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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510902069.8 (22)申请日 2015.12.09 C12N 5/071(2010.01) (71)申请人 中国科学院大连化学物理研究所 地址 116023 辽宁省大连市中山路 457 号 (72)发明人 张丽华 随志刚 张玉奎 杨开广 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 马驰 (54) 发明名称 一种鹿茸组织细胞外基质的制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种从鹿茸组织中获得细胞外基 质材料的处理方法。将新采收鹿茸的外表面进行 清洗和消毒处理后， 将鹿茸横向切断， 得到截面积 为圆形。
2、的片状物。切取鹿茸片中部、 具有血管样 结构的组织块， 对其进行去细胞化处理。本发明 的优点为 ： 根据鹿茸组织中具有血管样空隙的特 点， 采用多种工作液清洗的方法， 能彻底去除鹿茸 组织中的细胞类成分， 获得细胞外基质成分。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 106854636 A 2017.06.16 CN 106854636 A 1/1 页 2 1.一种鹿茸组织细胞外基质的制备方法， 其特征在于 ： 1) 将新采收的鹿茸外表面用生理盐水清洁干净， 然后用 55 -85酒精消毒处理 ； 2) 将鹿。
3、茸横向截断， 切成圆形或椭圆形的切片， 切片的厚度为 0.5-5cm ； 3) 将切片置于 0-4生理盐水中浸泡， 5-30min 后取出， 换新的生理盐水再次浸泡， 共 重复 “浸泡 - 取出” 操作 2-8 次 ； 4) 将浸泡后的切片与工作液接触 2.5-2500min ； 去细胞化工作液为下述物质中的一种或二种以上的溶液 ： 表面活性剂中的十二烷基 磺酸钠， 去氧胆酸盐， NP-40， tween-20， tween-80， tritonX-100 或 charps ； 离子液体中的 1- 十二烷基 -3- 甲基咪唑卤化物， 1- 八烷基 -3- 乙基咪唑卤化物 ； 离液剂中的尿素或盐。
4、酸 胍， 溶液的浓度为 0.02-80 (g/L) ； 5) 去细胞化的组织块经过清洗液处理后， 获得细胞外基质材料。 2.按照权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 所述切片为切取鹿茸片中部、 具有血管结构的切片。 3.按照权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 清洗液为水或缓冲盐溶液， 缓冲盐溶液浓度为 5mM-5M 的氯化钠溶液、 磷酸缓冲溶液或 PBS溶液， 醋酸-醋酸钠缓冲溶液、 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液或甘氨酸-氢氧化钠缓冲溶 ； 溶剂中需添加抗菌素， 例如青霉素， 链霉素， 万古霉素， 两性霉素 B 等， 浓度为 1-20mg/ mL。 4.按照权利要求 1 所述的方法，。
5、 其特征在于 ： 去细胞化过程中使用的设备包括蠕动泵一台， 工作液瓶一个， 废液瓶一个， 2-20mL 样品 处理管一个 ； 样品处理管为一塑料管， 塑料管两端有螺口并配有带通孔的盖子， 盖子的通孔 处有可固定乳胶管的接头。 5.按照权利要求 4 所述的方法， 其特征在于 ： 去细胞化处理时， 先将鹿茸组织块置于样品处理管中， 保证组织块在管中不能随意移 动 ； 然后将两个盖子拧死， 两个盖子分别连接乳胶管 ； 一乳胶管通过蠕动泵从样品处理管 一端向管内泵入工作液， 工作液充满样品处理管， 并从另一端流出， 流出液经另一乳胶管收 集到废液瓶中。 6.按照权利要求 5 所述的方法， 其特征在于 。
