吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，7-二胺激酶抑制剂 发明领域
本发明涉及吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，7-二胺，它们抑制细胞周期蛋白依赖性丝氨酸/苏氨酸激酶和生长因子介导的酪氨酸激酶，因此可用于治疗细胞增殖疾病和障碍。
发明背景
相关领域概述
细胞周期激酶是天然存在的参与细胞周期调节的酶(Meijer L.″Chemical Inhibitors of Cyclin-Dependent Kinases，″Progressin Cell Cycle Research(细胞周期研究进展)，1995；1：351-363)。典型的酶包括丝氨酸/苏氨酸激酶，例如细胞周期蛋白依赖性激酶(cdk)cdk1、cdk2、cdk4、cdk5、cdk6，以及参与细胞周期调节的酪氨酸激酶。
已经显示这些激酶的活性增加或者活性或调节作用暂时异常会发展为人类肿瘤和其他增殖障碍。通过阻滞细胞周期蛋白与其激酶配偶体之间的相互作用或者通过结合并减活该激酶而抑制cdk的化合物导致细胞增殖的抑制，因而可用于治疗肿瘤或其他异常增殖的细胞。
已经证明若干抑制cdk的化合物具有临床前期抗肿瘤活性。例如，flavopiridol是一种类黄酮，已经显示它是若干类型乳腺癌与肺癌细胞的有力抑制剂(Kaur等，J.Natl Cancer Inst.(国立癌症研究所杂志)，1992：84：1736-1740；Int.J.Oncol.(国际肿瘤学杂志)，1996；9：1143-1168)。 已经显示该化合物抑制cdk2和cdk4。Olomoucine(2-(羟乙氨基)-6-苄胺-9-甲基嘌呤)是有力的cdk2和cdk5抑制剂(Vesely等，Eur.J.Biochem.(欧洲生物化学杂志)1994，224：771-786)，已经显示抑制国立癌症研究所(NCI)用于筛选新的癌症治疗药的大约60种不同的人肿瘤细胞系的增殖(Abraham等，Biology of the Cell.(细胞生物学)1995：83：105-120)。最近出现了purvalanol类cdk抑制剂，它是更有力的olomoucine衍生物(Gray N.S.等，Science.(科学)1998：281：533-538)。
酪氨酸激酶是生长因子信号转导传播所必需的，引起细胞周期的前进、细胞的增殖、分化和移行。酪氨酸激酶包括细胞表面生长因子受体酪氨酸激酶，例如FGFr和PDGFr，以及非受体酪氨酸激酶，包括c-Src和lck。已经证明这些酶地抑制导致抗肿瘤和抗血管生成活性(Hamby等，Pharmacol.Ther.(药理学与疗法)1999：82(2-3)：169-193)。
若干抑制cdk和生长因子介导激酶的吡啶并[2，3-d]嘧啶是已知的(WO 98/33798)。美国专利No.5,733,913和5,733,914描述了6-芳基-吡啶并[2，3-d]嘧啶。
尽管已经取得了一定进展，不过关于小分子量化合物的研究还在继续，这些化合物是口服可生物利用的，可用于治疗多种人类肿瘤和其他增殖障碍，包括再狭窄、血管生成、糖尿病性视网膜病、牛皮癣、手术粘连、黄斑变性和动脉粥样硬化。本发明提供这样的化合物、它们的药物制剂和它们在治疗增殖障碍中的用途。
发明概述
本发明提供新颖的吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，7-二胺化合物，它们充当细胞周期调节性激酶、例如细胞周期蛋白依赖性激酶以及生长因子介导的酪氨酸激酶的抑制剂。因而，这些化合物可用于治疗细胞增殖障碍，例如动脉粥样硬化和再狭窄；癌症；血管生成；病毒感染，包括DNA病毒，如疱疹，和RNA病毒，如HIV；真菌感染；I型糖尿病、糖尿病性神经病与视网膜病；多发性硬化；肾小球性肾炎；神经变性疾病，包括阿尔茨海默氏病；自体免疫疾病，例如牛皮癣、类风湿性关节炎和狼疮；器官移植排斥与宿主对移植物疾病；痛风；多囊性肾疾病；和炎症，包括炎性肠疾病。
因此，本发明提供具有式I一般结构的吡啶并[2，3-d]嘧啶其中：R2、R7、R13、R14和R15独立地是氢，或低级烷基、低级烯基或低级炔基，它们各自可选地被至多5个基团取 代，取代基独立地选自卤素、氰基、硝基、-R9、-NR9R10、-OR9、 -(CH2)nCO2R9、-(CH2)nSO2R11、-(CH2)nR11、-COR9、-CONR9R10、-SO3R9、 -SO2NR9R10、-SO2R9、-SR9、-PO3R9R10、-POR9R10、-PO(NR9R10)2、-NR9COR10、 -NR9CO2R10、-NR9CONR9R10、-NR9SO2R10，或杂环，可选地被至多3个基团取代，取代基独立地选自-R9、-NR9R10、 -OR9、-NR9COR10、-COR10、-(CH2)nSO2R11、-(CH2)nR11，或-(CH2)nR12，可选地被至多5个基团取代，取代基独立地选自卤素、氰 基、硝基、-R9、-NR9R10、-OR9、-(CH2)nCO2R9、-(CH2)nSO2R11、-(CH2)nR11、 -COR9、-CONR9R10、-SO3R9、-SO2NR9R10、-SO2R9、-SR9、-PO3R9R10、-POR9R10、 -PO(NR9R10)2、-NR9COR10、-NR9CO2R10、-NR9CONR9R10、-NR9SO2R10，或杂环，可选地被至多3个基团取代，取代基独立地选自-R9、-NR9R10、
-OR9、-NR9COR10、-COR10、-(CH2)nSO2R11、-(CH2)nR11；R5是卤素、氰基、硝基、-R9、-NR9R10或-OR9；R6是卤素、氰基、硝基、-R9、-NR9R10、-OR9、-CO2R9、-COR9、-CONR9R10、
-NR9COR10、-SO2NR9R10、-SO2R9、-SO3R9、-SR9、-PO3R9R10、-POR9R10、
-PO(NR9R10)2，或低级烯基或低级炔基，可选地被-R9取代；R8是H、-CO2R13、-COR13、-CONR13R14、-CSNR13R14、-C(NR13)NR14R15、-SO3R13、 -SO2R13、-SO2NR13R14、-PO3R13R14、-POR13R14、-PO(NR13R14)2；R9和R10独立地是氢，或低级烷基，可选地被至多3个基团取代，取代基选自由卤素、氨基、 一或二烷基烷基、羟基、低级烷氧基、苯基或取代的苯基组成的组，或者R9和R10与它们所连接的氮一起构成具有3-7个成员的环，其中至多四个可以选自O、S和NR20，其中R20是氢、低级烷基或-CO 低级烷基；R11是杂芳基或杂环基；R12是环烷基、杂环基、芳基或杂芳基；n是0、1、2或3；及其药学上可接受的盐、酯、酰胺和前体药物。本发明还提供组合物，包含式I化合物以及药学上可接受的载体、稀 释剂或赋形剂。本发明还提供用于抑制细胞周期蛋白依赖性激酶和生长因子介导激酶 的方法。本发明还提供治疗患有由细胞增殖导致疾病的受治疗者的方法。该方 法包含通过将治疗有效量的式I化合物对需要治疗的受治疗者给 药，抑制上皮来源的致瘤细胞增殖和血管平滑肌增殖和/或细胞移 行。本发明还提供治疗患有由DNA肿瘤病毒、例如疱疹病毒导致疾病的受 治疗者的方法，包含将式I化合物给药。
发明的详细说明由本发明所涵盖的化合物是由上述通式I所描述的那些，及其药学上 可接受的盐、酯、酰胺和前体药物。除了式I化合物以外，本发明还提供优选的式II化合物： 其中R5、R6、R7和R8是如式I所定义的，R16、R17和R18是如上关于(CH2)nR12取代基所定义的，优选地独立地是氢、 卤素、氨基、一或二烷基氨基、羟基、低级烷基、低级烷氧基、氰基、 硝基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、一或二烷基氨基羰基、烷基羰基、 -SO3R9、-SO2NR9R10、-SO2R9、-SR9、-PO3R9R10、-POR9R10、-PO(NR9R10)2、 -NR9COR10、-NR9CO2R10、-NR9CONR9R10、-NR9SO2R10；或者R16是含有3-7个成员的碳环基，其中至多2个成员是选自氧和氮的杂原 子，其中该碳环基是未取代的或者被1、2或3个如上所定义的基团取 代，但是优选地独立地选自由卤素、羟基、低级烷基、三氟甲基、低 级烷氧基、氨基、一或二烷基氨基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷 基、杂芳磺酰基、杂芳磺酰烷基、杂环烷基、杂环磺酰基或杂环磺酰 烷基组成的组。
优选的式II化合物是，其中R5是氢或低级烷基；R6是氢、低级烷 基、氰基或卤素；R17和R18独立地是氢、卤素、氨基、一或二烷基氨基、 羟基、低级烷基、低级烷氧基、氨基羰基、一或二烷基氨基羰基、 -SO2NR9R10或-NR9COR10；R16是可选被取代的N-哌啶、N-哌嗪或N-吡咯 烷，例如其中环取代基选自-R9、-NR9R10、-OR9、NR9COR10和COR10。
另外，本发明还提供优选的式III化合物： 其中R2、R5和R6是如式I所定义的；以及 R19是氢，或低级烷基、低级烯基或低级炔基，它们各自可选地被至多5个基团取代， 取代基独立地选自卤素、氨基、一或二烷基氨基、羟基、低级烷氧基、 氰基、硝基、羧基、羧基烷基、氨基羰基、一或二烷基氨基羰基、低 级烷基羰基、-SO3R9、-SO2NR9R10、-SO2R9、-SR9、-PO3R9R10、-POR9R10、 -PO(NR9R10)2、-NR9COR10、-NR9CO2R10、-NR9CONR9R10、-NR9SO2R10，其中 R9和R10是如上所定义的，或芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环烷基或环烷基-烷基，其中每个芳 基、杂芳基或环烷基可选地被至多5个基团取代，取代基独立地选自 卤素、氨基、一或二烷基氨基、羟基、低级烷氧基、氰基、硝基、羧 基、羧基烷基、氨基羰基、一或二烷基氨基羰基、烷基羰基、-SO3R9、 -SO2NR9R10、-SO2R9、-SR9、-PO3R9R10、-POR9R10、-PO(NR9R10)2、-NR9COR10、 -NR9CO2R10、-NR9CONR9R10、-NR9SO2R10，或(CH2)n-含有3-7个成员的碳环基，其中至多2个成员是选自氧和氮的杂 原子，其中该碳环基是未取代的或者被1、2或3个独立地选自由卤素、 羟基、低级烷基、三氟甲基、低级烷氧基、氨基、一或二烷基氨基、 芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、杂芳磺酰基、杂芳磺酰烷基、杂 环烷基、杂环磺酰基或杂环磺酰烷基组成的组的基团取代；R21是氢、低级烷基或被苯基或取代的苯基取代的低级烷基。
优选的式III化合物是，其中R5是氢或低级烷基，R6是氢或卤素， R2是可选被取代的苯基，R21是氢或甲基，R19是可选被取代的低级烷基、 环烷基或(CH2)n-碳环基。
一组尤其优选的吡啶并[2，3-d]嘧啶是式IV：其中R5、R6、R16、R17、R18、R19和R21是如上所定义的。优选的式IV化合物是其中R21是氢或甲基的那些。
另一组尤其优选的本发明化合物是式V：其中R5、R6、R16、R17、R18、R19和R21是如上所定义的。优选的式V化合物是其中R21是氢或甲基的那些。
最优选的本发明化合物具有式VI其中R5、R6、R17和R18是如上所定义的，R22和R23独立地是氢或烷基。
本发明中的“烷基”、“低级烷基”和“(C1-C10)烷基”表示具有1至10个碳原子的直链或支链烷基，优选为C1-C6烷基。通常，烷基包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、2-戊基、异戊基、新戊基、己基、2-己基、3-己基、癸基、辛基和3-甲基戊基。这些基团例如可以被卤素、C1-C3烷基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、羟基、烷氧基等取代。实例包括氯甲基、2-氨基-乙基和3-二甲基-氨基丙基。
“烯基”、“低级烯基”和“(C2-C10)-烯基”表示具有1至10个碳原子和1或2条不相邻双键的直链或支链烷基。烯基的实例包括但不限于3-丁烯基和1-甲基-3-戊烯基。
“炔基”、“低级炔基”和“(C2-C10)-炔基”表示具有1至10个碳原子和一条叁键的直链或支链烷基。典型的炔基包括2-丙炔基和1，1-二甲基-3-丁炔基。取代的烯基和炔基包括4，4-二溴-2-戊烯基和3-氨基-5-己炔基。
本发明中的“烷氧基”、“低级烷氧基”或“(C1-C10)烷氧基”表示具有1至10个碳原子的直链或支链烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、2-戊基、异戊氧基、新戊氧基、己氧基、2-己氧基、3-己氧基和3-甲基戊氧基。
