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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710374342.3 (22)申请日 2017.05.24 (71)申请人 袁隆平农业高科技股份有限公司 地址 410125 湖南省长沙市芙蓉区远大二 路马坡岭农业高科技园内 申请人 中国科学院亚热带农业生态研究所 湖南亚华种业科学研究院 (72)发明人 杨远柱李兰英周延彪毛东海 王凯陈彩艳 (74)专利代理机构 长沙星耀专利事务所(普通 合伙) 43205 代理人 宁星耀 (51)Int.Cl. C12Q 1/68(2006.01) (54)发明名称 水稻籽粒镉含量相关。
2、基因qGCd2的分子标记 的应用 (57)摘要 本发明公开了水稻籽粒镉含量相关基因 qGCd2的分子标记的应用， 该应用具体可为分子 标记R2ID3116在鉴定或辅助鉴定水稻籽粒镉含 量中的应用。 利用分子标记R2ID3116对水稻亲本 或杂交后代的基因组DNA进行PCR扩增和琼脂糖 凝胶电泳检测， 凡检测到PCR扩增产物大小为 148bp的待测水稻籽粒镉含量均低于PCR扩增产 物大小为183bp的待测水稻籽粒镉含量。 实验证 明， 100的PCR扩增产物大小为148bp的水稻籽 粒镉含量均低于2.0mg/kg， 94的PCR扩增产物 大小为183bp的水稻籽粒镉含量均高于4.0mg/ kg，。
3、 说明本发明的分子标记R2ID3116是水稻籽粒 镉含量相关的分子标记。 权利要求书1页 说明书6页 序列表1页 附图1页 CN 106967836 A 2017.07.21 CN 106967836 A 1.分子标记R2ID3116在鉴定或辅助鉴定水稻籽粒镉含量中的应用， 其特征在于， 包括 以下步骤： 1)提取待测水稻的基因组DNA； 2)用选自下表中的一对引物， 对水稻基因组DNA进行PCR扩增： 3)检测PCR扩增产物大小来鉴定或辅助鉴定水稻籽粒镉含量： PCR扩增产物长度为 148bp的待测水稻籽粒镉含量低于PCR扩增产物长度为183bp的待测水稻籽粒镉含量。 2.根据权利要求1所述。
4、的应用， 其特征在于： PCR反应体系以20l计为： 10PCR buffer： 2 l， Dntp 0.5 l， 10mM引物F和R各0.5 l， DNA聚合酶0.2 l， DNA 20ng， 加ddH2O补足 至20 l。 3.根据权利要求1或2所述的应用， 其特征在于， PCR反应条件为： 94预变性5min， 94 变性30s， 55退火30s， 72延伸30s， 共35个循环， 16保温。 4.权利要求1所述分子标记R2ID3116在水稻育种中的应用。 5.根据权利要求4所述的应用， 其特征在于： 所述水稻育种为培育低镉含量水稻品种。 6.水稻的育种方法， 其特征在于， 包括： 用分。
5、子标记R2ID3116扩增水稻基因组DNA， 选择 PCR扩增长度为148bp的水稻作物亲本进行育种。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106967836 A 2 水稻籽粒镉含量相关基因qGCd2的分子标记的应用 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域中水稻籽粒镉含量相关基因分子标记的应用。 具体的 说， 本发明涉及水稻籽粒镉含量相关基因qGCd2的分子标记的应用。 背景技术 0002 水稻是我国种植面积最大、 产量最高的粮食作物之一。 农田镉污染是我国目前面 临的重大环境问题。 水稻是一种重金属吸收能力很强的农作物， 在受镉污染的农田中种植 水稻后， 镉会在稻米中积累， 造成稻米镉污染。
6、， 稻米中的镉通过食物链的富集作用危害人类 健康。 0003 镉在人体的半衰期为10-30年， 进入人体后主要在肾内积累， 如长期食用遭到镉污 染的稻米， 会使肾损伤， 骨骼生长代谢受阻， 造成肾功能衰竭， 骨质疏松、 萎缩等一系列症 状。 0004 目前我国受镉污染的耕地面积将近1.33万公顷， 每年受污染粮食多达1200万吨。 我国南方地区是稻米的主产区， 也是镉污染的重灾区， 这一地区的酸性土壤背景和以籼稻 为主的种植结构加重了稻米镉超标的风险。 稻田镉污染导致的稻米镉超标， 严重威胁到我 国的粮食和食品安全。 因此， 在稻田镉污染彻底根治之前， 培育低镉积累的优质高产水稻品 种显得尤为。
