， 结果显示该菌肥具有防病保苗、 促 进生长和肥地松土的作用。 但由于当时发酵设。
8、备和技术较为落后， 所产生物菌肥肥效稳定 性差， 特效菌株繁殖性能弱， 杂菌污染严重， 大大限制了该生物菌肥的大规模应用。 发明内容 0004 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷， 提供一种红椒根际促生菌液 体发酵的方法， 对PGPR菌株液态发酵条件进行优化， 提高产物中PGPR菌株的数量和活性物 质的产量； 更进一步地， 提供一种红椒根际促生菌液体发酵的方法， 得到其最适培养基和最 适培养条件， 能够用于PGPR生物菌肥的大规模开发。 0005 为解决上述技术问题， 本发明提供一种红椒根际促生菌液体发酵的方法， 包含以 下步骤： 0006 取红椒根际促生菌菌株接种至种子培养基中， 。
9、制成种子液； 将发酵培养液灭菌后 装入三角瓶中， 装样量为25-75ml， 发酵培养液中加入1-10的种子液， 在30-40恒温振 荡箱中培养24-72h后即得； 0007 所述发酵培养液包括碳源和氮源， pH值调节至5-7， 所述碳源包括葡萄糖、 木糖、 蔗 糖、 果糖、 甘露醇和乳糖中的一种或几种， 所述氮源包括蛋白胨、 酵母粉、 硝酸钾、 谷氨酸、 硫 酸铵、 硝酸铵中的一种或几种。 0008 所述红椒根际促生菌分离自淮安红椒根际。 0009 所述碳源为1(W/V)的蔗糖。 0010 所述氮源为1(W/V)的酵母粉。 0011 所述发酵培养液中加入的种子液中活菌含量大于108CFU/mL。
10、， 接种浓度为5。 0012 所述发酵培养液pH值为6， 装液量50ml， 接种后培养时间60h， 培养温度35。 0013 所述种子液的制备方法为： 将接种了红椒根际促生菌菌株的种子培养基在温度30 ， 转速150r/min的恒温振荡箱中培养60h。 说明书 1/6 页 3 CN 106754564 A 3 0014 所述种子培养基包括蛋白胨l0g， 酵母提取物5g， 氯化钠l0g， 琼脂20g， 蒸馏水 1000ml， pH7.0-7.2， 121灭菌20min。 0015 所述发酵培养液包括L-色氨酸100mg、 (NH4)2SO42g、 NaH2PO40.50g、 K2HPO40.50。
11、g、 MgSO40.20g、 CaCl20.10g、 蒸馏水1000mL。 0016 本发明所达到的有益效果： 0017 PGPR菌株培养过程中， 影响菌株生长和IAA代谢的主要因素有碳源、 氮源、 发酵时 间、 发酵温度、 pH值和通气量等， 本发明所提供的方法对碳源、 氮源、 发酵时间、 发酵温度、 pH 值和装液量进行了优化， 使PGPR菌株达到较高的生长量(OD600检测)， 和较高的IAA产量。 0018 进一步地， 对培养基和培养条件进行正交试验优化， 获得最适培养基和最适培养 基和最适培养条件， 使IAA产量达到最高， 以应用于PGPR生物菌肥的大规模开发。 0019 因此， 本。
12、发明所提供的一种红椒根际促生菌液体发酵的方法， 能够使PGPR菌株达 到较高的生长量和较高的IAA产量， 可用于PGPR生物菌肥的大规模开发。 附图说明 0020 图1不同碳源种类对菌株L-4生长和IAA产量的影响 0021 图2不同氮源种类对PGPR菌株生长和IAA产量的影响 0022 图3不同培养时间对菌株L-4生长和产LAA的影响 0023 图4不同培养温度对菌株生长和产LAA的影响 0024 图5不同初始pH对菌株生长和IAA产量的影响 0025 图6不同装液量对菌株L-4生长和IAA产量的影响 具体实施方式 0026 下面对本发明作进一步描述。 以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的。