术语“烷酰基”表示通过羰基部分键合的烷基。实例包括乙酰基和戊酰基。“氨基烷酰基”表示被氨基取代的烷基。实例包括氨基乙酰基和3-氨基己酰基。“烷基氨基烷酰基”表示其中胺被C1-C10烷基取代的氨基烷酰基，包括甲氨基乙酰基和4-(异丁氨基)-辛酰基。“二烷基氨基烷酰基”表示N，N-二取代的氨基烷酰基，例如二异丙氨基乙酰基。
本发明中的卤素表示氟、氯、溴和碘。
术语“芳基”表示未取代的芳族碳环，具有单一的环(例如苯基)、多个环(例如联苯)或多个稠合的环，其中至少一个是芳族的(例如1，2，3，4-四氢萘基、萘基、蒽基或菲基)。术语“取代的芳基”表示被1至4个取代基取代的芳基，取代基选自烷基、O-烷基与S-烷基、-OH、-SH、-CN、卤素、1，3-二氧戊环基、-CF3、-NO2、-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NHCO-烷基、-(CH2)mCO2H、-(CH2)mCO2-烷基、-(CH2)mSO3H、-NH烷基、-N(烷基)2、-(CH2)mPO3H2、-(CH2)mPO3(烷基)2、-(CH2)mSO2NH2和-(CH2)mSO2NH-烷基，其中烷基是如上所定义的，m是0、1、2或3。取代的芳基的一些实例是甲基苯基、异丙氧基苯基、氯苯基、2-溴-3-三氟甲基-4-硝基-5-氨基苯基、4-溴联苯、3-乙酰氨基萘基、3-二甲氨基蒽基、3，4-二甲氧基菲基和2，8-二溴亚联苯-1-基。
“杂芳基”表示一种或多种5-、6-或7-元芳族环系，含有至少1个至多4个选自氮、氧或硫的杂原子。这类杂芳基例如包括噻吩基、呋喃、噻唑基、咪唑基、(异)噁唑基、四唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡唑基、(异)喹啉基、萘啶基、苯邻二甲酰亚胺基、苯并咪唑基、苯并噁唑基。“取代的杂芳基”可以被1、2、3或4个如上关于“取代的芳基”所提到的基团取代，例如2，3，4，6-四氯吡啶基和2-甲氧基-3-三氟甲基噻吩-4-基。
术语“杂环基”表示具有5-、6-或7-个环原子的非芳族环，其中1至4个选自氮、氧或硫。杂环基的实例包括吗啉代基、哌啶子基、哌嗪基、吡咯烷基和四氢噻吩基。这类基团可以被与上面关于取代的杂芳基所述相同的基团取代。
“碳环基”或“环烷基”是具有3-至7-个环碳成员的非芳族环系或稠合的环。实例包括环丙基、环丁基和环庚基。这些环可以被一个或多个如上关于芳基所提到的取代基取代，例如烷基、卤素、氨基、羟基和烷氧基。典型的取代的碳环基包括2-氯环丙基、2，3-二乙氧基环戊基和2，2，4，4-四氟环己基。碳环基可以含有1或2个选自氧、硫和氮的杂原子，这类环系被称为“杂环基”或“杂环”。实例包括哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、吡喃基、四氢呋喃基和二噁烷基。这些杂环基可以被至多4个关于芳基所提到的取代基取代，例如得到3，5-二甲基哌嗪-1-基、3，3-二乙基哌嗪-1-基、3，3，4，4-四甲基吡咯烷基、3-氯-2-二噁烷基和3，5-二羟基吗啉代基。它们还可以携带酮基，例如3-酮基哌啶基。
术语“癌症”包括但不限于下列肿瘤类型：乳腺、卵巢、子宫颈、前列腺、睾丸、食管、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、胃、皮肤、角化棘皮瘤、肺、表皮样癌、大细胞癌、腺癌、骨、结肠、腺瘤、胰腺、甲状腺、滤泡癌、未分化的癌、乳头状癌、精原细胞瘤、黑瘤、肉瘤、膀胱癌、肝癌与胆道、肾癌、骨髓样障碍、淋巴样障碍、何杰金氏、毛发细胞癌、颊腔与咽(口)癌症、唇、舌、口、咽、小肠、结肠、直肠、大肠、脑与中枢神经系统和白血病。
式I至VI化合物可以存在药学上可接受的盐、酯、酰胺和前体药物。本文所用的术语“药学上可接受的盐、酯、酰胺和前体药物”指的是本发明化合物的羧酸盐、氨基酸加成盐、酯、酰胺和前体药物，它们在可靠的医学判断范围内适合用于与患者组织接触，不会引起毒性、刺激作用、变态反应等，与合理的利益/风险比是相称的，对它们的预期用途来说是有效的，以及本发明化合物可能的两性离子形式。术语“盐”指的是上式化合物的相对无毒的无机与有机酸加成盐和碱盐。这些盐可以在最终的化合物分离与纯化期间就地制备，或者这样制备，单独使纯化化合物的游离碱形式例如与适合的有机或无机酸反应，再分离所生成的盐。代表性的盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘甲酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐和月桂基磺酸盐等。若上式化合物具有一个或多个酸性基团，则它可以通过与碱的反应生成盐。这些盐可以包括基于碱金属与碱土金属的阳离子，例如钠、锂、钾、钙、镁等，以及无机碱，例如铵、季铵和其他胺阳离子，包括四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。药学上可接受的盐是医药化学领域技术人员熟知的(例如参见Berge S.M.等，″Pharmaceutical Salts.″J Pharm.Sci.(药物科学杂志)，1977：66：1-19，引用在此作为参考文献)。
本发明化合物的药学上可接受的无毒的酯的实例包括C1-C6烷基酯，其中烷基是取代或未取代的直链或支链烃。酯还包括C5-C7环烷基酯以及芳烷基酯，例如苄基和三苯甲基。C1-C4烷基酯是优选的，例如甲基、乙基、2，2，2-三氯乙基和叔丁基。本发明化合物的酯可以按照常规方法制备，例如通过酸与醇的反应。
本发明化合物的药学上可接受的酰胺的实例包括从氨、C1-C6烷基伯胺和C1-C6二烷基仲胺衍生的酰胺，其中烷基是直链或支链的。在仲胺的情况下，胺还可以是含有1个氮原子的5-或6-元杂环的形式。从氨、C1-C3烷基伯胺和C1-C2二烷基仲胺衍生的酰胺是优选的。本发明化合物的酰胺可以按照医药化学技术人员熟知的常规方法制备。
术语“前体药物”指的是体内迅速转化为上式母体化合物的化合物，例如在血液或胃液中水解。前体药物的详尽讨论参见Higuchi T.和Stella V.，″Pro-drugs as Novel Delivery Systems，″Vol.14，A.C.S.Symposium Series和Bioreversible Carriers in Drug Design，ed.Edward B.Roche，American Pharmaceutical Association and PergamonPress，1987，二者均引用在此作为参考文献。
本发明的代表性化合物如下表1所示。 表1 表1(续) 表1(续) 表1(续) 表1(续)
由式I涵盖的本发明的代表性化合物包括但不限于表1中的化合物及其药学上可接受的酸或碱加成盐、酯或酰胺类似物和前体药物。
本发明化合物可以存在未溶剂化形式以及溶剂化形式，包括水合形式。一般来说，包括水合形式在内的溶剂化形式等价于未溶剂化形式，也打算为本发明范围所涵盖。
有些式I化合物具有一个或多个手性中心，因而可以存在单独的立体异构体及其混合物。其他化合物可以存在一种以上的几何异构型。本发明包括所有旋光与几何异构体和形式及其混合物。本发明化合物的外消旋混合物容易通过惯用方法拆分为单独的异构体，例如色谱法、分步结晶法和经典的拆分法，使用旋光活性的酸和盐。单独的异构体还可以通过手性合成制备，包括手性氢解等，使用商业上可得到的手性催化剂。
本发明化合物可用于治疗癌症(例如白血病和肺、乳腺、前列腺和皮肤癌症，例如黑瘤)和其他增殖疾病，包括但不限于牛皮癣、HSV、HIV、再狭窄和动脉粥样硬化。为了利用本发明化合物治疗癌症，对癌症患者给以治疗有效量的药学上可接受的组合物，其中包含本发明化合物。
进一步的发明实施方式是治疗患有由血管平滑肌细胞增殖导致的疾病的患者的方法。本发明范围内的化合物有效地抑制血管平滑肌细胞增殖和移行。该方法需要通过将有效量的式I至VI化合物对需要治疗的受治疗者给药，抑制血管平滑肌增殖和/或移行。本文所用的“受治疗者”和“患者”是哺乳动物，例如人，但是也包括马、牛、羊和伴侣动物，例如狗和猫。
本发明化合物可以配制成多种口服与肠胃外剂型给药，包括透皮和直肠给药。将被本领域技术人员所承认的是，下列剂型可以包含式I化合物或相应式I化合物的药学上可接受的盐或溶剂化物作为活性组分。
进一步的发明实施方式是药物组合物，包含式I至VI化合物以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。关于制备含有本发明化合物的药物组合物，药学上可接受的载体既可以是固体，也可以是液体。固体制剂包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和可分散的颗粒剂。固体载体可以是一种或多种物质，它们还可以充当稀释剂、矫味剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料。
在粉剂中，载体是微细粉碎的固体，例如滑石或淀粉，它与微细粉碎的活性组分形成混合物。在片剂中，将活性组分与具有必要粘合性质的载体按适合比例混合，压制成所需形状和大小。
本发明的制剂优选地含有约5％至约70％或以上的活性化合物。适合的载体包括碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄蓍胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可脂等。优选的口用剂型是胶囊剂，包括活性化合物与包封材料的制剂，后者作为载体提供这样一种胶囊，其中活性组分以及或者没有其他载体被该载体所包围，因而与之缔合。类似地，包括扁囊剂和锭剂。可以利用片剂、粉剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂作为适合口服给药的固体剂型。
关于制备栓剂，首先熔化低熔点蜡，例如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物，通过搅拌将活性组分均匀分散其中。然后将熔化后的均匀混合物倒在适宜大小的模具内，冷却，从而固化。
液体制剂包括溶液、悬液和乳剂，例如水或水/丙二醇溶液。关于肠胃外注射，可以将液体制剂配制成在聚乙二醇水溶液、等渗盐水、5％葡萄糖水溶液等的溶液中。适合口用的水溶液可以这样制备，将活性组分溶于水，根据需要加入适合的着色剂、矫味剂、稳定剂和增稠剂。适合口用的水悬液可以这样制备，将微细粉碎的活性组分分散在水中，与粘性材料混合，例如天然或合成的树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或其他熟知的悬浮剂。
还包括这样的固体制剂，它们趋于在使用前不久转化为用于口服给药的液体制剂。这类液体剂型包括溶液、悬液和乳剂。这些制剂除了活性组分以外，还可以含有着色剂、矫味剂、稳定剂、缓冲剂、人工与天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。可以利用蜡、聚合物、微粒等制备缓释剂型。而且，可以采用渗透泵在长时间内均匀释放活性化合物。
本发明的药物制剂优选为单位剂型。在这类剂型中，制剂被细分为含有适量活性组分的单位剂量。单位剂型可以是带包装的制剂，包装含有不连续量的制剂，例如片剂、胶囊剂和包装在小瓶或安瓿内的粉剂。而且，单位剂型可以是胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭剂本身，或者它可以是适当数量的任意这些包装的形式。
式I化合物的治疗有效剂量一般将从约1至约100mg/kg体重每天。典型的成人剂量将从约50至约800mg每天。根据活性组分的特定应用和效力，活性组分在单位剂量制剂中的量可以从约0.1至约500mg不等，优选为约0.5至100mg。如果需要的话，组合物还可以含有其他相容性治疗剂。对需要式I化合物治疗的受治疗者给以约1至约500mg每天的剂量，在24小时内分单次或多次给药。
本发明化合物能够与具有磷酸化其他蛋白质能力的蛋白质结合，并抑制其活性，例如cdks、PDGFr、FGFr、c-Src和EGFr。cdks与细胞周期蛋白生成配合物，这些配合物磷酸化允许细胞经过细胞周期的关键蛋白质(Meijer L.，Progress in Cell Cycle Research(细胞周期研究进展)，1995：1：351-363)。本发明化合物抑制这种磷酸化作用，因此能够作为抗增殖剂用于治疗癌症和/或再狭窄和其他增殖疾病。
由于它们对cdks和其他激酶的抑制活性，本发明化合物还是有用的研究工具，用于体外和体内研究这些激酶的作用机理。
