技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种抗XA21蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
有关水稻抗白叶枯病基因Xa21的工作，最早可以追溯到1977年，当时印度育种 学家S.Devadath等人对非洲马里的长药野生稻(Oryza longistaminata)进行接种测验， 发现该野生稻抗所有测试的白叶枯病菌(Xoo)小种。随后，国际水稻研究所Khush等 人将该野生稻与感病的籼稻栽培品种IR24杂交，经过12年转育，于1990年获得了 以IR24为遗传背景的籼稻近等基因系，命名为IRBB21，Xoo接种鉴定表明，IRBB21 对印度和菲律宾所有的Xoo生理小种都有抗性。遗传分析表明，抗性是由单一遗传位 点决定的，Khush将这一来源于长药野生稻的抗性基因命名为Xa21(Khush G S, Bacalangco E,Ogawa T.A new gene for resistance to bacterial blight from O. longistaminate.Rice Genet News lett,1990,7:121-122.)。
由于Xa21具有广谱抗病的特点，所以吸引了分子遗传学家的目光。作为育种学 家的Khush将这份重要的水稻材料提供给了美国康奈尔大学的Tanksley教授。当时在 Tanksley实验室的博士后Pamela Ronald等开始了Xa21的定位工作。1995年，宋文源 等在美国加州大学戴维斯分校Pamela Ronald实验室并与中科院遗传所等单位合作， 克隆了Xa21基因，序列分析发现，该基因编码类受体激酶，其预测的胞外结构域为 富含亮氨酸的拉链结构(Lesine-rich repeat,LRR)，其胞内区为丝/苏氨酸蛋白激酶(Song WY,Wang GL,Chen LL,Kim HS,Pi LY,Holsten T,Gardner J,Wang B,Zhai WX,Zhu LH, Fauquet C,Ronald P.A receptor kinase-like protein encoded by the rice disease resistance gene,Xa21.Science.1995 270(5243):1804-6.)。由于Xa21对白叶枯病的广谱抗性及结 构特点，该基因在水稻育种中有重要的应用价值，其机理研究也具有重要的理论意义。 通过传统的回交转育策略，Xa21已经被导入多个常规水稻品种中(翟文学,李晓兵,田 文忠,周永力,潘学彪,曹守云,赵显峰,赵彬,章琦,朱立煌.由农杆菌介导将白叶枯 病抗性基因Xa21转入我国的5个水稻品种.中国科学(C辑),2000,43(4):361-368. 吴家道,杨剑波,许传万,李莉,向太和,倪大虎,汪秀峰,贾士荣,唐益雄,张世平, Fauquet C M.水稻抗白叶枯病基因Xa21转基因水稻及其杂交稻研究.作物学报,2001, 27(1):29-34.赵显峰,翟文学,李平,王春连,潘学彪,钱前,李世贵,朱立煌.不同 Xa21转基因杂交稻组合的大田试验与分析.作物学报,2002,28(4):521-527.)，所以， 检测鉴定水稻材料中的Xa21具有重要的应用价值。由于Xa21的序列已知，用PCR 扩增的方法可以方便地检测Xa21的存在与否，但这种基于DNA的扩增并不能了解 XA21蛋白质的表达与否及表达的时空特性，所以制备抗XA21蛋白质的抗体，建立 基于免疫学的方法具有重要的现实意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗XA21蛋白的单克隆抗体及其应用。
本发明所提供的抗XA21蛋白的单克隆抗体具体由杂交瘤细胞系60632-18分泌产 生。杂交瘤细胞系60632-18，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登 记入册编号为CGMCC No.10416。
上述分泌抗XA21蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系60632-18也属于本发明的保 护范围。
将所述单克隆抗体用标记物进行标记后形成的标记抗体也属于本发明的保护范 围。
其中，所述标记物可为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、异硫氰酸荧光素、 荧光染料Cy3、荧光染料Cy5、磁珠或琼脂糖。
所述杂交瘤细胞系60632-18CGMCC No.10416或所述单克隆抗体或所述标记抗 体在如下(a1)-(a4)任一中的应用也属于本发明的保护范围：