13、技术方 案， 而不能以此来限制本发明的保护范围。 0027 实施例一 0028 1.实验材料 0029 红椒根际PGPR促生菌： 分离自淮安红椒根际， 江苏食品药品职业技术学院微生物 实验室分离、 筛选、 鉴定和保存； 3-吲哚乙酸： sigma公司， 其余化学试剂均为分析纯。 0030 种子培养基： 蛋白胨l0g， 酵母提取物5g， 氯化钠l0g， 琼脂20g， 蒸馏水1000ml， pH7 .0-7 .2， 121灭菌20min； 发酵培养液基础配方： L-色氨酸100mg、 (NH4)2SO42g、 NaH2PO40.50g、 K2HPO40.50g、 MgSO40.20g、 CaCl2。
14、0.10g、 蒸馏水1000mL。 0031 2实验方法 0032 2.1种子液制备 0033 将斜面保存的红椒根际PGPR促生菌菌株接种到种子培养基中， 在温度30， 转速 150r/min的恒温振荡箱中培养60h， 制成活菌含量大于108CFU/mL的种子液， 按5的接种量 接入不同条件下的发酵培养液中。 0034 2.2液体发酵 0035 在基础发酵培养液的基础上分别以1(W/V)的蔗糖替代培养基中的碳源， 其他成 分固定不变配制发酵培养液， 灭菌后将发酵培养液装入250mL三角瓶中(装液量100mL)， 加 说明书 2/6 页 4 CN 106754564 A 4 入5的种子液， 在温。
15、度30、 转速150r/min的恒温振荡箱中培养60h。 0036 实施例二 0037 按与实施例一相同的方法进行红椒根际促生菌液体发酵， 不同之处在于发酵培养 液的配制方法为： 在基础发酵培养液的基础上采用1(W/V)的酵母粉替代培养基中的氮 源。 0038 实施例三 0039 1.实验材料 0040 同实施例一 0041 2实验方法 0042 2.1种子液制备 0043 同实施例一 0044 2.2液体发酵 0045 在基础发酵培养液的基础上分别以1(W/V)的蔗糖替代培养基中的碳源， 1(W/ V)的酵母粉替代培养基中的氮源， 其他成分固定不变配制pH值5的发酵培养液， 灭菌后将 发酵培。
16、养液装入250mL三角瓶中(装液量25mL)， 加入1的种子液， 在温度30、 转速150r/ min的恒温振荡箱中培养24h。 0046 实施例四 0047 1.实验材料 0048 同实施例一 0049 2实验方法 0050 2.1种子液制备 0051 同实施例一 0052 2.2液体发酵 0053 在基础发酵培养液的基础上分别以1(W/V)的蔗糖替代培养基中的碳源， 1(W/ V)的酵母粉替代培养基中的氮源， 其他成分固定不变配制pH值6的发酵培养液， 灭菌后将 发酵培养液装入250mL三角瓶中(装液量50mL)， 加入5的种子液， 在温度35、 转速150r/ min的恒温振荡箱中培养6。
17、0h。 0054 实施例五 0055 1.实验材料 0056 同实施例一 0057 2实验方法 0058 2.1种子液制备 0059 同实施例一 0060 2.2液体发酵 0061 在基础发酵培养液的基础上分别以1(W/V)的蔗糖替代培养基中的碳源， 10 (W/V)的酵母粉替代培养基中的氮源， 其他成分固定不变配制pH值7的发酵培养液， 灭菌 后将发酵培养液装入250mL三角瓶中(装液量75mL)， 加入10的种子液， 在温度40、 转速 150r/min的恒温振荡箱中培养72h。 0062 指标测定： 说明书 3/6 页 5 CN 106754564 A 5 0063 PGPR菌株生长状况。
18、用OD600表示； IAA产量测定采用Salkowski比色法。 具体方法如 下： 菌悬液10000转/min离心l0min， 取上清液， 加入等体积Salkowski比色液， 避光静置 30min， 取出立即在530nm处测定吸光度， 根据IAA标准曲线计算IAA产量， 标准曲线采用3- IAA(3-吲哚乙酸)标准品绘制。 0064 指标测定结果： 0065 1.碳源种类对PGPR菌株生长和IAA产量的影响 0066 在基础发酵培养液的基础上分别加入1(W/V)的碳源(葡萄糖、 木糖、 蔗糖、 果糖、 甘露醇、 乳糖)， 加入5种子液在温度35、 转速150r/min的恒温振荡箱中培养60h。
