技术领域
本发明涉及菌种保存领域，特别涉及一种大白菜根肿病菌的保存 方法。
背景技术
菌种的保存是病菌致病性以及分子生物学研究的基础工作，每一 类型的菌种都具有不同的特性，如果连续不断地培养传代，将花费大 量的人力、财力，同时在多种理化和生物学因素的影响下，会使菌种 生物学特性发生变化，甚至可能会失去毒力，还有可能会致使生物学 特性发生变异，因此，只有使菌种能够长时间的保持原有的生命力、 优良的生产性能，并使其遗传性状从分离时或从实验开始就一直保持 不变，才能更好的进行菌源的致病性和分子生物学实验。由于大白菜 根肿菌是寄生于十字花科蔬菜根部的严格的专性寄生菌，不能进行人 工离体培养，对利用分子生物学研究其致病机理带来很大困难。开展 大白菜根肿病病菌及寄主病原互作的各类相关研究都必须用纯化的 代表不同地域的病原小种做试材，因此如何保存大白菜根肿病病原菌 并保持其致病性就显得十分重要。
大白菜根肿病是一种世界性的土传病害，由芸薹根肿菌 (Plasmodiophora brassicae Woron.)侵染引起，任何十字花科植物的 感病品种都能被该病侵染。在欧洲、北美和亚洲的日本等地已成为一 种主要病害，给十字花科蔬菜生产造成了严重的威胁，在加拿大等十 字花科作物栽培大国，也已成为一种新流行的病害，现全世界均有分 布，尤以温带地区发生更为严重。根肿病在中国大部分省、市、自治 区都有分布，特别是近年来，根肿病在我国的东北地区、西南地区、 长江中上游地区、山东青岛以及河南新野等地迅速扩大，危害十分严 重，制约着我国十字花科蔬菜产业的发展。根肿病一直是国内外学者 研究的热点，经过几十年的不懈努力，在根肿菌分类地位、根肿菌生 理小种分化、病原菌检测技术、病原菌有效接种技术、病原菌生活史 与生物学特性、根肿病防治等方面已取得突破性进展。
由于大白菜根肿菌是寄生于十字花科蔬菜根部的严格的专性寄 生菌，不能进行人工离体培养，给从分子生物学角度研究其致病机理 带来很大困难。常用的根肿病病原菌保存方法是：取新鲜的膨大根瘤， 洗净后密封保存于-20℃冰箱，这种保存方法存在三个问题：1.需要 -20℃低温条件，不利于不同国家和地区之间病原菌交流与共享；2.经 常取用，造成频繁冻融，易导致病菌生物学特性发生变化或者产生突 变，造成致病力严重下降，半年后致病力严重下降。3.新鲜肿根体积 较大，常温下容易腐烂发臭，低温保存冰箱容积有限。
发明内容
为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种大 白菜根肿病菌的保存方法，利用冷冻真空干燥法对新鲜菌根进行冷冻 干燥处理，经过此法处理的菌根可在常温下进行长期保存，无需低温 保存条件，可以制成粉末状减少体积便于携带保存，取用方便，从而 使病原菌在不同地方之间的交流变得简单化。
为达到上述目的，本发明的技术方案为：
一种大白菜根肿病菌的保存方法，本发明的技术方案为：样本采 集、清洗去杂质、分割切片、预冷、真空干燥、磨碎制粉、干燥保存。
包括如下步骤：
步骤一、将采集的新鲜大白菜根肿菌发病菌根用无菌水清洗后沥 干，切成薄片置于自封袋中；
步骤二，于－20℃条件下预冻处理24小时；
步骤三、取出在零度以下的真空冷冻干燥机内真空干燥48小时；
步骤四、取出后迅速磨碎制成根肿菌干粉，菌粉粒度约50-100 目，分装到小型自封袋中，每个包装约10-30克，密闭，在室温条件 下进行保存。
进一步的，所述步骤一中，薄片厚度不大于2mm。
进一步的，所述步骤三中，真空干燥压力为2-8pa。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明利用冷冻真空干燥法对新鲜菌根进行冷冻干燥处理，经过 此法处理的菌根可在常温下进行长期保存，无需低温保存条件，可以 制成粉末状减少体积便于携带，从而使病原菌在不同地方之间的交流 变得简单化。保持了菌根的高致病性，同时又减轻了90％的重量。
附图说明
图1是同等室内栽培条件下，同样材料，采用常规新鲜菌液接种 和菌粉接种方法大白菜的发病情况示意图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细 说明：
一种大白菜根肿菌离体保存方法，它包括大白菜根肿菌的保存处 理方法及条件、保存后病菌的致病性测定等过程。本发明的方法是将 大白菜根肿菌发病菌根切成片状置于自封袋中，预先在－20℃条件下 预冻处理24小时，然后在真空冷冻干燥机内真空干燥48小时，取出 后迅速磨碎制成根肿菌干粉，室温条件下进行保存。称取1g采用该 冷冻干燥方法保存的根肿菌干粉，加100ml蒸馏水制成根肿菌悬浮 液，以豫新55大白菜为实验材料，选取蘸根法来接种大白菜幼苗30 株，共计三个重复，同时以蘸根法接种新鲜肿根制成的悬浮孢子液(浓 度为l.5×108孢子/ml)作为对照，接种后40天进行调查，发病率均为 100％，根肿级别均为7级(最高级别)，表明冻干的菌根同新鲜的肿 根一样都保持了极高的致病力。
试验例1：
称取1g采用该冷冻干燥方法保存的根肿菌干粉，加100ml蒸馏 水制成根肿菌悬浮液，以豫新55大白菜为实验材料，选取蘸根法来 接种大白菜幼苗30株共计三个重复，同时以蘸根法接种新鲜肿根制 成的悬浮孢子液(浓度为l.5×108孢子/ml)作为对照，接种大白菜幼 苗30株共计三个重复，接种后40天进行调查，结果如表1：
表1 菌液接种法与菌粉接种法接种调查数据统计(结果一致)
备注：7级为大白菜根肿病发病最为严重。
如表1所示：发病率均为100％，根肿级别均为7级(最高级别)， 表明冻干的菌根同新鲜的肿根一样都保持了极高的致病力。
试验例2：
如图1所示：是同等室内栽培条件下，同样材料，采用常规新鲜 菌液接种和菌粉接种方法大白菜的发病情况，两种接种发病情况完全 一致。表明本大白菜根肿病菌的保存方法是可靠的，表明冻干的菌根 同新鲜的肿根一样都保持了极高的致病力。
经冷冻干燥(冻干)的根肿菌粉不仅便于携带、保存、运输及不 同地方之间病原菌研究的交流与共享，而且保持了菌根的高致病性， 同时又减轻了90％的重量，保证其在运输、携带期间不会进一步腐烂 变坏，实现常温下离体保存病原菌的目的。
采用本发明的方法适于大白菜根肿菌的室温离体保存，可以从根 本上解决大白菜根肿菌离体保存依赖于－20℃条件及长期保存致病 力下降严重的问题。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并 不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在 本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书 所限定的保护范围为准。