(a1)检测或辅助检测待测样品中是否含有水稻XA21蛋白；
(a2)从含有水稻XA21蛋白的样品中富集或分离水稻XA21蛋白；
(a3)通过与水稻XA21蛋白结合形成复合物用于对所述XA21蛋白的结构和/或 功能进行分析；
(a4)通过与水稻XA21蛋白结合形成复合物。
在所述(a1)中，所述检测的方法包括但不限于利用所述单克隆抗体直接和抗原 结合的酶联免疫吸附检测(ELISA)、免疫印迹(Western Blot)、流式细胞术(FACS)、 免疫组织化学(IHC)检测或者免疫PCR检测方法。在所述检测中，所述单克隆抗体 可单独或与通过化学键偶联，静电吸附或者亲疏水性吸附，而连接缀合物包括辣根过 氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶(AP)，生物素(Biotin)，异硫氰酸荧光素(FITC)， Cy3、Cy5、磁珠和琼脂糖等缀合物连接。
在所述(a2)中，所述分离的方法包括但不限于利用琼脂糖免疫、免疫磁珠吸附 或流式细胞术完成生物分离方法或阳性细胞分选。
在所述(a3)中，是通过将所述单克隆抗体或将所述抗体的重链与轻链可变区序 列经重组表达后制备的工程抗体与所述水稻XA21蛋白形成稳定复合物的晶体结构， 进而实现对水稻XA21蛋白的激酶区结构进行研究。
本发明的另一个目的是提供一种检测或辅助检测水稻XA21蛋白的试剂盒。
本发明所提供的检测或辅助检测水稻XA21蛋白的试剂盒中含有独立包装的所述 单克隆抗体或所述标记抗体。
所述试剂盒中还可含有独立包装的水稻XA21蛋白标准品。
所述水稻XA21蛋白的氨基酸序列如序列表中序列7所示。
本发明还保护一种更大范围的抗水稻XA21蛋白的抗体。
该抗水稻XA21蛋白的抗体，由重链和轻链组成，所述重链可变区的氨基酸序列 如序列表中序列3所示；所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中序列4所示。
进一步，所述抗体的重链恒定区的亚型为IgG1a；所抗体的轻链恒定区的亚型为 κ轻链。
所述抗体由杂交瘤细胞系60632-18CGMCC No.10416分泌产生。
编码所述抗体的基因也属于本发明的保护范围。
在所述抗体的编码基因中，所述重链可变区的编码基因具体如序列表中序列5所 示；所述轻链可变区的编码基因如序列表中序列6所示。
含有所述基因的重组载体、重组菌、重组细胞系、重组病毒或表达盒也属于本发 明的保护范围。
本发明的优点及有益效果:
(1)本发明获得的Xa21单克隆抗体，能识别重组XA21蛋白，具有检测多种转 基因植物的XA21蛋白的特性，具有广阔的用途。
(2)本发明获得的Xa21单克隆抗体为一种IgG1a类抗体，与XA21蛋白的结合 有极强特异性和敏感性，ELISA方法的最低检测限为4ng，采用免疫印迹法检测时其 检测灵敏度为30ng)。
(3)可对常规及转基因水稻中的XA21蛋白含量进行定量分析。
(4)本发明获得的Xa21单克隆抗体可独立或与生物素、辣根过氧化物酶、碱性 磷酸酶等偶联，用于WB、双抗体夹心ELISA、间接ELISA、免疫组织化学、免疫PCR 等方法对转基因生物进行检测和筛查，特异性和灵敏度高，具有很高的使用价值。
(5)本发明的Xa21单克隆抗体可以通过与琼脂糖、磁珠结合，进行生物样本的 亲和富集和分离。
(6)通过将本发明的Xa21单克隆抗体与FITC、Cy3、Cy5等荧光分子偶联，用 于转基因细胞的流式细胞术分析与分选，进而完成qPCR、ELISpot或单细胞分析。
保藏说明
参据的生物材料(株)：60632-18
科学描述：杂交瘤细胞系
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015年3月31日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.10416
附图说明
图1为XA21激酶区蛋白质(XA21K)在大肠杆菌中的表达。M：分子量标记； 0h：是诱导前的全菌超声蛋白质样品；S：诱导表达细菌超声破碎离心的上清样品。P： 诱导表达细菌超声破碎离心的沉淀样品。
图2为本发明杂交瘤细胞系60632-18CGMCC No.10416分泌的单克隆抗体检测重 组的XA21K蛋白质。M：分子量标记，上样量：泳道1-4上样量分别为150、30、6 和1.2ng。
图3为用纯化后的本发明杂交瘤细胞系60632-18CGMCC No.10416分泌的单克 隆抗体检测水稻叶片样本。M：分子量标记；4021和CX6221b为带有XA21的水稻材 料，TP309和MH86为不带有XA21的水稻材料；XA21：全长的XA21蛋白质；HSP： 用抗HSP抗体检测作为上样量的内参。