6、： 工作液的体积为 50-5000mL， 流速为 2-20mL/min。 7.按照权利要求 5 所述的方法， 其特征在于 ： 清洗处理过程同去细胞化处理过程的操作， 清洗液体积为 50-5000mL， 流速为 2-20mL/ min。 8.按照权利要求 1 所述的方法， 其特征在于 ： 经过清洗的组织块， 能通过下述任一一种方法进行保存 ； 无菌条件下离心去除水分， 固体组织进行冷冻保存 ； 无菌条件下冷冻干燥后， 4 摄氏度 保存 ； 正常条件下冷冻干燥后， 放射性照射灭菌后保存。 权 利 要 求 书 CN 106854636 A 2 1/4 页 3 一种鹿茸组织细胞外基质的制备方法 技术领。
7、域 0001 本发明涉及用于鹿茸组织中细胞外基质类成分的获得。 具体地说是一种基于多种 工作液持续冲洗鹿茸组织， 以去除细胞类成分的清洗方法。 背景技术 0002 鹿茸作为哺乳动物唯一能够完整持续再生的器官， 在较短时时期内可以产生大量 的血管、 神经、 软骨等组织， 被认为是研究组织生长调节机制的理想模型。而鹿茸组织中的 细胞外基质为鹿茸的再生过程提供了至关重要的微环境。因此以鹿茸为样品， 提取获得其 细胞外基质组织， 能获得一种全新的生物材料， 用于组织工程、 干细胞培养、 再生模型建立 等方面的研究。 0003 鹿茸中存在大量的血管组织， 方向与鹿茸径向一致。这些血管中残留有大量的血 液。
8、。将鹿茸截断时， 血管也被截断， 此时血管成为两端开口的一段血管。这样， 在血管的一 端向血管内灌注溶液就能冲洗整个组织。因此利用鹿茸组织的这一特性， 能将利用多种洗 脱溶剂将鹿茸组织中的细胞成分去除彻底。 发明内容 0004 本发明的目的在于提供一种能彻底去除鹿茸中细胞类成分的清洗方法， 以期解制 备一种新型的基质材料用于生物学研究及应用。 0005 为实现上述目的， 本发明采用的技术方案为 ： 0006 将鹿茸切成厚度适宜的片状结构， 选取具有贯通血管结构的部分， 应用多种清洗 溶液进行冲洗， 以去除细胞类成分。 0007 具体为 ： 0008 1) 切片处理 0009 将新鲜采收的鹿茸外。
9、表面用生理盐水清洁干净后用 55 -85酒精消毒处理 ； 沿 横截面方向将鹿茸切成片状结构， 切取鹿茸片中部、 具有血管样结构的组织块， 对其进行去 细胞化处理。 0010 2) 去细胞化处理 0011 利用自制的装置， 将合适大小的鹿茸组织块置于两端开口的中空管中， 保证组织 块在管中不能随意移动。 然后将处理管两端的盖子拧死， 并连接乳胶管。 通过蠕动泵从其中 一侧向管内泵入工作液， 工作液充满塑料管， 并从另一端流出， 流出液收集到废液瓶中。处 理时先后采用三种溶液进行顺序冲洗， 直至样品中的细胞成分彻底去除。 0012 本发明的优点为 ： (1) 需要设备简单， 操作简便 ； (2) 。
10、可彻底去除鹿茸组织中的细 胞类成分。 0013 根据鹿茸组织中具有血管样空隙的特点， 采用多种工作液清洗的方法， 能彻底去 除鹿茸组织中的细胞类成分， 获得细胞外基质成分。 说 明 书 CN 106854636 A 3 2/4 页 4 附图说明 0014 图 1 为去细胞化处理前后鹿茸组织的对比 ； ( 左 ： 处理前， 右 ： 处理后 ) 0015 结果显示 ： 处理后， 鹿茸切片中的细胞类成分为被清除干净。 0016 图2为所得去细胞化细胞外基质及该基质接种细胞后的组织切片图 ； (左 ： 单纯的 去细胞化基质， 右 ： 去细胞化基质接种细胞后 ) 0017 结果显示 ： 处理得到的鹿茸基。