7、重要。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种鉴定或辅助鉴定水稻籽粒镉含量的分子标记方法。 通过 检测与水稻籽粒镉含量相关基因qGCd2紧密连锁的分子标记， 可以确定水稻是否为低镉含 量水稻品种， 预测水稻籽粒的镉含量， 加快低镉水稻新品种的选育进度。 0006 本发明中所述低镉含量水稻品种中的低镉含量是相对于杂交稻亲本水稻而言。 如 果两个杂交亲本水稻籽粒中镉含量相同， 所述低镉含量水稻品种的籽粒中镉含量可等于或 低于杂交亲本水稻籽粒中镉含量； 如果两个杂交亲本水稻籽粒中镉含量不相同， 所述低镉 含量水稻品种的籽粒中镉含量可等于或低于两个杂交亲本水稻籽粒中镉含量较低的杂交 亲本水稻。 0。
8、007 本发明中所述低镉含量水稻品种的水稻籽粒镉含量具体可小于2.0mg/kg。 0008 本发明要解决的一个技术问题是如何鉴定或辅助鉴定水稻籽粒镉含量。 0009 为了实现以上技术问题， 本发明提供了以下实验步骤： 0010 1)提取待测水稻的基因组DNA； 0011 2)用下表中的一对引物， 对水稻基因组DNA进行PCR扩增； 0012 说明书 1/6 页 3 CN 106967836 A 3 0013 3)检测PCR扩增产物， 如果扩增出对应大小的特异性分子标记片段， 即148bp， 则为 低镉含量水稻品种。 0014 PCR反应体系以20 l计为： 10PCR buffer:2 l， 。
9、dNTP 0.5 l， 10mM引物F和R各0.5 l， DNA聚合酶0.2 l， DNA 20ng， 加ddH2O补足至20 l。 0015 PCR反应条件为： 94预变性5min， 94变性30s， 55退火30s， 72延伸30s， 共35 个循环， 16保温。 0016 本发明要解决的另一个技术问题是如何进行水稻育种。 0017 为了解决以上技术问题， 本发明提供了以下技术方案: 0018 1)所述分子标记R2ID3116在水稻育种中的应用。 0019 2)上述鉴定或辅助鉴定水稻籽粒镉含量的方法在水稻育种中的应用 0020 3)水稻育种方法包括： 用上述分子标记R2ID3116扩增水稻。
10、基因组DNA， 选择PCR扩 增长度为148bp的水稻作为亲本进行育种。 0021 上述应用中， 所述水稻育种为培育低镉含量水稻品种。 0022 本发明中所述低镉含量水稻品种的水稻籽粒镉含量具体可小于2.0mg/kg。 0023 上述3)中所述水稻的育种方法可用于培育低镉含量水稻品种。 用分子标记 R2ID3116扩增水稻基因组DNA， 通过PCR产物的大小来判断是否为低镉含量水稻品种。 0024 实验证明， 用分子标记R2ID3116扩增水稻基因组DNA， 100的PCR扩增产物大小为 148bp的水稻品种中籽粒镉含量都低于2.0mg/kg， 而94的PCR产物大小为183bp的水稻品 种中。
11、籽粒镉含量都高于4.0mg/kg， 说明本发明的R2ID3116是水稻籽粒镉含量相关的分子标 记， 可用于水稻籽粒镉积累的早期预测和筛选， 可用于水稻分子标记辅助选择育种， 可用于 低镉水稻的选育。 R2ID3116分子标记直接以DNA的形式表现， 在水稻的各个组织及各个发育 阶段均可检测到， 有利于更方便快捷的预测水稻耐镉性。 附图说明 0025 图1为本发明实施例中利用分子标记R2ID3116检测各供试水稻材料的电泳图。 0026 M： 分子量Marker； 1-94分别为不同的水稻品种； 箭头所示为148bp的目的条带。 具体实施方式 0027 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详。