图4为双抗体夹心ELISA方法检测XA21蛋白的标准曲线图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
pGTK载体：该载体由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供，参见“Liu,G.Z., Pi,L.-Y.,Walker,J.C.,Ronald,P.C.,and Song,W.-Y.Biochemical characterization of the kinase domain of the rice disease resistance receptor-like kinase XA21.J.Biol.Chem. 2002.277,20264–20269.”。
水稻品种4021：由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供，参见“史佳楠,李 莉云,徐文静等.八个WRKY转录因子在水稻叶片生长和抗病过程中的表达研究.植 物病理学报.2014,44(1):54-64.”。
水稻品种CX6221b(或称D62B-Xa21)：由中国科学院遗传与发育生物学研究所 提供，参见“Gao L,Xia Z,Jiang G,Peng H,Zhao X,Zhai W.Generation of marker-free, bacterial blight-resistant transgenic sterile line and hybrid rice with Xa21.Plant Breeding, 2011,130:438-443.”。
水稻品种TP309：可从商业渠道获得。“严礼.农杆菌抗虫基因重组质粒构建及其 对水稻TP309的转染研究.湖南师范大学,2008年硕士论文”一文中也有记载。
水稻品种MH86：可从商业渠道获得。“苏军,宋亚娜,姚玉仙等.转CryIAb水稻 在不同生长条件下的适合度.分子植物育种，2013年04期”一文中也有记载。
下述实施例中ELISA检测中所用到的各溶液配方具体如下：
包被缓冲液：将Na2CO31.59g，NaHCO32.93g溶于水，用水定容至1L，调节pH 值为9.6。
封闭液：含20g/L牛血清白蛋白(BSA)的磷酸盐缓冲液。其中，磷酸盐缓冲液 的配方为：将NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO41.15g，KCl 0.2g，溶于水中，用 水定容至1L；pH值为7.4。
洗涤缓冲液：含有体积分数0.05％的吐温20的磷酸盐缓冲液。其中，磷酸盐缓冲 液的配方为：将NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO41.15g，KCl 0.2g，溶于水中，用 水定容至1L，调整pH值为7.4。
底物缓冲液：pH5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液，配制方法为：
A液：0.1mol/L柠檬酸(C6H8O7·H2O)，即称取柠檬酸19.2g，定容至1000mL；B 液：0.2mol/L磷酸氢二钠(Na2HPO4)，即称取磷酸氢二钠71.7g，定容至1000mL。使 用时，取A液24.3mL，B液25.7mL，加水至100mL，即为底物缓冲液。
显色缓冲液：取50μL TMB(10mgTMB溶于1mL DMSO中)溶液+10mL底物缓 冲液+10μL 30％(v/w)过氧化氢，混匀。
终止液：2M H2SO4缓冲液。
实施例1、小鼠杂交瘤细胞系60632-18的获得
一、重组XA21激酶区蛋白质(重组XA21K蛋白)的制备
XA21K蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示，其编码基因如序列表中序列2 所示。
1、重组表达载体的构建
将XA21K克隆到表达载体pGTK中构建表达克隆pGST-XA21K，重组表达载体 pGST-XA21K及其具体过程参见文献Liu,G.Z.,Pi,L.-Y.,Walker,J.C.,Ronald,P.C.,and Song,W.-Y.Biochemical characterization of the kinase domain of the rice disease resistance receptor-like kinase XA21.J.Biol.Chem.2002.277,20264–20269.