19、后进行 OD600检测和IAA产量计算， 考察不同碳源对PGPR菌株生长和IAA产量的影响， 实验结果见图 1。 0067 如图1所示， 除木糖外， 其他5种C源均对PGPR菌体生长有促进作用， 效果最为明显 的是葡萄糖、 蔗糖和甘露醇， 果糖和乳糖对PGPR菌体生长有一定作用， 但效果不是非常明 显， 而木糖的添加基本对OD600无影响， 这说明PGPR促生菌对葡萄糖、 蔗糖和甘露醇的吸收利 用效果最好， 但基本不吸收木糖。 由图还可知， 蔗糖可以大大提高植物生长激素IAA的产量， 果糖和甘露醇次之， 木糖仍然效果不明显， 值得注意的是葡萄糖并没有大幅度提升IAA产 量， 这可能是因为高浓度。
20、的葡萄糖在反应终止时仍会大量残留， 而残留的葡萄糖则与IAA形 成无活性的糖基-IAA复合体， 降低了游离态IAA的产量。 综合考虑选择蔗糖为C源。 0068 2.氮源种类对PGPR菌株生长和IAA产量的影响 0069 在基础发酵培养液的基础上分别加入1(W/V)的氮源(蛋白胨、 酵母粉、 硝酸钾、 谷氨酸、 硫酸铵、 硝酸铵)， 加入5种子液在温度35、 转速150r/min的恒温振荡箱中培养 60h后进行OD600检测和IAA产量计算， 考察不同N源对PGPR菌株生长和IAA产量的影响， 实验 结果见图2。 0070 如图2所示， 蛋白胨、 酵母粉两种有机N源对PGPR菌体生长和植物生长激。
21、素IAA的产 生均有明显地促进作用； 硝酸钾同样能显著促进PGPR菌体的生长， 但却降低了IAA产量； 谷 氨酸、 硫酸铵对PGPR菌体生长增效不明显， 但硫酸铵增加了IAA产量， 而谷氨酸则降低了IAA 产量； 硝酸铵能较大幅度的提高IAA产量， 但却阻碍了PGPR菌体的生长。 综合考虑选择酵母 粉作为N源。 0071 3.培养时间对PGPR菌株生长和IAA产量的影响 0072 磷酸调节发酵培养液pH值为7， 灭菌后装入250mL三角瓶中(装液量100mL)， 加入 5的种子液， 在温度30、 转速150r/min的恒温振荡箱中培养， 分别在12h、 24h、 36h、 48h、 60h、 。
22、72h、 84h取样进行OD600检测和IAA产量计算， 考察培养时间对PGPR菌株生长和IAA产量 的影响， 实验结果见图3。 0073 如图3所示， 在0-24h内， PGPR细菌快速进入对数生长期， 24h后逐渐进入稳定期， 并 在48h后达到最高点， 当发酵时间超过60h时， OD600略有下降， 这说明PGPR细菌开始出现死 亡； 由图还可以看出， 在12-24h内有少量IAA产生， 且IAA产量变化不大， 当发酵时间超过24h 后， IAA产量快速增加， 这主要是因为IAA是PGPR的次级代谢产物， 只有在PGPR成熟稳定后才 能大量产生并积累； 当发酵时间超过60h后， IAA产。
23、量反而略有下降， 这主要是因为细胞死亡 导致的次生代谢产物降低和IAA降解酶将IAA分解产生的。 0074 4.培养温度对PGPR菌株生长和IAA产量的影响 说明书 4/6 页 6 CN 106754564 A 6 0075 磷酸调节发酵培养液pH值为7， 灭菌后装入250mL三角瓶中(装液量100mL)， 加入 5的种子液， 在转速150r/min， 温度分别为20、 25、 30、 35、 40、 45的恒温振荡 箱中培养24h后， 取样进行OD600检测和IAA产量计算， 考察培养温度对PGPR菌株生长和IAA产 量的影响， 实验结果见图4。 0076 如图4所示， 随着温度的不断增加，。
24、 OD600值和IAA产量均先快速增大， 后快速降低， 变化趋势基本一致， 并在35到达最大值。 这说明PGPR菌株的最适生长温度和最适次生代 谢温度均为30。 0077 5.pH值对PGPR菌株生长和IAA产量的影响 0078 磷酸调节发酵培养液pH值分别为4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、 10.0， 灭菌后装入 250mL三角瓶中(装液量100mL)， 加入5的种子液， 在温度35、 转速150r/min的恒温振荡 箱中培养24h后， 取样进行OD600检测和IAA产量计算， 考察pH值对PGPR菌株生长和IAA产量的 影响， 实验结果见图5。 0079 如图5所。