本发明化合物的制备和用途进一步描述在下列详细的实施例中。实施例打算阐述特定的发明实施方式，决不打算限制说明书或权利要求书的范围。本发明化合物是利用商业上可得到的原料和试剂通过有机化学领域技术人员熟知的合成方法加以制备的。
可能需要在本发明化合物的合成期间衍生经历反应的分子中的反应性官能团，以避免所不希望的副反应。通常将诸如羟基、氨基和酸基等官能团用适合的基团保护起来，在需要时容易除去。常用保护基团的用途充分描述在Green和Wuts的Protective Groups in OrganicSnthesis，John Wiley and Sons，New York，New York(2nd Edition.1991)中。典型的羟基保护基团包括成醚基团，例如苄基，和芳基，例如叔丁氧羰基(Boc)、甲酰基和乙酰基。氨基保护基团包括苄基，芳基，例如乙酰基，和三烷基甲硅烷基。羧酸基通常是通过转化为容易水解的酯加以保护的，例如三氯乙基、叔丁基、苄基等。
如上所述，有些本发明化合物具有一个或多个手性中心，因而能够存在单独的旋光异构体和几何异构体及其混合物。例如，化合物106具有两个不对称中心，并且具有顺式构型。本发明包括所有这样的几何异构体、对映异构体和RS外消旋体以及手性化合物的单独的R或S异构体。所有单独的异构体及其混合物都包括在本发明中。单独的异构体容易通过手性合成加以制备，或者通过本领域技术人员熟知的常规拆分技术加以制备。
本发明化合物的制备阐述在流程1-4中。化合物I(实施例15)的合成描绘在流程1中；不过应当承认的是，通用流程可应用于所有本发明化合物。流程中所示每个步骤进一步阐述在下列详细的实施例中。
流程1中，使2-甲硫基-4-卤代-5-烷氧羰基嘧啶与氢氧化铵反应，得到相应的4-氨基衍生物。通过与LiAlH4反应还原该酯，得到5-羟甲基类似物，继而氧化为5-甲酰基衍生物。将5-甲酰基转化为不饱和基团(丙烯酸酯)，后者环化生成吡啶并[2，3-d]嘧啶。将吡啶并嘧啶转化为关键的中间体，也就是2-甲硫基吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺，后者容易氧化得到2-甲亚磺酰基类似物。通过与胺R2NH2的反应容易置换2-甲亚磺酰基，得到本发明式I化合物。通过与异氰酸酯，例如R19N＝C＝O的反应，吡啶并嘧啶环上的7-氨基容易转化为脲。 流程1
流程1所示反应物具有下列含义：
(a)NH3；(b)LAH；(c)MnO2；(d)Ph3PCHCO2Et；(e)DBU；(f)POCl3；(g)NH3；(h)(±)-反式-2-(苯磺酰基)-3-苯基氧氮杂环丙烷；(i)4-(4-Boc-哌啶)苯胺；(j)NaH.叔丁基异氰酸酯；(k)HCl
流程2阐述在7-位具有脲官能团的吡啶并嘧啶的替代合成。这类脲在流程1中是通过异氰酸酯与7-氨基吡啶并嘧啶的反应制备的，而流程2利用羰基二咪唑，得到中间体咪唑化物。咪唑化物容易与胺R19NH2反应，得到相应的脲。流程2通过显示化合物51的合成来阐述该方法，并且更充分地描述在实施例32中。
流程2
条件：(a)NaH.羰基二咪唑；(b)环戊胺；(c)HCl
式I化合物也可以按照流程3制备，其中描绘了化合物4的合成(实施例45)。使4-氨基-2-甲硫基嘧啶-5-甲醛与溴化甲基镁反应，得到相应的5-(2-羟基乙基)-嘧啶。醇被氧化得到甲基酮类似物。使甲基酮与氰甲基膦酸二乙酯反应，环化为5-甲基-7-氨基吡啶并嘧啶。进一步如流程1或2反应，得到本发明化合物，例如化合物4。
流程3
条件：(a)MeMgBr；(b)MnO2；(c)(EtO)2P(O)CH2CN
式I化合物还可以按照流程4制备，其中描绘了化合物12(实施例40)的合成。该流程中，嘧啶的2-甲硫基首先氧化为相应的甲亚磺酰基类似物。通过与胺R2NH2反应置换甲亚磺酰基。然后如流程1衍生化5-甲醛，环化得到相应的2-(R2NH)取代的7-氨基吡啶并嘧啶。将7-氨基如流程1-3所述丙烯酸化或其他衍生化。 流程4
条件：(a)(±)-反式-2-(苯磺酰基)-3-苯基氧氮杂环丙烷(oxaziridine)；(b)4-(4-Boc-哌啶)-苯胺；(c)(EtO)2P(O)CH2CN
任意本发明的式I-VI化合物可以按照流程1-4制备，其中分别阐述了化合物1、51、4和12的合成。有机化学领域技术人员将会认识到，原料可以是不同的，并且可以采用另外的步骤制备为本发明所涵盖的化合物，正如下列具体实施例所证明的。
公开在本申请中的所有文章和参考文献、包括专利都引用在此作为参考文献。
下列详细的实施例进一步阐述发明，它们不被解释为在范围或精神上将发明限制于其中所描述的具体程序。原料和各种中间体可以从商业来源获得、从商业上可得到的有机化合物制备或者利用熟知的合成方法制备。
实施例1
4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-羧酸乙酯
向室温的4-氯-2-甲硫基-嘧啶-5-羧酸乙酯(15.0g，65mmol)的200mL四氢呋喃溶液中加入25mL三乙胺，然后加入35mL氢氧化铵水溶液。在室温下搅拌1.5小时后，加入另外30mL氢氧化铵水溶液，继续搅拌1小时。将反应混合物在真空中浓缩，在乙酸乙酯与饱和碳酸氢钠水溶液之间分配。将有机层用盐水洗涤，经硫酸镁干燥，过滤，在真空中浓缩。加入乙酸乙酯和己烷，过滤收集所得固体，得到10.84g(79％)4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-羧酸乙酯。
实施例2
(4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-基)-甲醇
将4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-羧酸乙酯(13.36g，63mmol)的250mL四氢呋喃溶液滴加到室温的氢化锂铝(3.82g 100mmol)的250mL四氢呋喃悬液中。30分钟后，将反应冷却至0℃，加入异丙醇，直至冒泡减少。将反应用15mL水、15mL 15％NaOH和50mL水猝灭，将混合物搅拌1小时。过滤除去白色沉淀，用乙酸乙酯洗涤。将滤液在真空中浓缩，加入3∶1己烷∶乙酸乙酯。收集固体，用3∶1己烷∶乙酸乙酯洗涤，然后用己烷洗涤。将固体溶于乙酸乙酯，溶液经硫酸镁干燥。过滤然后在真空中浓缩，得到8.14g(76％)(4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-基)-甲醇。
分析计算值 C6H9N3OS：
C，42.09；H，5.30；N，24.54.
实测值：C，42.31；H，5.24；N，24.27.
实施例34-氨基-3-甲硫基-嘧啶-5-甲醛
向(4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-基)-甲醇(8.14g，48mmol)的1L氯仿溶液中加入氧化锰(33.13g，381mmol)。将悬液在室温下搅拌过夜，然后通过C盐过滤，用300mL氯仿洗涤。在真空中浓缩滤液，得到8.14g(定量收率)4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-甲醛。mp185-187℃。文献mp＝183-184℃，JOC，1958：23：1738.
分析计算值 C6H7N3OS：
C，42.59；H，4.17；N，24.83.
实测值：C，42.84；H，4.21；N，24.73.
实施例4
3-(4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-基)丙烯酸乙酯
向室温的4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-甲醛(4.08g，24.14mmol)的100mL四氢呋喃溶液中加入(乙酯基亚甲基)三苯基正膦(10.80g，31mmol)。将反应混合物在回流下加热3小时，然后在室温下搅拌过夜。在真空中浓缩反应混合物，残余物经过快速色谱纯化，用1∶1乙酸乙酯∶己烷洗脱，得到4.30g(75％)3-(4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-基)丙烯酸乙酯；mp在108℃下软化。
分析计算值 C10H13N3O2S：
C，50.19；H，5.48；N，17.56
实测值：C，50.22；H，5.45；N，17.24
实施例5
2-甲硫基-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮
向室温的3-(4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-基)丙烯酸乙酯(368mg，1.53mmol)的3mL N，N-二异丙基乙胺溶液中加入380μL 1，8-二氮杂二环并[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在回流下加热3小时，然后冷却至室温，浓缩。残余物经过快速色谱纯化，用乙酸乙酯洗脱。在真空中部分浓缩含有产物的部分，过滤除去固体，得到134mg(45％)2-甲硫基-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮，mp 269-271℃。
分析计算值 C8H7N3OS：
C，49.73；H，3.65；N，21.75.
实测值：C，49.67；H，3.46；N，21.49.
实施例6
7-氯-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶
将1.0g(5.2mmol)2-甲硫基-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(实施例5)的10mL三氯氧化磷悬液在回流下加热1小时。将所得溶液冷却，浓缩，得到固体，用冷水研制，过滤，得到1.05g粗产物。从乙腈中重结晶，得到0.76g(69％)产物，mp 201-203℃。
MS(APCI)M+1：计算值212.0；实测值212.0.
分析计算值 C8H6Cl1S1N3：
C，45.39；H，2.86；N，19.85.
实测值：C，45.53；H，2.90；N，19.74.
实施例7
2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺
将用氨饱和的2.95g(13.9mmol)7-氯-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶(实施例6)的200mL异丙醇悬液密封，在40℃下加热65小时。将悬液再次用氨饱和，在40℃下加热另外18小时。过滤收集固体，用水研制，得到1.98g(74.2％)产物，mp＞250℃。
MS(APCI)M+1：计算值193.1；实测值193.0.
分析计算值 C8H8N4S1：
C，49.98；H，4.19；N，29.14.
实测值：C，50.14；H，4.22；N，29.04.
实施例8
2-甲亚磺酰基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺
将10.63g(55.3mmol)2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺(实施例7)的300mL二氯甲烷与300mL甲醇悬液用18.06g(69.1mmol)(±)-反式-2-(苯磺酰基)-3-苯基氧氮杂环丙烷处理，搅拌过夜。将悬液过滤，以除去少量固体，浓缩至大约25mL，用乙酸乙酯稀释。过滤收集固体，得到9.27g(80.5％)产物，mp 180℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值209.0；实测值209.1
实施例9
N2-苯基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，7-二胺
将0.44g(2.1mmol)2-甲亚磺酰基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺(实施例8)与0.39mL(4.2mmol)苯胺的2mL二甲基亚砜悬液在100℃下加热过夜。冷却所得溶液，倒在水中。向悬液中加入乙酸乙酯，过滤收集固体。固体经过快速色谱纯化，用0％至20％甲醇/二氯甲烷在30分钟期间梯度洗脱，得到0.14g(29％)产物，mp 225-260℃。
MS(APCI)M+1：计算值238.1：实测值238.1.
分析计算值 C13H11N5·0.18H2O：
C，64.92；H，4.76；N，29.12.
实测值：C，65.26；H，4.75；N，28.76.