重组表达载体pGST-XA21K携带有序列表中序列2所示的XA21K基因，可表达 序列表中序列1所示的XA21K蛋白。
2、蛋白表达和纯化
将步骤1获得的重组表达载体pGST-XA21K转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态， 获得重组菌。过夜培养，然后按1:100(体积比)的比例将单菌落培养的过夜菌悬液转 接至100ml LB培养基，加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素，37℃振荡培养至OD600 为0.6～0.8。加入0.1mol/L的IPTG，25℃震荡培养8h，收菌后超声破碎，12000rpm 离心20分钟，分别收集沉淀(包涵体)和上清，进行SDS-PAGE，检测重组XA21K 蛋白的表达情况。
结果如图1所示。由图可见，重组XA21K蛋白在细菌上清中的表达量较高，在 预计的分子量位置(约60kDa)有明显的蛋白条带。
该重组蛋白带有GST标签，使用GST Resin进行蛋白质的亲和纯化，纯化后的重 组XA21K蛋白的纯度在90％以上，浓度约为1.5-2mg/mL，可以满足免疫动物和抗体 筛选与鉴定的要求。
二、动物免疫
第一次免疫：将步骤一获得的重组XA21K蛋白用弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳 化，其中XA21蛋白和弗氏完全佐剂的体积配比为1：1，乳化完全后免疫4-6周龄雌 性Balb/c小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹部皮下注射每只小鼠6 点，剂量为60μg/只(以重组XA21K蛋白质量计)。
第二次免疫：第一次免疫14天后，将步骤一获得的重组XA21K蛋白使用弗氏不 完全佐剂(Sigma公司)乳化，其中重组XA21K蛋白和弗氏非完全佐剂的体积配比为 1：1)，乳化完全后进行腹部皮下注射每只小鼠3点，剂量为30μg/只(以重组XA21K 蛋白质量计)。
第三次免疫：第二次免疫14天后，用不含佐剂的重组蛋白加强免疫一次，进行腹 部皮下注射每只小鼠6点，剂量为50μg/只(以重组XA21K蛋白质量计)。
第四次免疫：第三次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清 中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，将步骤一获得的重 组XA21K蛋白用生理盐水混匀，剂量为50μg/只(以重组XA21K蛋白质量计)。
上述间接ELISA法测定血清效价的步骤具体如下：
1)包被：在96孔酶标板中加入100μL浓度5μg/ml的重组XA21K蛋白(溶剂为 包被缓冲液)，37℃孵育2小时，用洗涤缓冲液洗涤3次。
2)封闭：用封闭液封板，37℃孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤3次。
3)加待测样本：将100μL按一定比例稀释的待测的免疫后小鼠血清样本加至酶 标板中，置湿盒中37℃条件下2小时，洗板4次。同时设置以未经免疫的小鼠血清作 为待测样品的对照孔。
4)加酶标抗体：将HRP标记的羊抗鼠抗体(北京中杉金桥，货号：PV-6002)稀 释1000倍，每孔加100μL，置湿盒中37℃条件下2小时，用洗涤缓冲液洗板3次。
5)显色：每孔加入100μL显色缓冲液，室温避光显色5分钟，每孔加入50μL终 止液终止显色。
6)读数：以450nm单波长测定各待测孔OD值，以与阴性对照孔(以未经免疫 的小鼠血清作为待测样品的对照)OD值的比值(P/N)大于2.1为限，作为判断血清 效价的临界点。ELISA结果判定方法：效价用P/N>2.1的血清的最大稀释倍数表示。
三、细胞融合
无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，将小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0 (ATCC Number CRL-1581)以5:1的数量比混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离 心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(Roche公司)，并搅动 细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM(Sigma公司)，混匀，离心 1000rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来， 并加入5ml混合10×HAT(Sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1％ (2.1g/100ml)甲基纤维素(Sigma公司)的IMDM 1640半固体培养基。充分混匀， 然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％CO2培养箱中培养。融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大 的克隆团接入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃5％CO2培养箱中培养。