25、示， 在pH值为4和10时， PGPR菌体均不生长也不产生IAA， 这是因为PGPR为 中性微生物， 在强酸和强碱环境下均不能生长； 当溶液脱离强酸强碱环境后(pH在5-9范围 内)， PGPR菌体均能较好的生长， 这说明PGPR生长具有较宽的pH适应范围； 但pH值大于6以 后， IAA分泌量有所降低， 这说明PGPR积累IAA的最适pH值为5左右。 0080 6.装液量对PGPR菌株生长和IAA产量的影响 0081 磷酸调节发酵培养液pH值为5.0， 灭菌后分别取25ml、 50ml、 75ml、 100ml、 150ml装 入三角瓶中， 加入5的种子液， 在温度35、 转速150r/mi。
26、n的恒温振荡箱中培养24h后， 取 样进行OD600检测和IAA产量计算， 考察装液量对PGPR菌株生长和IAA产量的影响， 实验结果 见图6。 0082 如图6所示， 在氧气最为充足的三角瓶中(装液量25ml)， PGPR菌株生长量和IAA产 量并不是最大， 这说明过多的氧气并不适合PGPR菌株的生长量和IAA的产生， 这可能是因为 高浓度的氧气会对PGPR菌株产生抑制作用， 影响了菌体的分裂和次生产物的代谢； 当装液 量为50ml时， 菌体生长量和IAA产量最大； 当装液量大于50ml以后， 随着装液量的增多， 三角 瓶中PGPR细菌数不断增加， 而振荡培养过程中溶解氧气量逐渐减少， 菌体。
27、生长变慢和IAA产 量下降， 这可能是因为PGPR为严格好氧菌， IAA的合成是好氧代谢， 培养基中溶氧量的减少 将会影响菌株的生长和IAA产量能力13。 0083 7.最佳发酵条件的确定 0084 在前期单因素实验的基础上， 选取培养时间、 培养温度、 培养液pH值和装液量为因 素， 进行L9(43)正交试验， 以IAA产量为指标， 考察四因素对PGPR发酵效果的影响， 因素水平 见表1， 实验结果见表2。 0085 表1正交实验因素水平表 0086 说明书 5/6 页 7 CN 106754564 A 7 0087 表2正交实验结果与分析 0088 0089 由表2中R值可知， 各因素对P。
28、GPR发酵效果的影响次序为： DACB， 即装液量对 PGPR发酵效果的影响最大， 培养时间次之， 培养温度对PGPR发酵效果的影响最小。 由表2中 各水平对应的k值可知， 本实验的最佳组合A2B2C2D2， 即IAA产量最高时， 最佳发酵条件为条 件为： 培养时间60h、 培养温度35、 发酵液pH值6、 装液量50ml。 0090 结论 0091 1)在PGPR菌株培养过程中， 影响菌株生长和IAA代谢的主要因素有碳源、 氮源、 发 酵时间、 发酵温度、 pH值和通气量等， 可以通过改变发酵液的成份及培养条件来提高产物中 PGPR菌株的数量和活性物质的产量； 0092 2)以IAA产量为评。
29、价指标， 对红椒根际PGPR促生菌的发酵条件进行了优化， 结果表 明最佳发酵条件为： 培养时间60h、 培养温度35、 发酵液pH值6、 装液量50ml； 0093 3)各因素对IAA产量的影响顺序为： 装液量培养时间溶液pH培养温度。 0094 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员来说， 在不脱离本发明技术原理的前提下， 还可以做出若干改进和变形， 这些改进和变形 也应视为本发明的保护范围。 说明书 6/6 页 8 CN 106754564 A 8 图1 图2 说明书附图 1/3 页 9 CN 106754564 A 9 图3 图4 说明书附图 2/3 页 10 CN 106754564 A 10 图5 图6 说明书附图 3/3 页 11 CN 106754564 A 11 。