实施例10
1-叔丁基-3-(2-苯氨基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基)-脲
向在冰浴中冷却的0.1022g(0.431mmol)N2-苯基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，7-二胺(实施例9)的2mL二甲基甲酰胺溶液中加入0.019g(0.47mmol)60％氢化钠。然后将在冰浴中冷却的所得溶液用0.054mL(0.47mmol)异氰酸叔丁酯处理。将溶液趁冷搅拌15分钟，然后在室温下搅拌1小时。将溶液倒在冰水中，得到固体，过滤收集之，用己烷洗涤，得到0.0849g(57.8％)产物(化合物45)，mp 227℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值337.2；实测值337.1.
分析计算值 C18H20N6O1·0.27H2O：
C，63.35；H，6.07；N，24.63.
实测值：C，63.73；H，5.82；N，24.20.
实施例11
4-(4-硝基苯基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
将7.5g(36mmol)1-(4-硝基苯基)-哌嗪与6.94mL(40mmol)乙基-二异丙基-胺的75mL二氯甲烷悬液用8.69g(40mmol)二碳酸二叔丁酯处理，在室温下搅拌过夜。将所得溶液用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，然后用水洗涤，干燥(硫酸镁)，浓缩。所得物质经过快速色谱纯化，用10％至30％乙酸乙酯/己烷在10分钟期间梯度洗脱，得到8.62g(77.5％)产物，mp 136-140℃。
MS(APCI)M+1：计算值308.2；实测值308.2.
实施例12
4-(4-氨基-苯基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
向1.46g(4.8mmol)4-(4-硝基苯基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例11)与1g阮内镍的50mL四氢呋喃悬液中加入氢至最初压力为54.5psi。将反应摇动14小时，然后过滤。浓缩滤液，得到1.29g(97％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值278.2；实测值278.2.
分析计算值 C15H23N3O2：
C，64.96；H，8.36；N，15.15.
实测值：C，65.22；H，8.58；N，14.58.
实施例13
4-[4-(7-氨基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例9中用4-(4-氨基-苯基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例12)代替苯胺，得到0.0744g(36.0％)产物，mp 219-220℃。
MS(APCI)M+1：计算值422.2；实测值422.2.
分析计算值 C22H27N7O2·0.5H2O：
C，61.38；H，6.56；N，22.77.
实测值：C，61.34；H，6.30；N，22.47.
实施例14
4-{4-[7-(3-叔丁基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例10中用4-[4-(7-氨基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例13)代替N2-苯基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，7-二胺，得到0.3354g(67.9％)产物(化合物79)，mp 225℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值521.3；实测值521.2.
分析计算值 C27H36N8O3：
C，62.29；H，6.97；N，21.52.
实测值：C，62.33；H，6.81；N，21.43.
实施例15
1-叔丁基-3-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]脲
向0.100g(0.192mmol)4-{4-[7-(3-叔丁基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例14)的2mL甲醇悬液中加入2mL 4M氯化氢/二噁烷，得到溶液。将悬液在室温下搅拌过夜，然后用乙醚稀释。过滤收集物质，得到0.0941g(93.4％)产物(化合物1)，mp 215℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值421.2；实测值421.1.
分析计算值 C22H28N8O1·2.10 HCl·1.51 H2O：
C，50.40；H，6.37；N，21.37；Cl(总共).14.20
实测值：C，50.40；H，6.18；N，21.03；Cl(总共).14.33.
实施例16
4-{4-[7-3-环己基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例14中用异氰酸环己酯代替异氰酸叔丁酯，得到0.1463g(70.4％)产物(化合物80)，mp 241℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值547.3：实测值547.4
分析计算值 C29H38N8O3·0.28H2O：
C，63.13；H，7.04；N，20.31.
实测值：C，63.14；H，6.81；N，20.25.
实施例17
1-环己基-3-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基)-脲
在实施例15中用4-{4-[7-(3-环己基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例16)代替4-{4-[7-(3-叔丁基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基)氨基]-苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯，得到0.0871g(81.4％)产物(化合物9)，mp 200℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值447.3；实测值447.3.
分析计算值 C24H30N8O1·2.55 HCl·2.82 H2O：
C，48.83；H，6.52；N，18.98：Cl(总共)，15.31.
实测值：C，48.83；H，6.18；N，18.89；Cl(总共)，15.37.
实施例18
N2-(4-氟-3-甲基-苯基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，7-二胺
在实施例9中用4-氟-3-甲基苯胺代替苯胺，得到0.2025g(39.2％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值270.1；实测值270.0.
实施例19
1-叔丁基-3-[2-(4-氟-3-甲基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲
在实施例10中用N2-(4-氟-3-甲基-苯基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，7-二胺(实施例18)代替N2-苯基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，7-二胺，得到0.0656g(47.9％)产物(化合物46)，mp 230℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值369.2：实测值369.1.
分析计算值 C19H21F1N6O1：
C，61.94；H，5.75；N，22.81.
实测值：C，61.82；H，5.73；N，22.75.
实施例20
1-(4-氯-苯基)-3-[2-(4-氟-3-甲基-苯氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲
在实施例19中用4-氯苯基异氰酸酯代替异氰酸叔丁酯，得到0.050(37％)产物(化合物47)，mp＞250℃。
MS(APCI)M+1：计算值423.1：实测值423.1.
分析计算值 C21H16F1Cl1N6O1·0.23H2O：
C，59.07；H，3.89；N，19.68.
实测值：C，59.09；H，3.97；N，19.65.
实施例21
1-{2-[4-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-叔丁基-脲
向0.145g(0.277mmol)1-叔丁基-3-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]脲(实施例15)的5mL二氯甲烷悬液中加入0.19mL(1.11mmol)乙基-二异丙基-胺。将悬液在冰浴中冷却，用0.024mL(0.33mmol)乙酰氯处理。将悬液在室温下搅拌过夜，然后过滤。用二氯甲烷洗涤固体。合并滤液和洗液，用水洗涤，干燥(硫酸镁)，浓缩。物质经过快速色谱纯化，用0％至5％甲醇/二氯甲烷在30分钟期间梯度洗脱，得到0.0674g(51.8％)产物(化合物5)，mp 206-208℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值463.3：实测值463.3.
分析计算值 C24H30N8O2·0.40H2O：
C，61.36；H，6.61；N，23.85.
实测值：C，61.38；H，6.37；N，23.98.
实施例22
4-{4-[7-(3-异丙基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例14中用异氰酸异丙酯代替异氰酸叔丁酯，得到0.909g(69.9％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值507.3；实测值507.4.
实施例23
1-异丙基-3-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]脲
在实施例15中用4-{4-[7-(3-异丙基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例22)代替4-{4-[7-(3-叔丁基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}哌嗪-1-羧酸叔丁酯，得到0.0287g(27.9％)产物(化合物48)，mp 190℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值407.2：实测值407.1.
分析计算值 C21H26N8O1·2.05 TFA·0.84 H2O：
C，46.00；H，4.57；N，17.10.
实测值：C，46.00；H，4.65；N，17.09.
实施例24
顺式-3，5-二甲基-1-(4-硝基-苯基)-哌嗪
将6.74g(47.8mmol)4-氟-硝基苯与10.91g(95.5mmol)顺式-2，6-二甲基-哌嗪的悬液在45℃下加热1小时。将反应混合物冷却，与二氯甲烷和水一起摇动。将有机层干燥(硫酸镁)，浓缩，得到11.62g(＞100％)产物，为固体。
实施例25
顺式-2，6-二甲基-4-(4-硝基-苯基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例11中用顺式-3，5-二甲基-1-(4-硝基-苯基)-哌嗪(实施例24)代替1-(4-硝基苯基)-哌嗪，得到14.87g(92.8％)产物，为固体。
实施例26
4-(4-氨基-苯基)-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例12中用顺式-2，6-二甲基-4-(4-硝基-苯基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例25)代替4-(4-硝基-苯基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯，得到5.03g(64.7％)产物，为固体。
实施例27
4-[4-(7-氨基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例9中用4-(4-氨基-苯基)-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例26)代替苯胺，得到0.6463g(59.8％)产物，mp 245℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值450.3；实测值450.3.
实施例28
4-{4-[7-(3-叔丁基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例10中用4-[4-(7-氨基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例27)代替N2-苯基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，7-二胺，得到0.1828g(74.9％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值549.3；实测值549.4.
实施例29
1-叔丁基-3-{2-[4-(顺式-3，5-二甲基-哌嗪-1-基)-苯氨基]吡啶并[2，3-d]嘧啶-7基}-脲
在实施例15中用4-{4-[7-(3-叔丁基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例28)代替4-{4-[7-(3-叔丁基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯，得到0.0910g(92.9％)产物(化合物49)，mp 245℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值449.3；实测值449.2.
实施例30
4-{4-[7-(3-环己基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例28中用异氰酸环己酯代替异氰酸叔丁酯，得到0.1156g(60.8％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值575.3；实测值575.3.
实施例31
1-环己基-3-{2-[4-(顺式-3，5-二甲基-哌嗪-1-基)-苯氨基]吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-脲
在实施例15中用4-{4-[7-(3-环己基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例30)代替4-{4-[7-(3-叔丁基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯，得到0.1022g产物(化合物50)，mp 228℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值475.2；实测值475.2.
实施例32
4-{4-[7-(3-环戊基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}哌嗪-1-羧酸叔丁酯
向在冰浴中冷却的0.150g(0.36mmol)4-[4-(7-氨基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例13)的2mL二甲基甲酰胺溶液中加入0.022g(0.54mmol)60％氢化钠。将冷却的溶液搅拌15分钟，然后用0.088g(0.54mmol)羰基二咪唑处理。将冷却的溶液搅拌另外30分钟，然后用0.071mL(0.72mmol)环戊胺处理。将所得溶液在室温下搅拌1小时，然后加入到冷水中。过滤收集固体，得到第一批物质。然后用二氯甲烷萃取含水滤液，将萃取液干燥(硫酸镁)，浓缩，得到第二批物质。合并2批物质，经过快速色谱法纯化，用0％至5％甲醇/二氯甲烷在30分钟期间梯度洗脱，得到0.1159g(60.4％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值533.3；实测值533.4.
实施例33
1-环戊基-3-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲
在实施例15中用4-{4-[7-(3-环戊基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例32)代替4-{4-[7-(3-叔丁基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯，得到0.0937g(80.8％)产物(化合物51)，mp 210-213℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值433.2；实测值433.2.
分析计算值 C23H28N8O1·2.49 HCl·1.65 H2O·0.1二噁烷：
C，50.02；H，6.21；N，19.94；Cl(总共)，15.71.
实测值：C，49.89；H，5.81；N，19.74；Cl(总共)，14.74.
实施例34
1-(4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-基)-乙醇
在20分钟期间，向被冰浴冷却的5.0g(29mmol)4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-甲醛(实施例3)的150mL四氢呋喃悬液中加入23.2mL3.0M溴化甲基镁的乙醚溶液(69.4mmol)。在0℃下1小时后，加入另外23.2mL 3.0M溴化甲基镁溶液，使悬液恢复至室温，搅拌过夜。将反应用100mL饱和氯化铵水溶液猝灭，在水与乙酸乙酯之间分配。将有机层干燥(硫酸镁)，浓缩，得到5.24g(96％)产物，mp 140-142℃。
MS(APCI)M+1：计算值186.1；实测值185.9.
实施例35
1-(4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-基)-乙酮
在实施例3中用1-(4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-基)-乙醇(实施例34)代替(4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-基)-甲醇，在80℃于甲苯中进行反应，得到3.74g(72％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值184.0；实测值183.9.
实施例36
1-(4-氨基-2-甲亚磺酰基-嘧啶-5-基)-乙酮
在实施例8中用1-(4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-基)-乙酮(实施例35)代替2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺，得到9.57g(88％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值200；实测值200.
实施例37
4-[4-(5-乙酰基-4-氨基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例13中用1-(4-氨基-2-甲亚磺酰基-嘧啶-5-基)-乙酮(实施例36)代替2-甲亚磺酰基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺，得到4.04g(65％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值413；实测值413.
实施例38
4-[4-(7-氨基-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在0℃下，向0.58g(14.6mmol)60％氢化钠的10mL四氢呋喃悬液中滴加2.58g(14.56mmol)(氰甲基)膦酸二乙酯。将反应混合物在0℃下搅拌5分钟，然后在室温下搅拌20分钟。然后将混合物冷却至0℃，用2g(4.85mmol)4-[4-(5-乙酰基-4-氨基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例37)处理。将混合物在室温下搅拌过夜，然后用水和饱和氯化铵水溶液处理。过滤收集所得固体，用乙醚洗涤，得到1.069g(80％)产物。
MS(APCI)M+1：计算值436；实测值436.