四、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞
3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μl上清进行ELISA筛选。阳性克隆完全 换液，加入200μl含1×106细胞/mL杂交瘤饲养细胞和1％(1g/100ml)HT(Sigma 公司)的IMDM 1640完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事 先准备好的培养基(含1×106细胞个/mL杂交瘤饲养细胞和1％(1g/100ml)HT的IMDM 培养基)的24孔板培养。五天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐 次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。
上述ELISA法筛选阳性细胞的步骤具体如下：
1)包被：在96孔酶标板中加入100μL浓度为5μg/ml的重组XA21K蛋白(溶剂 为包被缓冲液)，37℃孵育2小时，用洗涤缓冲液洗涤3次。
2)封闭：用封闭液封板，37℃孵育30min，用洗涤缓冲液洗涤3次。
3)加待测样本：将100μL待测的杂交瘤细胞培养液加至酶标板中，置湿盒中37℃ 条件下2小时，洗板4次。同时设置以sp2/0细胞培养上清代替待测样品的对照孔。
4)加酶标抗体：将HRP标记的羊抗鼠抗体(北京中杉金桥，货号：PV-6002稀 释1000倍，每孔加100μL，置湿盒中37℃条件下2小时，用洗涤缓冲液洗板3次。
5)显色：加入显色缓冲液，加入到酶标板孔中，每孔100μL，室温避光显色5分 钟，加入50μL终止液终止反应。
6)读数：以450nm单波长测定各待测孔OD值，以与阴性对照孔(以SP2/0细 胞培养上清代替待测样品的对照)OD值的比值(P/N)大于2.1为限，作为判断为阳 性的临界点。ELISA结果判定方法：若P/N>2.1，则判别为阳性细胞。
经ELISA法筛选，3次亚克隆化获得了1株能稳定分泌抗XA21蛋白的单克隆抗 体的杂交瘤细胞系，命名为60632-18。该小鼠杂交瘤细胞系已于2015年3月31日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为 CGMCC No.10416。
实施例2、单克隆抗体的制备及特性鉴定
一、单克隆抗体的制备
将处于对数生长期的杂交瘤细胞系60632-18CGMCC No.10416用无血清培养基 洗涤并悬起，计数5×105/1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后 开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于 离心管中，4℃或-20℃保存。采用ELISA法对腹水进行效价测定，具体操作参见实施 例1步骤四中“ELISA法筛选阳性细胞”，其中步骤6)为：以450nm单波长测定各 待测孔OD值，以与阴性对照孔(以SP2/0细胞培养上清代替待测样品的对照)OD值 的比值(P/N)大于2.1为限，作为确定效价的临界点。ELISA结果判定方法：效价用 P/N>2.1的细胞培养液上清的最大稀释倍数表示。实验重复三次。
结果显示，分泌抗XA21蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系60632-18，其腹水的 抗体效价为1：106。
二、单克隆抗体的纯化
用HiTrap rProtein A FF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。 SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。
三、单克隆抗体亚类鉴定