11、质中不含有细胞， 基质接种细胞后可见细胞贴附生 长。 具体实施方式 0018 将新鲜采收的鹿茸外表面用生理盐水清洁干净后用 75酒精消毒处理 ； 沿横截 面方向将鹿茸切成片状结构， 切取鹿茸片中部、 具有血管样结构的组织块， 对其进行去细胞 化处理。 利用自制的装置， 将合适大小的鹿茸组织块置于两端开口的中空管中， 保证组织块 在管中不能随意移动。然后将处理管两端的盖子拧死， 并连接乳胶管。通过蠕动泵从其中 一侧向管内泵入工作液， 工作液充满塑料管， 并从另一端流出， 流出液收集到废液瓶中。处 理时先后采用三种溶液进行顺序冲洗， 直至样品中的细胞成分彻底去除。 0019 应用例 1 0020 。
12、将新鲜采收的鹿茸外表面用生理盐水清洁干净后用 75酒精消毒处理 ； 沿横截 面方向将鹿茸切成厚度约为 2cm 的片状结构， 将鹿茸切中部的具有贯通血管样的组织结构 切取下来， 使之直径略大于处理管的内径。将合适大小的鹿茸组织块置于两端开口的中空 管中， 保证组织块在管中不能随意移动。然后将处理管两端的盖子拧死， 并连接乳胶管。通 过蠕动泵从其中一侧向管内泵入工作液， 工作液充满塑料管， 并从另一端流出， 流出液收集 到废液瓶中。处理时， 先用 1000mL 的 0.2 SDS 溶液进行冲洗 ； 之后换 1000mL 3M 盐酸胍 进行冲洗 ； 然后用 1000mL 1 tritonX100 进。
13、行冲洗 ； 最后采用纯水 ( 含抗生素 )200mL 进 行冲洗， 各种溶液的流速均为2mL/min。 将上述操作得到的鹿茸组织在无菌条件下进行冻干 处理， 然后置于 4 摄氏度进行保存。 0021 处理前后鹿茸切片对比如图 1 所示， 去细胞化细胞基质接种细胞前后的比较如图 2 所示。 0022 应用例 2 0023 将新鲜采收的鹿茸外表面用生理盐水清洁干净后用 65酒精消毒处理 ； 沿横截 面方向将鹿茸切成厚度约为 1.5cm 的片状结构， 将鹿茸切中部的具有贯通血管样的组织结 构切取下来， 使之直径略大于处理管的内径。将合适大小的鹿茸组织块置于两端开口的中 空管中， 保证组织块在管中不能。
14、随意移动。然后将处理管两端的盖子拧死， 并连接乳胶管。 通过蠕动泵从其中一侧向管内泵入工作液， 工作液充满塑料管， 并从另一端流出， 流出液收 集到废液瓶中。处理时， 先用 1000mL 的 2 SDS 溶液进行冲洗 ； 之后换纯水 100mL( 含抗生 素 ) 进行冲洗 ； 然后用 2000mL 1 tritonX100 进行冲洗 ； 最后采用纯水 2000mL( 含抗生 素)进行冲洗， 各种溶液的流速均为4mL/min。 将上述操作得到的鹿茸组织在无菌条件下进 行冻干处理， 然后置于 4 摄氏度进行保存。 0024 应用例 3 0025 将新鲜采收的鹿茸外表面用生理盐水清洁干净后用 75酒。
15、精消毒处理 ； 沿横截 说 明 书 CN 106854636 A 4 3/4 页 5 面方向将鹿茸切成厚度约为 1.0cm 的片状结构， 将鹿茸切中部的具有贯通血管样的组织结 构切取下来， 使之直径略大于处理管的内径。将合适大小的鹿茸组织块置于两端开口的中 空管中， 保证组织块在管中不能随意移动。然后将处理管两端的盖子拧死， 并连接乳胶管。 通过蠕动泵从其中一侧向管内泵入工作液， 工作液充满塑料管， 并从另一端流出， 流出液收 集到废液瓶中。处理时， 先用 1000mL 的 4M 尿素溶液进行冲洗 ； 之后换纯水 800mL( 含抗生 素)进行冲洗， 各种溶液的流速均为3mL/min。 将上述。