实施例39
4-{4-[7-(3-环己基-脲基)-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例16中用4-[4-(7-氨基-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例38)代替4-[4-(7-氨基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯，得到0.199g(42％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值561；实测值561.
实施例40
1-环己基-3-[5-甲基-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲
在实施例15中用4-{4-[7-(3-环己基-脲基)-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例39)代替4-{4-[7-(3-叔丁基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯，得到产物(化合物12)，为固体，mp 238℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值461；实测值461.
实施例41
5-甲基-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺
在实施例38中用1-(4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-基)-乙酮(实施例35)代替4-[4-(5-乙酰基-4-氨基-嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯，得到0.97g(85％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值207；实测值207.
实施例42
2-甲亚磺酰基-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺
在实施例8中用5-甲基-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺(实施例41)代替2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺，得到0.85g(83％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值223；实测值223.
实施例43
4-[4-(7-氨基-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例13中用2-甲亚磺酰基-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺(实施例42)代替2-甲亚磺酰基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺，得到0.33g(20％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值436；实测值436.
实施例44
4-{4-[7-(3-叔丁基-脲基)-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例10中用4-[4-(7-氨基-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例43)代替N2-苯基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，7-二胺，得到0.17g(45％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值535；实测值535.
实施例45
1-叔丁基-3-[5-甲基-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)吡啶并-[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲
在实施例15中用4-{4-[7-(3-叔丁基-脲基)-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例44)代替4-{4-[7-(3-叔丁基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯，得到0.070g(72％)产物(化合物4)，为固体，mp 230-232℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值435；实测值435.
实施例46
6-氟-2-甲硫基-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮
将1.74g(10.33mmol)(二乙氧基-磷酰基)-氟代-乙酸乙酯的20mL四氢呋喃溶液冷却至-78℃，滴加12.9mL(20.65mmol)1.6M正丁基锂的己烷溶液。在-78℃下搅拌30分钟后，将溶液用1.74g(10.33mmol)4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-甲醛(实施例3)处理，使溶液温热至室温，搅拌过夜。将反应用饱和氯化铵水溶液处理，然后用水处理。过滤收集固体，用乙醚洗涤，得到2.01g(92％)产物。
MS(APCI)M+1：计算值212；实测值212.
实施例47
7-氯-6-氟-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶
在实施例6中用6-氟-2-甲硫基-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(实施例46)代替2-甲硫基-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮，得到1.86g(85％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值230，232；实测值230，232.
实施例48
6-氟-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺
在实施例7中用7-氯-6-氟-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶(实施例47)代替7-氯-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶，得到0.29g(90％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值211；实测值211.
实施例49
6-氟-2-甲亚磺酰基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺
在实施例8中用6-氟-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺(实施例48)代替2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺，得到0.26g(95％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值227；实测值227.
实施例50
4-[4-(7-氨基-6-氟-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例27中用6-氟-2-甲亚磺酰基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺(实施例49)代替2-甲亚磺酰基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺，得到0.040g(63％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值468；实测值468.
实施例51
4-{4-[7-(3-环己基-脲基)-6-氟-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例16中用4-[4-(7-氨基-6-氟-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例50)代替4-[4-(7-氨基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯，得到0.10g(74％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值593；实测值593.
实施例52
1-环己基-3-{2-[4-(顺式-3，5-二甲基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-6-氟-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-脲
在实施例15中用4-{4-[7-(3-环己基-脲基)-6-氟-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例51)代替4-{4-[7-(3-叔丁基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯，得到0.060g(75％)产物(化合物52)，为固体，mp 227-229℃。
MS(APCI)M+1：计算值493；实测值493.
实施例53
4-{4-[7-(3-环戊基-脲基)-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例32中用4-[4-(7-氨基-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例43)代替4-[4-(7-氨基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯，得到0.18g(55％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值547；实测值547.
实施例54
1-环戊基-3-[5-甲基-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲
在实施例15中用4-{4-[7-(3-环戊基-脲基)-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例53)代替4-{4-[7-(3-叔丁基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯，得到0.08g(70％)产物(化合物53)，mp234℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值447；实测值447.
实施例55
4-(4-{7-[3-(3-羟基-丙基)-脲基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基}-苯基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例32中用3-氨基-1-丙醇代替环戊胺，用叔丁醇钠代替氢化钠，得到0.1295g(52.2％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值523.3；实测值523.2.
实施例56
1-(3-羟基-丙基)-3-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲
在实施例15中代之以实施例55的产物，得到0.1077g产物(化合物81)，为固体，mp 183℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值423.2；实测值423.1.
实施例57
4-{4-[7-(3-环己基-3-甲基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例55中用N-甲基环己基胺代替3-氨基-1-丙醇，得到0.1932g(72.7％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值561.3；实测值561.2.
实施例58
1-环己基-1-甲基-3-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲
在实施例15中代之以实施例57的产物，得到0.1645g产物(化合物65)，为固体，mp 177℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值461.3；实测值461.2.
实施例59
4-(4-{7-[3-((S)-1-羟甲基-3-甲基-丁基)-脲基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基}-苯基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例55中用(S)-(+)-亮氨醇代替3-氨基-1-丙醇，得到0.1048g(39.1％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值565.3；实测值565.3.
实施例60
1-((S)-1-羟甲基-3-甲基-丁基)-3-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲
在实施例15中代之以实施例59的产物，得到0.0802g产物(化合物83)，为固体，mp 185℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值465.3；实测值465.2.
实施例61
4-[4-(7-{[1-(4-甲基-哌嗪-1-基)-甲酰基]-氨基}-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例55中用N-甲基哌嗪代替3-氨基-1-丙醇，得到产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值548.3；实测值548.3.
实施例62
4-甲基-哌嗪-1-羧酸[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-酰胺
在实施例15中代之以实施例61的产物，得到0.1194g产物(化合物84)，为固体，mp 200℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值448.3；实测值448.2.
实施例63
4-(4-{7-[(1-吗啉-4-基-甲酰基)-氨基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基}-苯基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例55中用吗啉代替3-氨基-1-丙醇，得到产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值535.3；实测值535.2.
实施例64
吗啉-4-羧酸[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-酰胺
在实施例15中代之以实施例63的产物，得到0.1132g产物(化合物85)，为固体，mp 190℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值435.2；实测值435.2.
实施例65
4-{4-[7-(3，3-二丙基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例55中用二丙胺代替3-氨基-1-丙醇，得到产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值549.3；实测值549.3.
实施例66
3-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-1，1-二丙基-脲
在实施例15中代之以实施例65的产物，得到0.1278g产物(化合物86)，为固体，mp 190℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值449.3；实测值449.2.
实施例67
4-[4-(7-{[1-(4-Boc-哌嗪-1-基)-甲酰基]-氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例55中用Boc-哌嗪代替3-氨基-1-丙醇，得到产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值634.3；实测值634.3.
实施例68
哌嗪-1-羧酸[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-酰胺
在实施例15中代之以实施例67的产物，得到0.0342g产物(化合物87)，为固体，mp 220℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值434.2；实测值434.2.
实施例69
4-(4-{7-[3-((R)-1-羟甲基-2-甲基-丙基)-脲基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基}-苯基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例55中用(R)-缬氨醇代替3-氨基-1-丙醇，得到产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值551.3；实测值551.3.
实施例70
1-((R)-1-羟甲基-2-甲基-丙基)-3-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲
在实施例15中代之以实施例69的产物，得到0.0639g产物(化合物88)，为固体，mp 200℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值451.3；实测值451.2.
实施例71
4-(4-{7-[3，3-双-(2-羟基-乙基)-脲基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基}-苯基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例55中用二乙醇胺代替3-氨基-1-丙醇，得到产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值553.3；实测值553.2.
实施例72
1，1-双-(2-羟基-乙基)-3-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲
在实施例15中代之以实施例71的产物，得到0.0916g产物(化合物89)，为固体，mp 185℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值453.2；实测值453.2.
实施例73
6-溴-2-甲硫基-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮
向5.00g(25.9mmol)2-甲硫基-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮(实施例5)的130mL DMF溶液中加入5.00g(28.1mmol)N-溴琥珀酰亚胺。将所得悬液在室温下搅拌过夜，浓缩。将固体用热水研制，用异丙醇洗涤，得到5.59g(79.4％)产物，为固体，mp 266-270℃。
实施例74
6-溴-7-氯-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶
在实施例6中代之以实施例73的产物，得到2.73g(97.2％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值289.9；实测值289.8.
实施例75
6-溴-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺
在实施例7中代之以实施例74的产物，得到2.09g(82.9％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值271.0；实测值270.8.
实施例76
6-溴-2-甲亚磺酰基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺
在实施例8中代之以实施例75的产物，得到1.81g(81.9％)产物，为固体，mp 245℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值287.0；实测值286.8.
实施例77
4-[4-7-氨基-6-溴-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例13中代之以实施例76的产物，得到1.40g(44.4％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值500.1；实测值500.0.
实施例78
4-{4-[6-溴-7-(3-环己基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例16中代之以实施例77的产物，得到0.1160g(46.4％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值625.2；实测值625.1.
实施例79
1-[6-溴-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-3-环己基-脲
在实施例15中代之以实施例78的产物，得到0.0886g(77.0％)产物(化合物55)，为固体，mp 195℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值525.2；实测值525.1.
分析计算值 C24H29Br1N8O1·1.64H2O·1.83HCl：
C，46.37；H，5.53；N，18.02；Cl，10.44.
实测值：C，46.53；H，5.34；N，17.73；Cl，10.15.
实施例80
4-{4-[6-溴-7-(3-叔丁基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例10中代之以实施例77的产物，得到0.2571g(42.9％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值599.2；实测值599.2.
实施例81
1-[6-溴-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-3-叔丁基-脲
在实施例15中代之以实施例80的产物，得到0.0481g产物(化合物91)，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值499.2；实测值499.0.
实施例82
4-{4-[6-溴-7-(3-甲基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例32中代之以实施例77的产物和甲胺，得到0.170g(29.9％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值557.2；实测值557.1.
实施例83
1-[6-溴-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-3-甲基-脲
在实施例15中代之以实施例82的产物，得到0.0963g(69％)产物(化合物93)，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值457.1：实测值457.1.
分析计算值 C19H21Br1N8O1·3HCl·3H2O：
C，36.76；H，4.87；N，18.05；Cl，17.13；H2O，8.71.
实测值：C，36.49；H，4.35；N，17.52；Cl，15.79；H2O，8.12.
实施例84
4-[4-(7-氨基-6-溴-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例27中代之以实施例76的产物，得到2.10g(63.1％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值528.2；实测值528.2.
实施例85
4-{4-[6-溴-7-(3-叔丁基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例10中代之以实施例84的产物，得到0.1725g(72.6％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值627.2；实测值627.2.
实施例86
1-{6-溴-2-[4-(顺式-3，5-二甲基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-叔丁基-脲
在实施例15中代之以实施例85的产物，得到0.1593g(96.0％)产物(化合物94)，为固体，mp 202℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值527.2；实测值527.2.
分析计算值 C24H31Br1N8O1·2.55HCl·1.70H2O：
C，44.28；H，5.72；N，17.21；Cl，13.89
实测值：C，44.28；H，5.72；N，17.09；Cl，12.49
实施例87
4-{4-[6-溴-7-(3-环己基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例16中代之以实施例84的产物，得到0.1750g(70.7％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值653.3；实测值653.3.
实施例88
1-{6-溴-2-[4-(顺式-3，5-二甲基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-环己基-脲
在实施例15中代之以实施例87的产物，得到0.1614g(95.4％)产物(化合物95)，为固体，mp 198℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值553.2：实测值553.2.
分析计算值 C26H33N8O1Br1·2.76HCl·2.02H2O：
C，45.22；H，5.81；N，16.23；Cl，14.17.
实测值：C，45.23；H，5.82；N，16.08；Cl，13.53.
实施例89
N2-(4-氟-苯基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2，7-二胺
在实施例9中代之以4-氟苯胺，得到1.1529g(45.2％)产物，为固体，mp 245-248℃。
MS(APCI)M+1：计算值256.1；实测值255.9.