用100mM PBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司) 至0.5μg/ml，每孔加100μl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％(体积分数)的Tween20 的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200μl封闭液(配方：含2％(2g/100ml)BSA和 3％(3g/100ml)蔗糖的PBS)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加 入0.1ml步骤二纯化后的杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用 封闭液1：1000(体积比)稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ)抗体(Jackson公司产品) 或1：2000(体积比)稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3， IgA)抗体(Southern Biotech公司)，0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。 倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μl含0.15％ABTS(Southern Biotech公司) 和0.03％(体积分数)H2O2的柠檬酸缓冲液(pH4.0)进行显色反应，10-20min内测 定405nm波长下的OD值。
结果显示，本发明的杂交瘤细胞系60632-18CGMCC No.10416分泌的单克隆抗体 为IgG1a型鼠源单克隆抗体，其轻链为κ轻链。
四、亲和常数测定
包被实施例1步骤一制备的重组XA21K蛋白，包被浓度为2μg/ml，100μl/孔，4 ℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。步骤 二中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵 育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠抗体(北京中杉金桥，货号：PV-6002)1： 20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1％ (0.1g/100ml)TMB(Sigma公司)和0.03％(体积分数)H2O2的柠檬酸-磷酸缓冲液 显色10min，加50μl 0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。 画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。 利用下列公式计算出亲和常数。重复测定三次，结果取平均值。
亲和常数≈(150000×A)/抗体原始浓度
结果显示，本发明杂交瘤细胞系60632-18CGMCC No.10416分泌的单克隆抗体的 亲和常数高达9×108L/mol。
五、单抗反应检测
取实施例1步骤一制备的重组XA21K蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的杂 交瘤细胞系60632-18CGMCC No.10416分泌的单克隆抗体的识别特性。免疫印迹实验 过程如下：将不同浓度的重组XA21K蛋白进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方 法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司)。将膜 置于含5％(5g/100ml)脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入纯化后的杂交瘤细 胞系60632-18CGMCC No.10416分泌的的单克隆抗体(1：1000体积比稀释，稀释后 抗体的浓度约为1μg/mL)4℃孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1：5000体积比稀释 的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1小时。再次TBST洗膜， 加入ECL超敏显色液(北京普利莱基因技术有限公司)，以ChemiDoc MP多色荧光成 像系统(Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集。
结果如图2所示，由图可知，利用免疫印迹的方法，本发明杂交瘤细胞系60632-18 CGMCC No.10416分泌的单克隆抗体可以识别约30ng的重组XA21蛋白(目的条带大 小约为60kD，与预期结果一致)。
六、抗体的可变区序列测定