12、细描述， 给出的实施例仅为了阐 明本发明， 而不是为了限制本发明的范围。 0028 下述实施例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 0029 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0030 实施例1、 R2ID3116是与水稻籽粒镉含量相关的分子标记 0031 一、 R2ID3116的发现 0032 将151个TQ/02428的RIL群体中连续两年(2013年和2014年)种植在长沙北山镇镉 污染稻田， 稳定检测到一个控制稻米低镉基因， 命名为qCd2， 该低镉基因位于水稻第二条染 色体上， 为了克隆qCd2， 找到一个近等基因系和TQ回交， 获得。
13、F2， 将724个F2家系种植在镉污 染地区， 测量糙米的镉含量， 最终将qCd2定位在31 .01-31 .16Mb， 区间大小为160Kb， R2ID3116是与qCd2连锁的InDel分子标记。 说明书 2/6 页 4 CN 106967836 A 4 0033 二、 检测表1中的94个水稻品种的水稻籽粒镉含量 0034 搜集94个国内外水稻品种， 其种质资源可从中国作物种质资源信息网获取 ( 部分材料具体信息可在正式出版著作(中国稻 种资源及其核心种质研究与利用， 李自超， 中国农业大学出版社； 第1版， 2013年5月1日)中 查询， 品种详细信息如表1所示。 将94个水稻品种分三个。
14、重复种植在北山镉污染稻田(土壤 镉浓度为1.9mg/kg)， 每个品种每行种植8株为一个重复， 灌溉方式为干湿交替。 成熟后收取 籽粒， 脱壳后将糙米磨成米粉。 每个材料米粉称取2克， 15ml混酸(硝酸： 高氯酸， 配比是5: 1)， 过夜冷消化， 第二天上电热板消煮， 设置温度为80/1小时-120/1小时-180/0.5小 时-220/0.5小时-260消煮至混酸全部挥发完， 1稀硝酸定容至10ml， 采用ICP-MS测定 籽粒中镉含量， 结果如(表1)所示。 0035 三、 分子标记R2ID3116检测表1中94个水稻品种的PCR产物大小 0036 从表1的94个水稻品种的叶片中提取基。
15、因组DNA， 用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所 示的特异性引物对进行PCR扩增， PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳， 检测PCR扩增产物的大小。 94个水稻品种的PCR扩增产物大小结果如表1所示。 表1结果表明， 94个水稻品种中有44个水 稻品种的PCR扩增产物大小为148bp， 并且它们的水稻籽粒镉含量均低于2.0mg/kg； 其余50 个品种的PCR扩增产物均为183bp， 其中有47个品种水稻籽粒镉含量均高于4.0mg/kg。 因此， 100的PCR扩增产物大小为148bp的水稻品种中籽粒镉含量均低于2.0mg/kg， 94的PCR扩 增产物大小为183bp的水稻品种中籽。
16、粒镉含量均高于4.0mg/kg， 说明本发明的R2ID3116是 水稻籽粒镉含量相关的分子标记， 可用于水稻籽粒镉积累的早期预测和筛选。 其中， 表1为 94个水稻品种的籽粒镉含量和R2ID3116扩增产物大小。 0037 表1、 94个水稻品种的籽粒镉含量和R2ID3116扩增产物大小 0038 说明书 3/6 页 5 CN 106967836 A 5 0039 说明书 4/6 页 6 CN 106967836 A 6 0040 说明书 5/6 页 7 CN 106967836 A 7 0041 0042 表2按R2ID3116扩增产物大小统计的94个水稻品种的籽粒镉含量 0043 说明书 6/6 页 8 CN 106967836 A 8 序列表 袁隆平农业高科技股份有限公司 中国科学院亚热带农业生态研究所 湖南亚 华种业科学研究院 水稻籽粒镉含量相关基因qGCd2的分子标记的应用 2 PatentIn version 3.5 1 19 DNA 人工序列 1 cccattgattagttccctg 19 2 20 DNA 人工序列 2 cataccgcaatgaccttatc 20 序列表 1/1 页 9 CN 106967836 A 9 图1 说明书附图 1/1 页 10 CN 106967836 A 10 。