实施例90
1-[2-(4-氟-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-3-(3-吗啉-4-基-丙基)-脲
在实施例32中代之以实施例89的产物和3-吗啉-4-基丙胺，得到0.1465g(58.6％)产物(化合物96)，为固体，mp 253-256℃。
MS(APCI)M+1：计算值 426.2；实测值426.1.
分析计算值 C21H24F1N7O2：
C，59.28；H，5.69；N，23.04.
实测值：C，59.18；H，5.66；N，23.04.
实施例91
1-[2-(4-氟-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-3-(2-羟基-乙基)脲
在实施例32中代之以实施例89的产物和2-羟基-乙胺，得到0.0811g(40.3％)产物(化合物97)，为固体，mp 238-240℃。
MS(APCI)M-1：计算值343.1：实测值343.1.
分析计算值 C16H15F1N6O2：
C，56.14；H，4.42；N，24.55.
实测值：C，55.82；H，4.52；N，24.15.
实施例92
1-(2-氨基-乙基)-3-[2-(4-氟-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]脲
在实施例32中代之以实施例89的产物和乙二胺，得到0.1000g(49.3％)产物(化合物98)，为固体，mp 217-220℃。
MS(APCI)M+1：计算值342.1：实测值3420
分析计算值 C16H16F1N7O1·0.2H2O：
C，55.71；H，4.79；N，28.42
实测值：C，55.72；H，4.57；N，28.07.
实施例93
1-(2-二甲氨基-乙基)-3-[2-(4-氟-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲
在实施例32中代之以实施例89的产物和2-二甲氨基-乙胺，得到0.0778(35.8％)产物(化合物99)，为固体，mp 251-255℃。
MS(APCI)M+1：计算值370.2；实测值370.0.
分析计算值 C18H20F1N7O1：
C，58.53；H，5.46；N，26.54.
实测值：C，58.39；H，5.51；N，26.26.
实施例94
3，3-二甲基-1-(4-硝基-苯基)-哌嗪
在实施例24中代之以2，2-二甲基-哌嗪，得到29.43g(88.4％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值236；实测值236.
实施例95
2，2-二甲基-4-(4-硝基-苯基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例11中代之以实施例94的产物，得到38g(93％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值336；实测值336.
实施例96
4-(4-氨基-苯基)-2，2-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例12中代之以实施例95的产物，得到27g(78％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值306；实测值306.
实施例97
4-[4-(7-氨基-6-氟-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-2，2-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例50中代之以实施例96的产物，得到0.4346g(59.0％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值468.2；实测值468.3.
实施例98
4-{4-[7-(3-环己基-脲基)-6-氟-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-2，2-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例16中代之以实施例97的产物，得到0.170g(31.2％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值593.2；实测值593.4.
实施例99
1-环己基-3-{2-[4-(3，3-二甲基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-6-氟-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-脲
在实施例15中代之以实施例98的产物，得到0.040g产物(化合物100)，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值493.3；实测值493.2.
实施例100
4-[4-(7-氨基-6-氟-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例50中代之以实施例12的产物，得到0.2017g(29.7％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值440.2；实测值440.2.
实施例101
4-{4-[7-(3-环己基-脲基)-6-氟-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例16中代之以实施例100的产物，得到0.2036g(78.6％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值565.3；实测值565.3.
实施例102
1-环己基-3-[6-氟-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲
在实施例15中代之以实施例101的产物，得到0.1084g(96.0％)产物(化合物11)，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值465.2；实测值465.2.
分析计算值 C24H29F1N8O1·2.75HCl·3.5H2O：
C，45.91；H，5.10；N，17.85；Cl，15.53；H2O，10.04.
实测值：C，46.20；H，5.86；N，17.45；Cl，15.22；H2O，8.97.
实施例103
4-{4-[7-(3-叔丁基-脲基)-6-氟-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例10中代之以实施例50的产物，得到0.070g(17.9％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值567.3；实测值567.3
实施例104
1-叔丁基-3-{2-[4-(顺式-3，5-二甲基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-6-氟-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-脲
在实施例15中代之以实施例103的产物，得到0.0585g产物(化合物102)，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值467.3；实测值467.3.
实施例105
1-[4-(4-硝基-苯基)-哌嗪基]-乙酮
向5.0g(24.1mmol)1-(4-硝基-苯基)-哌嗪的100mL二氯甲烷溶液中加入5.04mL(28.9mmol)二异丙基-乙胺。将溶液在冰浴中冷却，用1.89mL(26.5mmol)乙酰氯处理，在室温下搅拌过夜。将反应连续用水、0.5M HCl、饱和碳酸氢钠和盐水洗涤，经硫酸镁干燥，浓缩，得到5.91g(98.5％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值250.1；实测值250.0.
实施例106
1-[4-(4-氨基-苯基)-哌嗪-1-基]-乙酮
在实施例12中代之以实施例105的产物，得到4.35g(84.1％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值220.1；实测值220.1.
实施例107
1-{4-[4-(7-氨基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-基}-乙酮
在实施例9中代之以实施例106的产物，得到0.1829g(50.1％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值364.2；实测值364.2.
分析计算值 C19H21N7O1·1.0H2O：
C，59.46；H，6.11；N，25.55.
实测值：C，59.51；H，6.03；N，25.28.
实施例108
1-{2-[4-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-(3-吗啉-4-基-丙基)-脲
在实施例32中代之以实施例107的产物和3-吗啉-4-基-丙胺，得到0.0338g(22.6％)产物(化合物103)，为固体，mp 222-225℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值534.3：实测值534.2.
分析计算值 C27H35N9O3·0.5H2O：
C，59.76；H，6.69；N，23.25.
实测值：C，59.74；H，6.53；N，23.35.
实施例109
6-氯-2-甲硫基-8H-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-酮
在实施例74中代之以N-氯琥珀酰亚胺，得到0.3700g(31.4％)产物，为固体，mp 264-266℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值228.0；实测值227.9.
实施例110
6，7-二氯-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶
在实施例6中代之以实施例109的产物，得到0.6534g(86.5％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值246.0；实测值245.8.
实施例111
6-氯-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺
在实施例7中代之以实施例110的产物，得到0.38g(63％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值227.0；实测值226.9.
实施例112
6-氯-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺
在实施例8中代之以实施例111的产物，得到0.2328g(57.1％)产物，为固体，mp 260-262℃。
MS(APCI)M+1：计算值243.0；实测值242.9.
实施例113
4-[4-(7-氨基-6-氯-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例27中代之以实施例112的产物，得到0.22g(49％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值484.2；实测值484.2.
实施例114
4-{4-[7-(3-叔丁基-脲基)-6-氯-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯基}-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例10中代之以实施例113的产物，得到0.0995g(39.2％)产物，为固体。
实施例115
1-叔丁基-3-{6-氯-2-[4-(顺式-3，5-二甲基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-脲
在实施例15中代之以实施例114的产物，得到0.0995g产物(化合物104)，为固体，205℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值483.2；实测值483.2.
实施例116
甲基-(2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基)-胺
在实施例7中代之以甲胺，得到1.46g(30.0％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值207.1；实测值206.9.
实施例117
(2-甲亚磺酰基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基)-甲基-胺
在实施例8中代之以实施例116的产物，得到1.31g(83.4％)产物，为固体，mp 185℃。
MS(APCI)M+1：计算值223.1；实测值223.0
实施例118
4-[4-(7-甲氨基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基)-苯基]-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例13中代之以实施例117的产物，得到0.4934g(62.9％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值436.2；实测值436.2.
实施例119
4-{4-[7-(3-环己基-1-甲基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基]-苯基}-哌嗪-1-羧酸叔丁酯
在实施例16中代之以实施例118的产物，并使用乙腈作为溶剂，不使用碱，得到0.8535g(78.8％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值561.3；实测值561.3.
实施例120
3-环己基-1-甲基-1-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲
在实施例15中代之以实施例119的产物，得到0.2548g(36.0％)产物(化合物70)，为固体。mp 169-175℃。
MS(APCI)M+1：计算值461.3：实测值461.2.
分析计算值 C25H32N8O1·0.25H2O：
C，64.56；H，7.04；N，24.09.
实测值：C，64.57；H，7.01；N，23.98.
实施例121
3-环己基-1-[2-[4-(顺式-3，5-二甲基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-1-甲基-脲
利用合成实施例120的通用方法，得到0.1366g(95.6％)产物(化合物106)，为固体。mp 170℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值489.3；实测值489.3.
分析计算值 C27H36N8O1·3.32H2O·2.69HCl：
C，50.16；H，7.07；N，17.33；Cl，14.75.
实测值：C，50.36；H，6.98；N，16.97；Cl，15.07.
实施例122
3-环己基-1-乙基-1-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲
利用合成实施例120的通用方法，得到0.118g(94％)产物(化合物107)，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值475.3：实测值475.3.
分析计算值 C26H34N8O1·3.0HCl·0.3 乙醚：
C，53.89；H，6.65；N，18.48.
实测值：C，53.75；H，6.96；N，18.57.
实施例123
3-叔丁基-1-{2-[4-(顺式-3，5-二甲基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-1-乙基-脲
利用合成实施例15的通用方法，得到0.022g(56％)产物(化合物108)，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值477.3；实测值477.3.
实施例124
1-甲基-3-[5-甲基-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲
利用合成实施例40的通用方法，得到产物(化合物64)，为固体，mp 204-206℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值393；实测值393.
实施例125
1-乙基-3-[5-甲基-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲
利用合成实施例40的通用方法，得到产物(化合物28)，为固体。mp 220-222℃。
MS(APCI)M+1：计算值407；实测值407.
实施例126
1-[5-甲基-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-3-丙基-脲
利用合成实施例40的通用方法，得到产物(化合物111)，为固体，mp 223-225℃。
MS(APCI)M+1：计算值421；实测值421.
实施例127
N，N-二甲基-N’-[5-甲基-2-[[4-(1-哌嗪基)苯基]-氨基]-吡啶并[2，3-d]-嘧啶-7-基-磺酰胺
利用合成实施例40的通用方法，但是使用二甲基氨磺酰氯而不是异氰酸环己酯，得到产物(化合物71)，为固体，mp 228-230℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值443；实测值443.
实施例128
7-氨基-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯
向4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-甲醛(实施例3)的10mL四氢呋喃溶液中加入0.126mL(1.18mmol)氰基乙酸乙酯。将溶液冷却至-10℃，用2.36mL(2.36mmol)四氯化钛处理。向该溶液中缓慢加入0.52mL(4.72mmol)N-甲基吗啉。使反应历经2小时温热至室温，在乙酸乙酯与饱和氯化铵水溶液之间分配。浓缩有机相，得到固体，用乙醚研制，得到0.30g(96％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值265.1；实测值264.9.
实施例129
7-氨基-2-氯-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯
向实施例128产物的50mL氯仿悬液中缓慢加入磺酰氯，然后加入2滴乙醇。将反应在室温下搅拌16小时，倒在乙醚中，收集固体，得到0.50g(98％)产物。
MS(APCI)M+1：计算值253.1；实测值253.1.
实施例130
7-氨基-2-[4-(4-叔丁氧羰基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯
将实施例12产物与实施例129产物的二噁烷溶液在回流下加热1.5小时。将反应倒在己烷/乙酸乙酯(1∶1)中，收集固体。经过快速色谱纯化，使用二氯甲烷作为洗脱剂，得到0.08g(16％)产物，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值494.2；实测值494.1.
实施例131
2-[4-(4-叔丁氧羰基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-7-(3-叔丁基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯
在实施例10中代之以实施例130的产物，得到0.05g(48％)产物，为固体。
实施例132
7-(3-叔丁基-脲基)-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-羧酸乙酯
在实施例15中代之以实施例131的产物，得到0.036g产物(化合物113)，为固体，mp＞300℃。
实施例133
1-[6-氟-5-甲基-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-3-异丙基-脲
利用合成实施例52的通用方法，但是使用1-(4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-基)-乙酮(实施例35)、4-(4-氨基-苯基)-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例12)和异氰酸异丙酯作为试剂，得到产物(化合物114)，为固体，mp 208℃(分解)。
MS(APCI)M+1：计算值439.2；实测值439.3.
实施例134
1-环己基-3-{2-[4-(3，3-二甲基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-脲
利用合成实施例17的通用方法，但是使用4-(4-氨基-苯基)-2，2-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯(实施例96)，得到0.95g(100％)产物(化合物115)，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值475.6；实测值475.3
分析计算值 C26H34N8O1·3HCl·1H2O：
C，51.96；H，6.37；N，18.64；Cl，17.69；H2O，2.99.