培养新鲜的杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证，证实用于克隆的细胞株 的确能分泌需要的抗体，结果确认后，离心收集106以上杂交瘤细胞。Trizol法提取杂 交瘤细胞总RNA，取9μL总RNA，加入2.5μL oligo(dT)12–18primer(10mM)，及5μL dNTPs，混合均匀，70℃保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变 性操作。随后加入5μL RT buffer(5X)，2.5μL DTT(0.1M)及1μL逆转录酶，42℃ 反应1小时。70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20℃。将获得的第 一链cDNA进行PCR扩增，在50μL反应体系中加入引物各25pmol，重链可变区和 轻链可变区扩增用引物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》(科学出版社，2005年 出版)一书中鼠单抗引物序列设计和合成。用于扩增重链可变区的引物如下，其中 MHV.B1直至MHV.B12的11条引物为上游引物，可分别与重链下游引物MHC.F组合 用于扩增重链可变区基因。
MHV.B1：5’-GATGTGAAGCTTCAGGAGTC-3’
MHV.B2：5’-CAGGTGCAGCTGAAGGAGTC-3’
MHV.B3：5’-CAGGTGCAGCTGAAGCAGTC-3’
MHV.B4：5’-AGGTTACTCTGAAAGAGTC-3’
MHV.B5：5’-GAGGTCCAGCTGCAACAATCT-3’
MHV.B6：5’-GAGGTCCAGCTGCAGCAGTC-3’
MHV.B7：5’-CAGGTCCAACTGCAGCAGCCT-3’
MHV.B8：5’-GAGGTGAAGCTGGTGGAGTC-3’
MHV.B9：5’-GAGGTGAAGCTGGTGGAATC-3’
MHV.B10：5’-GATGTGAACTTGGAAGTGTC-3’
MHV.B12：5’-GAGGTGCAGCTGGAGGAGTC-3’
MHC.F：5’-GGCCAGTGGATAGTCAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC-3’
用于扩增轻链可变区的引物如下，其中MKV.B1直至MKV.B10的10条引物为上 游引物，可分别与轻链下游引物MKC.F组合用于扩增Kappa轻链的可变区基因。
MKV.B1：5’-GATGTTTTGATGACCCAAACT-3’
MKV.B2：5’-GATATTGTGATGACGCAGGCT-3’
MKV.B3：5’-GATATTGTGATAACCCAG-3’
MKV.B4：5’-GACATTGTGCTGACCCAATCT-3’
MKV.B5：5’-GACATTGTGATGACCCAGTCT-3’
MKV.B6：5’-GATATTGTGCTAACTCAGTCT-3’
MKV.B7：5’-GATATCCAGATGACACAGACT-3’
MKV.B8：5’-GACATCCAGCTGACTCAGTCT-3’
MKV.B9：5’-CAAATTGTTCTCACCCAGTCT-3’
MKV.B10：5’-GACATTCTGATGACCCAGTCT-3’
MKC.F：5’-GGATACAGTTGGTGCAGCATC-3’
其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板1μL和1U热启动Taq DNA聚合酶。设置PCR扩增程序为94℃40秒，52℃40秒，72℃40秒，进行20至25 个循环，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μL PCR产物 进行电泳分析，在1.5％琼脂糖凝胶上分离切胶回收，将所得重链可变区和轻链可变 区分别克隆至T载体测序。
结果显示，本发明杂交瘤细胞系60632-18CGMCC No.10416分泌的的单克隆抗体 的重链可变区的编码序列如序列表中序列5所示，编码序列表中序列3所示的重链可 变区；轻链可变区的编码序列如序列表中序列6所示，编码序列表中序列4所示的轻 链可变区。
实施例3、本发明制备的单克隆抗体在免疫学检测中的应用
检测本发明杂交瘤细胞系60632-18CGMCC No.10416分泌的单克隆抗体在检测 转基因水稻中是否表达XA21蛋白中的应用效果。XA21蛋白的氨基酸全序列如序列 表中序列7所示；对应的编码基因如序列表中序列8所示。
供试水稻：水稻品种4021和CX6221b，已知这两种水稻表达XA21蛋白。
水稻品种TP309和MH86，已知这两种水稻不表达XA21蛋白。
1、前处理供试水稻获得待测样品