16、操作得到的鹿茸组织在无菌条件下进 行冻干处理， 然后置于 4 摄氏度进行保存。 0026 应用例 4 0027 将新鲜采收的鹿茸外表面用生理盐水清洁干净后用 95酒精消毒处理 ； 沿横截 面方向将鹿茸切成厚度约为 1.0cm 的片状结构， 将鹿茸切中部的具有贯通血管样的组织结 构切取下来， 使之直径略大于处理管的内径。将合适大小的鹿茸组织块置于两端开口的 中空管中， 保证组织块在管中不能随意移动。然后将处理管两端的盖子拧死， 并连接乳胶 管。通过蠕动泵从其中一侧向管内泵入工作液， 工作液充满塑料管， 并从另一端流出， 流 出液收集到废液瓶中。处理时， 先用 3000mL 的 4M 尿素溶液进行。
17、冲洗 ； 然后用 2000mL 1 tritonX100进行冲洗 ； 之后换纯水200mL(含抗生素)进行冲洗， 各种溶液的流速均为8mL/ min。将上述操作得到的鹿茸组织在无菌条件下进行冻干处理， 然后置于 4 摄氏度进行保 存。 0028 应用例 5 0029 将新鲜采收的鹿茸外表面用生理盐水清洁干净后用 75酒精消毒处理 ； 沿横截 面方向将鹿茸切成厚度约为 1.0cm 的片状结构， 将鹿茸切中部的具有贯通血管样的组织结 构切取下来， 使之直径略大于处理管的内径。将合适大小的鹿茸组织块置于两端开口的中 空管中， 保证组织块在管中不能随意移动。然后将处理管两端的盖子拧死， 并连接乳胶管。。
18、 通过蠕动泵从其中一侧向管内泵入工作液， 工作液充满塑料管， 并从另一端流出， 流出液收 集到废液瓶中。处理时， 先用 3000mL 的 4 chaps 溶液进行冲洗 ； 之后换纯水 200mL( 含抗 生素)进行冲洗， 各种溶液的流速均为8mL/min。 将上述操作得到的鹿茸组织在无菌条件下 进行冻干处理， 然后置于 4 摄氏度进行保存。 0030 应用例 6 0031 将新鲜采收的鹿茸外表面用生理盐水清洁干净后用 85酒精消毒处理 ； 沿横截 面方向将鹿茸切成厚度约为 1.0cm 的片状结构， 将鹿茸切中部的具有贯通血管样的组织结 构切取下来， 使之直径略大于处理管的内径。将合适大小的鹿茸。
19、组织块置于两端开口的中 空管中， 保证组织块在管中不能随意移动。然后将处理管两端的盖子拧死， 并连接乳胶管。 通过蠕动泵从其中一侧向管内泵入工作液， 工作液充满塑料管， 并从另一端流出， 流出液收 集到废液瓶中。处理时， 先用 3000mL 的 1 tween 80 盐酸胍溶液进行冲洗 ； 然后用 2000mL 2tritonX100进行冲洗 ； 之后换纯水2000mL(含抗生素)进行冲洗， 各种溶液的流速均为 8mL/min。将上述操作得到的鹿茸组织在无菌条件下进行冻干处理， 然后置于 4 摄氏度进行 保存。 0032 应用例 7 0033 将新鲜采收的鹿茸外表面用生理盐水清洁干净后用 75。
20、酒精消毒处理 ； 沿横截 面方向将鹿茸切成厚度约为 0.5cm 的片状结构， 将鹿茸切中部的具有贯通血管样的组织结 说 明 书 CN 106854636 A 5 4/4 页 6 构切取下来， 使之直径略大于处理管的内径。将合适大小的鹿茸组织块置于两端开口的中 空管中， 保证组织块在管中不能随意移动。然后将处理管两端的盖子拧死， 并连接乳胶管。 通过蠕动泵从其中一侧向管内泵入工作液， 工作液充满塑料管， 并从另一端流出， 流出液收 集到废液瓶中。处理时， 先用 3000mL 的 1氯化十二烷基 -3- 甲基咪唑溶液进行冲洗 ； 然 后用2000mL 6M尿素进行冲洗 ； 之后换纯水4000mL(含抗生素)进行冲洗， 各种溶液的流速 均为 12mL/min。将上述操作得到的鹿茸组织在无菌条件下进行冻干处理， 然后置于 4 摄氏 度进行保存。 说 明 书 CN 106854636 A 6 1/1 页 7 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 106854636 A 7 。