实测值：C，52.00；H，6.41；N，18.53；Cl，16.51；H2O，3.06
实施例135
6-甲基-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺
向冷却至10℃的、2.18g(54mmol)60％氢化钠的油分散系的300mL四氢呋喃悬液中加入10.2g(53.4mmol)(1-氰基-1-甲基-甲基)-膦酸二乙酯(Synthesis(合成)，1975：516)。向冷却的悬液中加入4.30g(25.4mmol)4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-甲醛(实施例3)，将反应在室温下搅拌22小时。将所得溶液浓缩，过滤，得到固体，用四氢呋喃洗涤，溶于1N柠檬酸，用50％氢氧化钠调节pH至8进行再沉淀。过滤收集固体，得到1.1g(21％)产物，mp 268-270℃。
MS(APCI)M+1：计算值207.3；实测值207.0.
实施例136
1-环己基-3-{2-[4-(顺式-3，5-二甲基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-6-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-脲
利用合成实施例31的通用方法，但是使用实施例135产物作为原料，得到0.14g(42％)产物(化合物116)，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值589.6；实测值589.3
分析计算值 C27H36N8O1·2.5HCl·1.5H2O：
C，53.80；H，6.73；N，18.01；Cl，14.11；H2O，4.06
实测值：C，53.44；H，6.89；N，18.46；Cl，14.60；H2O，4.48.
实施例137
1-叔丁基-3-{2-[4-(顺式-3，5-二甲基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-6-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-脲
利用合成实施例29的通用方法，但是使用实施例135产物作为原料，得到0.26g(89％)产物(化合物117)，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值463.6；实测值463.3.
分析计算值 C25H36N8O1·2.4HCl·1.75H2O：
C，51.62；H，6.91；N，19.26；Cl，14.63；H2O，5.42.
实测值：C，51.23；H，6.55；N，18.92；Cl，14.73；H2O，5.10.
实施例138
1-叔丁基-3-[6-甲基-2-(4-哌嗪-1-基)-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲
利用合成实施例15的通用方法，但是使用实施例135产物作为原料，得到1.02g(100％)产物(化合物118)，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值435.3；实测值435.3.
分析计算值 C23H30N8O1·5HCl·1.75H2O：
C，42.60；H，5.98；N，17.28；Cl，27.34；H2O，4.86.
实测值：C，42.03；H，6.04；N，16.81；Cl，22.95；H2O，4.72.
实施例139
1-{2-[4-(顺式-3，5-二甲基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-6-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-异丙基-脲
利用合成实施例33的通用方法，但是使用实施例135产物作为原料，以及使用4-(4-氨基苯基)-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯和异丙胺作为试剂，得到0.130g(100％)产物(化合物119)，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值449.3：实测值449.3.
分析计算值 C24H32N8O1·3HCl·1.75H2O：
C，48.90；H，6.58；N，19.01；Cl，16.04；H2O，5.35.
实测值：C，49.03；H，6.63；N，18.70；Cl，16.03；H2O，5.19.
实施例140
1-环丙基-3-{2-[4-(顺式-3，5-二甲基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-6-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-脲
利用合成实施例33的通用方法，但是使用实施例135产物作为原料，以及使用4-(4-氨基苯基)-顺式-2，6-二甲基-哌嗪-1-羧酸叔丁酯和环丙胺作为试剂，得到0.099g(100％)产物(化合物120)，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值447.3；实测值447.3.
分析计算值 C24H30N8O1；
C，49.83；H，6.19；N，19.37；Cl，18.39；H2O，3.89.
实测值：C，49.76；H，6.23；N，18.92；Cl，15.66；H2O，3.06.
实施例141
1-叔丁基-3-{2-[4-(顺式-3，5-二甲基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-6-乙基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-脲
利用合成实施例137的通用方法，但是使用(1-氰基-丙基)-膦酸二乙酯作为原料，得到0.34g(95％)产物(化合物121)，为固体。
MS(APCI)M+1：计算值477.3：实测值477.3.
分析计算值 C26H26N8O1·2.5HCl·1H2O：
C，53.26；H；7.05；N，19.11；Cl，15.18；H2O，3.07.
实测值：C，53.63；H，7.31；N，18.46；Cl，15.32；H2O，3.48.
实施例142
基本上按照实施例1-141所述和流程1-4所示程序制备下列化合物：
(a)1-叔丁基-3-[2-(3-氯-4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物2)；
(b)1-叔丁基-3-[6-氟-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物3)；
(c)1-{2-[4-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-3-氯-苯氨基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-叔丁基-脲(化合物6)；
(d)1-{2-[4-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-6-氟-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-叔丁基-脲(化合物7)；
(e)1-{2-[4-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-叔丁基-脲(化合物8)；
(f)1-[2-(3-氯-4-哌嗪-1-基-苯氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-3-环己基-脲(化合物10)；
(g)1-{2-[4-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-苯氨基]吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-环己基-脲(化合物13)；
(h)1-{2-[4-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-3-氯-苯氨基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-环己基-脲(化合物14)；
(i)1-{2-[4-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-6-氟-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-环己基-脲(化合物15)；
(j)1-{2-[4-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-环己基-脲(化合物1 6)；
(k)1-(2-羟基-乙基)-3-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物1 7)；
(l)1-[2-(3-氯-4-哌嗪-1-基-苯氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-3-(2-羟基-乙基)-脲(化合物18)；
(m)1-[6-氟-2-(4-哌嗪-1-基)-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-3-(2-羟基-乙基)-脲(化合物19)；
(n)1-(2-羟基-乙基)-3-[5-甲基-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物20)；
(o)1-{2-[4-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-苯氨基]吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-(2-羟基-乙基)-脲(化合物21)；
(p)1-{2-[4-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-3-氯-苯氨基]吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-(2-羟基-乙基)-脲(化合物22)；
(q)1-{2-[4-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-6-氟-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-(2-羟基-乙基)-脲(化合物23)；
(r)1-{2-[4-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-(2-羟基-乙基)-脲(化合物24)；
(s)1-乙基-3-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物25)；
(t)1-[2-(3-氯-4-哌嗪-1-基-苯氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-3-乙基-脲(化合物26)；
(u)1-乙基-3-[6-氟-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物27)；
(v)1-{2-[4-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-苯氨基]吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-乙基-脲(化合物29)；
(w)1-{2-[4-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-3-氯-苯氨基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-乙基-脲(化合物30)；
(x)1-{2-[4-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-6-氟-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-乙基-脲(化合物31)；
(y)1-{2-[4-(4-乙酰基-哌嗪-1-基)-苯氨基]-5-甲基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-3-乙基-脲(化合物32)；
(z)1-叔丁基-3-[2-(吡啶-4-基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物33)；
(aa)1-环己基-3-[2-(吡啶-4-基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物34)；
(bb)1-乙基-3-[2-(吡啶-4-基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶7-基]-脲(化合物35)；
(cc)1-(羟基-乙基)-3-[2-(吡啶-4-基氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物36)；
(dd)1-叔丁基-3-[6-氟-2-(吡啶-4-基氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物37)；
(ee)1-环己基-3-[6-氟-2-(吡啶-4-基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物38)；
(ff)1-乙基-3-[6-氟-2-(吡啶-4-基氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物39)；
(gg)1-[6-氟-2-(吡啶-4-基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-3-(2-羟基-乙基)-脲(化合物40)；
(hh)1-叔丁基-3-[5-甲基-2-(吡啶-4-基氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物41)；
(ii)1-环己基-3-[5-甲基-2-(吡啶-4-基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物42)；
(jj)1-乙基-3-[5-甲基-2-(吡啶-4-基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物43)；
(kk)1-(2-羟基-乙基)-3-[5-甲基-2-(吡啶-4-基氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物44)；
(ll)1-环己基-3-[6-甲基-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物54)；
(mm)1-环己基-3-[6-氰基-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物56)；
(nn)1-环己基-3-[6-氯-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物57)；
(oo)1-环己基-3-[6-氟-5-甲基-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物58)；
(pp)1-环己基-3-[6-溴-5-甲基-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物59)；
(qq)1-环己基-3-[6-氯-5-甲基-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物60)；
(rr)1-异丙基-3-[5-甲基-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物61)；
(ss)1-[5-甲基-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物63)；
(tt)1-(4-羟基-环己基)-3-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物66)；
(uu)1-(4-氨基-环己基)-3-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物67)；
(vv)1-(2-二甲基氨基-乙基)-3-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物68)；
(ww)1-(3-吗啉代-4-基-丙基)-3-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物69)；
(xx)1-环己基-3-[5-甲基-2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-硫脲(化合物72)；
(yy)N-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-乙酰胺(化合物73)；