将冻存于-70℃的水稻样品(叶片)用高通量组织研磨仪(北京鼎昊源科技有限公 司，TL2010)或手工充分研磨成细粉状，加入蛋白质提取液(配方：62.5mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)；10％(体积分数)甘油；0.1％(v/w)SDS；2mmol/L EDTA；1mmol/L PMSF； 5％β-巯基乙醇)，混匀冰上放置30min，12000rpm 4℃离心20min，取上清即为总蛋 白质。
2、免疫印迹法检测待测样品
参照实施例2步骤五进行。同时设置HSP作为内参，抗内参HSP的一抗为北京 华大蛋白质研发中心有限公司公司产品)；二抗为羊抗鼠抗体(北京中杉金桥，货号： PV-6002)。
结果如图3所示，由图可见，水稻品种4021和CX6221b检测到了大小约为120kD 的目的条带，与预期的XA21蛋白大小一致；而水稻品种TP309和MH86没有检测到 目的条带。可见用本发明杂交瘤细胞系60632-18CGMCC No.10416分泌的单克隆抗体 可以检测转基因水稻中的XA21蛋白。
实施例4、双抗体夹心ELISA方法检测转基因植物
一、试剂盒的组成
本发明的双抗夹心ELISA试剂盒包括Xa21蛋白标准品(实施例1制备的重组 XA21K蛋白)、包被于酶标板的经酶(辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP))标记 的另一株Xa21单克隆抗体(北京华大蛋白质研发中心有限公司的Xa21单克隆抗体 B71769-3)，由实施例2制备的由小鼠杂交瘤细胞系60632-18CGMCC No.10416分泌 的单克隆抗体，其他辅助试剂包括样本稀释液、封闭液、显色液及终止液。
经辣根过氧化物酶标记的Xa21检测抗体的制备方法：
1、称取6mg HRP(辣根过氧化物酶，购自于Sigma)溶于1mL三蒸水中，每mL 溶液逐滴缓慢加入0.30mL新配的0.1M NaIO4溶液，4℃避光搅拌35min，活化HRP， 颜色由棕色变为绿色。上述溶液装入透析袋中，用0.01M，pH为4.4的醋酸钠缓冲液， 4℃透析过夜，颜色变为棕绿色。观察是否有沉淀，并分析沉淀性状，10000r/min，4℃， 10min，离心去除沉淀。得到透析后的HRP。
2、将实施例2制备的由小鼠杂交瘤细胞系60632-18CGMCC No.10416分泌的单 克隆抗体用0.05M，pH为9.5的碳酸缓冲液4℃透析过夜。观察是否有沉淀，并分析 沉淀性状，10000r/min，4℃，10min，离心去除沉淀，得到透析后的抗体。
3、将透析后的HRP加入0.16M乙二醇(每mg酶加0.1mL)，4℃避光搅拌1h， 然后加入透析后的抗体；两者混匀后用0.05M，pH为9.5的碳酸缓冲液4℃透析过夜， 得到HRP-抗体混合液。
4、向HRP-抗体混合液中加入0.1mL的5mg/mL NaBH4溶液(每mg酶加0.1-0.2mg 的NaBH4)，4℃避光搅拌3h。逐滴加入等体积饱和硫酸氨，4℃避光搅拌2h。4℃， 10000rpm离心10min，弃上清。PBS溶解沉淀，得到经辣根过氧化物酶标记的Xa21 检测抗体。
二、Xa21蛋白含量的检测方法
1、以包被缓冲液包被Xa21的捕获抗体B71769-3(北京华大蛋白质研发中心有限 公司产品)(2μg/mL)，作为捕获抗体，在96孔酶标板中每孔加入100μL，4℃包被12h， 使其与酶标板紧密结合。
2、包被后用洗涤液(PBST)洗板6次，每孔再加300μL的2％(v/w)牛血清蛋 白作为封闭液，37℃温育3h。封闭结束在酶标板孔内加入待测植物蛋白提取液(以待 测样品与PBS缓冲液的体积比为稀释倍数)和Xa21蛋白标准品(每孔5μg/mL，以 1:5梯度稀释到10pg/mL，每个样品做三个重复)，100μL/孔，37℃孵育1h。
3、接着加入步骤一制备的辣根过氧化物酶标记的抗Xa21检测抗体，100μL/孔， 37℃孵育1h。
4、最后在形成的复合物中加入显色剂TMB溶液，每孔100μL，室温孵育3min， 在辣根过氧化物酶作用下，显色剂发生颜色变化，加入2M，H2SO4，50μL/孔终止反 应，根据OD450值大小判定样品中Xa21蛋白的存在与否及浓度大小。
结果判定：以Xa21蛋白标准品的浓度取对数做横坐标，OD450值为纵坐标制作标 准曲线(图4)，得到计算公式，根据待测样品的OD450值计算待测样品中的Xa21的 含量。
图4中，横坐标为从5μg/mL开始进行5倍连续稀释的Xa21蛋白标准品浓度，纵 坐标为OD450的读数值。在确定最低检测限时，以空白值(Xa21蛋白标准品的浓度 为0ng/ml的孔的OD450值)的平均值加三倍标准差SD，即空白值平均 +3SD＝0.069+3×0.024＝0.140，此OD值对应Xa21浓度约为4ng/ml，以此确定该方法的 最低检测限为4ng/mL。