(zz)4-[7-(3-环己基-脲基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-2-基氨基]-苯磺酰胺(化合物74)；
(aaa)1-环己基-3-{2-[4-(1-哌嗪-1-基-甲酰基)-苯氨基]-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-脲(化合物75)；
(bbb)1-环己基-3-[2-(4-氟-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲(化合物76)；
(ccc)1-(2-{4-[4-(2-氨基-4-甲基-戊酰基)-哌嗪-1-基]-苯氨基}-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基)-3-环己基-脲(化合物77)；和
(ddd)1-(2-{4-[4-(2-氨基-3-甲基-丁酰基)-哌嗪-1-基]苯氨基}-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基)-3-环己基-脲(化合物78)。
实施例143
生物学测定法
如上所述，本发明化合物是有力的cdks抑制剂，因此可用于治疗和预防动脉粥样硬化和其他细胞增殖障碍，象由这类cdk酶介导的癌症。当在本领域技术人员习惯上用于测量cdk抑制活性的标准测定法中进行评价时，这些化合物对大量cdk酶表现优异的抑制活性，包括cdkcdk1/细胞周期蛋白B、cdk2/细胞周期蛋白A、cdk2/细胞周期蛋白E和cdk4/细胞周期蛋白D。典型的测定法是如下进行的。
细胞周期蛋白依赖性激酶4(cdk4)测定法
关于IC50测定和动力学评价的酶测定法是在96-孔滤板(Millipore MADVN6550)内进行的。总体积为0.1mL，含有最终浓度为20mM的TRIS(三[羟甲基]氨基甲烷)，pH 7.4、50mM NaCl、1mM二硫苏糖醇、10mM MgCl2、含有0.25μCi [32P]ATP的25μm ATP、20ng cdk4、1μg成视网膜细胞瘤和适当稀释的本发明化合物。向小孔内加入除ATP以外的所有组分，将平板放置在平板混合机上达2分钟。加入[32P]ATP开始反应，将平板在25℃下保温15分钟。加入0.1mL 20％三氯乙酸(TCA)终止反应。将平板在4℃下保持至少1小时，使底物沉淀。然后将小孔用0.2mL 10％TCA洗涤5次，利用β平板计数器(Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)测定32P掺入。
细胞周期蛋白依赖性激酶1和2(cdk1/细胞周期蛋白B、cdk2/细胞周期蛋白A、cdk2/细胞周期蛋白E)测定法
关于IC50测定和动力学评价的酶测定法是在96-孔滤板(Millipore MADVN6550)内进行的，总体积为0.1mL，含有20mM的TRIS(三[羟甲基]氨基甲烷)，pH 7.4、50mM NaCl、1mM二硫苏糖醇、10mM MgCl2、含有0.25μCi[32P]ATP的12mM ATP、20ng酶(cdk1/B、cdk2/A或cdk2/E)、1μg成视网膜细胞瘤和适当稀释的本发明化合物。向小孔内加入除ATP以外的所有组分，将平板放置在平板混合机上达2分钟。加入[32P]ATP开始反应，将平板在25℃下保温15分钟。加入0.1mL 20％TCA终止反应。将平板在4℃下保持至少1小时，使底物沉淀。然后将小孔用0.2mL 10％TCA洗涤5次，利用β平板计数器(Wallac Inc.，Gaithersburg，MD)测定32P掺入。
细胞周期蛋白依赖性激酶5/p25脯氨酸-定向的蛋白激酶测定法
酶的来源：重组杆状病毒-感染的昆虫细胞sf9-表达的重组cdk5-p25复合体
目的：评价供试药物抑制组蛋白H1的cdk5/p25磷酸化的能力。
方法：将杆状病毒-昆虫细胞His-标记的cdk5/Glu-标记的p25(或GST-p25)酶复合体在酶稀释缓冲液(EDB：50mM Tris-HCl[pH 8.0]，10mM NaCl，10mM MgCl2，1mM DTT)中稀释至浓度为50ng/20μL。然后将20μL供试药物(稀释在EDB中的)样本与20μL最终的cdk5/p25酶制备物合并，在室温下放置5分钟。然后向供试药物/酶制备物加入25微升底物的EDB溶液，含有115μL/mL组蛋白H1、30μMATP(无钒酸盐)和30μCi/mLγ-33P ATP(Amersham)，在30℃下摇动45分钟。向100mL 150mM磷酸中加入50μL最终制备物的样本，置于冰上达30分钟以促进沉淀。然后将沉淀通过96-孔磷酸纤维素滤板过滤，随后用75mM磷酸洗涤3次。每孔然后接受20μL闪烁鸡尾酒，利用Trilux计数器计数平板的β发射(33P滤器协议)。比较供试样本与对照(没有供试药物存在；0％抑制)和基线水平(没有酶、没有供试药物；100％抑制)的β发射，以测定组蛋白H1磷酸化的抑制百分率。
关于代表性本发明化合物的上述测定结果列在下表2中。本发明化合物所表现的IC50值，对cdk1/B为0.027μM至＞5μM，对cdk2/A为0.010μM至＞5μM，对cdk2/E为0.020μM至＞5μM，对cdk4/D为0.004μM至＞5μM。总的说来最有效的化合物是化合物9，它对cdk1/B、cdk2/A、cdk2/E和cdk4/D分别表现0.027μM、0.010μM、0.020μM、0.005μM的IC50值。 表2：对Cdk的抑制作用：IC50(μM)化合物 Cdk1/B Cdk2/A Cdk2/E Cdk4D 1 0.219 0.060 0.130 0.006 4 ＞5 ＞5 ＞5 1.5 5 0.463 0.130 0.130 0.037 9 0.027 0.010 0.020 0.005 11 0.159 0.092 0.125 0.011 12 ＞5 ＞5 ＞5 2.100 28 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 45 0.552 0.054 0.110 0.045 46 0.075 0.300 ＞5 47 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 48 0.257 0.113 0.098 0.018 49 0.911 0.528 0.475 0.050 50 0.069 0.022 0.035 0.007 51 0.053 0.024 0.030 0.004 52 0.472 0.213 0.126 0.027 53 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 表2：对Cdk的抑制作用：IC50(μM)化合物 Cdk1/B Cdk2/A Cdk2/E Cdk4D 55 ＞5 ＞5 ＞5 0.300 64 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 65 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 70 1.448 0.697 0.530 0.017 71 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 79 ＞5 1.066 ＞5 ＞5 80 0.461 0.092 0.230 0.460 81 2.610 1.560 3.250 0.500 83 0.399 0.305 0.315 0.055 84 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 85 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 86 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 87 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 88 0.418 0.043 0.055 0.025 89 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 91 ＞5 ＞5 ＞5 0.070 93 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 94 ＞5 0.101 95 ＞5 0.310 96 6.365 1.108 1.550 ＞5 97 0.862 0.278 0.345 ＞5 表2：对Cdk的抑制作用：IC50(μM) 化合物 Cdk1/B Cdk2/A Cdk2/E Cdk4D 98 0.442 0.157 0.140 1.050 99 1.810 1.012 0.410 ＞5 100 0.265 0.153 0.415 0.035 102 3.130 3.590 4.500 0.165 103 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 104 ＞5 ＞5 ＞5 0.185 106 0.350 0.440 107 1.728 1.950 1.650 0.019 108 2.425 2.035 3.050 0.067 111 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 113 ＞5 ＞5 ＞5 3.000 114 ＞5 ＞5 ＞5 ＞5 115 0.094 0.022 0.051 0.007 116 ＞5 ＞5 3.750 0.313 117 ＞5 ＞5 4.000 0.076 118 ＞5 ＞5 3.800 0.079 119 ＞5 ＞5 ＞5 1.600 120 ＞5 ＞5 ＞5 1.900 121 ＞5 ＞5 ＞5 0.092
本发明化合物还是生长因子受体酪氨酸激酶FGFr与PDGFr的抑制剂和非受体酪氨酸激酶c-Src的抑制剂。已经经由测量抑制酪氨酸激酶能力的标准测定法评价了若干本发明化合物。这些测定法是如下进行的：
PDGF与FGF受体酪氨酸激酶测定法
小鼠PDGF-β与人FGF-1(flg)受体酪氨酸激酶的全长cDNA是从J.Escobedo获得的，是如J.Biol.Chem.1991；262：1482-1487所述制备的。PCR引物被设计为扩增编码细胞内酪氨酸激酶结构域的DNA片段。将该片段插入杆状病毒载体，用AcMNPV DNA共转染，分离重组病毒。用该病毒感染SF9昆虫细胞，以过度表达蛋白质，使用细胞溶解产物进行测定。测定是在96-孔平板内进行的(100μL/保温/孔)，对条件进行优化，以测量从γ32P-ATP到谷氨酸盐-酪氨酸共聚物底物中的32P掺入。简而言之，向每孔加入82.5μL保温缓冲液，含有25mM Hepes(pH7.0)、150mM NaCl、0.1％Triton X-100、0.2mM PMSF、0.2mM Na3VO4、10mM MnCl2和750μg/mL Poly(4∶1)谷氨酸盐-酪氨酸，然后加入2.5μL抑制剂+5μL酶溶解产物(7.5μg/μLFGF-TK或6.0μg/μL PDGF-TK)，以引发反应。在25℃下保温10分钟后，向每孔加入10mL γ32P-ATP(0.4μCi加50μM ATP)，将样本在25℃下保温另外10分钟。加入含有20mM焦磷酸钠的100μL 30％三氯乙酸(TCA)，使物质沉淀在玻璃纤维垫(Wallac)上，以终止反应。将滤器用含有100mM焦磷酸钠的15％TCA洗涤3次，在Wallac 1250β平板读数器中计数保留在滤器上的放射性。非特异性活性被定义为样本与单独的缓冲液(没有酶)保温之后保留在滤器上的放射性。特异性酶活性(酶加缓冲液)被定义为总活性减去非特异性活性。测定在50μM下的抑制％，关于更有效的化合物，基于抑制曲线测定化合物抑制50％特异性活性的浓度(IC50)。
C-Src激酶测定法
使用定向于c-Src的N-末端氨基酸(氨基酸2-17)的抗肽单克隆抗体从杆状病毒感染的昆虫细胞溶解产物纯化C-Src激酶。向昆虫细胞溶解缓冲液中加入与0.65μm胶乳珠粒共价连接的抗体，该缓冲液包含150mM NaCl、50mM Tris pH7.5、1mM DTT、1％NP-40、2mMEGTA、1mM钒酸钠、1mM PMSF、各为1μg/mL的亮肽素、胃酶抑素和抑肽酶。将含有c-Src蛋白的昆虫细胞溶解产物与这些珠粒在4℃下保温3至4小时，同时旋转。在溶解产物保温结束时，将珠粒在溶解缓冲液中洗涤3次，再悬浮在含有10％甘油的溶解缓冲液中，冷冻。将这些胶乳珠粒融化，在测定缓冲液(40mM Tris pH7.5，5mM MgCl2)中清洗3次，悬浮在相同的缓冲液中。在底部为0.65μmpolyvinylidine膜的Millipore 96-孔平板内加入反应组分：10μLc-Src珠粒、10μL 2.5mg/mL polyGluTyr底物、含有0.2μCi标记的32P-ATP的5μM ATP、含有抑制剂或作为溶剂对照的5μL DMSO和适量缓冲液，使总体积为125μL。在室温下加入ATP开始反应，10分钟后加入125μL30％TCA、0.1M焦磷酸钠，置于冰上达5分钟猝灭。然后过滤平板，小孔用两份250-mL的15％TCA、0.1M焦磷酸盐洗涤。然后冲压滤器，在液体闪烁计数器中计数，检查数据的抑制活性，与已知的抑制剂比较，例如erbstatin。该方法也描述在J.Med.Chem.(药物化学杂志)，1994；37：598-609中。
在上述测定法中评价的代表性本发明化合物的酪氨酸激酶抑制活性见表3。
表3：对酪氨酸激酶的抑制作用：在50μL下的抑制％(如果测定的话，IC50[μM]在括号内)化合物 PDGFr FGFr1 94.4(0.593) 93.79 89.811 (0.131) (0.284)45 21.9 67.446 17.5 19.547 10.555 (0.033) (0.151)70 (0.536) (1.15)80 18.6117 (0.081) (0.061)
如上所述，本发明还提供药物组合物，包含混合有载体、稀释剂或赋形剂的本发明化合物。下列实施例阐述由本发明提供的典型组合物。
实施例144
使用下列成分制备用于口服给药的硬胶囊形式的药物组合物：
量(mg/胶囊)活性化合物 250淀粉粉末 200硬脂酸镁 10总计 460
将上述成分混合，按460mg的量填充在硬胶囊内。典型的活性成分是1-异丁基-3-[2-{(2-氯-4-哌嗪-1-基)-苯氨基}-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲。将该化合物每天给药2至4次，用于治疗术后再狭窄。
实施例144a
用于口服悬液的组合物成分 量1-异丙基-3-[5-甲基-6-溴-2-(3-乙基吡啶 500mg-4-基氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲山梨糖醇溶液(70％NF) 40mL苯甲酸钠 150mg糖精 10mg樱桃矫味剂 50mg蒸馏水适量，加至 100mL
向40mL蒸馏水中加入山梨糖醇溶液，将吡咯并嘧啶悬浮其中。加入糖精、苯甲酸钠和矫味剂，溶解。用蒸馏水调节体积至100mL。每毫升糖浆含有5mg活性成分。
实施例144b片剂，每片含有60mg活性成分活性成分 60mg淀粉 45mg微晶纤维素 35mg聚乙烯吡咯烷酮(10％水溶液) 4mg羧甲基淀粉钠 4.5mg硬脂酸镁 0.5mg滑石 1.0mg总计 150mg
使活性成分、淀粉和纤维素通过No.45目US筛，充分混合。将聚乙烯吡咯烷酮溶液与所得粉末混合，然后通过No.14目US筛。将颗粒在50℃至60℃下干燥，通过No.18目US筛。然后向颗粒加入预先通过No.60目US筛的羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和滑石，混合后在制片机上压制成片，片重150mg。
用于上述制备的典型活性成分是实施例40化合物(化合物12)。这种组合物特别适合治疗糖尿病性视网膜病。
实施例144c
将100mg化合物77溶于250mL 0.9％氯化钠水溶液，调节该溶液的pH至约7.0，制备适合通过注射给药的肠胃外组合物。这种制剂特别适合治疗乳腺癌。
实施例144d
栓剂的制备
将500mg 1-正丁基-3-[2-(4-哌嗪-1-基-苯氨基)-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基]-脲与1500mg可可脂的混合物在60℃下均匀掺合。将混合物在渐细的模具内冷却至24℃。每粒栓剂将重约2g，可以每天给药1至2次，用于治疗病毒感染，例如疱疹和HIV。
实施例144e
局部制剂成分 量(mg)1-环己基-3-{[2-(4-吗啉-1-基-苯氨基)] 20-5，6-二氟-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基}-脲丙二醇 100白矿脂 500鲸蜡硬脂醇 50硬脂酸甘油酯 100PEG 100硬脂酸酯 100Ceteth-20 50磷酸二氢钠 80总计 1000
将本发明化合物与其它成份一起混合均匀，制得粘稠悬浮液。将该悬浮液均匀涂敷到粘合剂衬背的聚合物膜上，并切分成2-英寸方块。该贴剂可施加到患有牛皮癣的患者皮肤上。
实施例144f
缓释制剂
将500mg盐酸7-乙酰氨基-6-溴-2-[4-(2-二乙氨基乙氧基)-苯氨基]吡啶并[2，3-d]嘧啶置于渗透泵片内，对受治疗者口服给药，用于治疗和预防再狭窄。
现已完整、清楚、简洁和准确地描述了本发明和制备与使用它的方式与方法，使所属领域任意技术人员能够制备和使用它。可以理解的是，前文描述本发明的优选实施方式，在其中可以进行改进，而不背离如权利要求所述的本发明的精神或范围。为了明确指出和清楚地要求保护视为发明的主题，下列权利要求总结本说明书。