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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611087725.4 (22)申请日 2016.12.01 (71)申请人 天津市第一中心医院 地址 300000 天津市南开区复康路24号 申请人 天津市第二人民医院 (72)发明人 陆伟于美丽时钢苏瑞王勇 刘蕾代庆海 (74)专利代理机构 天津市三利专利商标代理有 限公司 12107 代理人 李蕊 (51)Int.Cl. C12M 3/02(2006.01) C12N 5/071(2010.01) (54)发明名称 一种缓释生长因子多细胞球培养膜板及其 构建方法 (5。
2、7)摘要 本发明提供了缓释生长因子多细胞球培养 膜板， 是聚酸酐包载由海藻酸钠保护的成纤维细 胞生长因子和肝细胞生长因子所得到的， 所述海 藻酸钠具有网状结构， 成纤维细胞生长因子和肝 细胞生长因子嵌在该网状结构的孔隙中， 是利用 聚酸酐对生物体具有良好的生物相容性， 特别是 聚酸酐降解过程具有表面溶蚀性， 首次以具有表 面溶蚀性能的聚酸酐为模板材料， 包载经海藻酸 钠保护的细胞生长因子， 利用乳化、 溶剂挥发技 术制备出具有凹槽空间(孔径5m-100m)、 而 且缓慢释放细胞因子的三维多细胞球培养膜板。 权利要求书1页 说明书8页 附图4页 CN 106754365 A 2017.05.31。
3、 CN 106754365 A 1.一种缓释生长因子多细胞球培养膜板， 其特征在于： 是聚酸酐包载由海藻酸钠保护 的成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子所得到的， 所述海藻酸钠具有网状结构， 成纤维 细胞生长因子和肝细胞生长因子嵌在该网状结构的孔隙中。 2.根据权利要求1所述的缓释生长因子多细胞球培养膜板， 其特征在于： 所述聚酸酐为 聚酸酐 聚1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸。 3.根据权利要求1所述的缓释生长因子多细胞球培养膜板， 其特征在于： 所述膜板中各 成分的用量比按重量份数计为聚酸酐94.8-97.8份、 海藻酸钠0.5-2份、 成纤维细胞生长因 子0.01-0.1份和肝细胞生。
4、长因子0.01-0.1份。 4.权利要求1所述的缓释生长因子多细胞球培养膜板的构建方法， 其特征在于： 具体步 骤如下： (1)配置有机相： 将聚酸酐 聚1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸与表面活性剂双十 二烷基二甲基溴化铵以20-40:1-1.5的质量比混合； 室温下溶于二甲基甲酰胺和二氯甲烷 体积比为1-2:1-5的混合溶液中， 至聚酸酐完全溶解， 得有机相溶液A备用； (2)配置水相： 成纤维细胞生长因子溶于0.8海藻酸钠溶液中配成 600ng/mL成纤维细胞生长因子多糖保护溶液； 肝细胞生长因子溶于0.8海藻酸钠溶 液中配成600ng/mL肝细胞生长因子多糖保护溶液； 按体积比0.。
5、1-1:1-0.1将成纤维细胞生 长因子多糖保护溶液和肝细胞生长因子多糖保护溶液进行混合， 得水相溶液B备用； (3)有机相溶液A和水相溶液B按体积比20-50： 1-2投放， 在2-6水浴中， 通风橱内磁 力搅拌下缓慢滴加水相溶液B到有机相溶液A中， 30min后放入室温下通风橱内磁力搅拌8h, 乳化后制得油包水微球乳液； (4)将乳化后制得的油包水微球乳液在室温下， 通风橱内环境湿度为50-70的条件 下浇铸在干净的玻璃皿基底上， 待有机溶剂和水完全挥发后， 得到有序的凹孔状具有缓释 生长因子的多细胞球培养膜板。 5.根据权利要求4所述的缓释生长因子多细胞球培养膜板的构建方法， 其特征在于。
6、： 具 体步骤如下： (1)配置有机相： 将聚酸酐 聚1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸与表面活性剂双十 二烷基二甲基溴化铵以20:1的质量比混合； 室温下溶于二甲基甲酰胺和二氯甲烷体积比为 1:3的混合溶液中， 至聚酸酐完全溶解， 得有机相溶液A备用； (2)配置水相： 成纤维细胞生长因子溶于0.8海藻酸钠溶液中配成600ng/mL成纤维细 胞生长因子多糖保护溶液； 肝细胞生长因子溶于0.8海藻酸钠溶液中配成600ng/mL肝细 胞生长因子多糖保护溶液； 按体积比1:1将成纤维细胞生长因子多糖保护溶液和肝细胞生 长因子多糖保护溶液进行混合， 得水相溶液B备用； (3)有机相溶液A和水相溶。
7、液B按体积比25： 2投放， 在4水浴中， 通风橱内磁力搅拌下 缓慢滴加水相溶液B到有机相溶液A中， 30min后放入室温下通风橱内磁力搅拌8h,乳化后制 得油包水微球乳液； (4)将乳化后制得的油包水微球乳液在室温下， 通风橱内环境湿度为65的条件下浇 铸在干净的玻璃皿基底上， 待有机溶剂和水完全挥发后， 得到有序的凹孔状具有缓释生长 因子的多细胞球培养膜板。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106754365 A 2 一种缓释生长因子多细胞球培养膜板及其构建方法 技术领域 0001 本发明涉及生物医学领域， 尤其是一种缓释生长因子多细胞球培养膜板及其构建 方法。 背景技术 0002 肝衰。
8、竭是多种因素引起的严重肝脏损害， 导致其合成、 解毒、 排泄和生物转化等功 能发生严重障碍或失代偿， 出现以凝血机制障碍和黄疸、 肝性脑病、 腹水等为主要表现的一 组临床症候群。 0003 急性肝衰蝎是临床亟待解决的治疗难题。 尽管内科综合治疗措施取得了较大进 展， 患者病死率依然高达50-80。 肝移植可以显著降低病死率， 但因供体短缺， 大多数患 者在等待供肝的过程中死亡。 因此生物人工肝与肝细胞移植等细胞水平的新治疗方法得到 了研究与发展， 在大量动物实验和一些临床实验中获得良好效果， 成为有前途的肝病治疗 途径。 实际上无论是肝细胞移植还是生物人工肝支持治疗， 其核心原材料都是肝细胞，。
9、 对肝 功能衰竭患者的治疗作用几乎完全依赖于所用肝细胞的生物学功能。 0004 人体中的绝大多数细胞生活在三维的环境中， 细胞必须通过细胞-细胞以及细胞- 细胞外基质之间的相互作用， 获得各种生化和机械信号， 才能维持其正常的生理活动。 大量 研究表明， 细胞与细胞外基质以及细胞与细胞之间的相互作用对于调控细胞的迁移、 增殖 和分化有重要的作用。 一般使用的二维单层培养的细胞缺乏这样的信号传递， 不能很好地 模拟体内细胞的微环境。 相反， 在三维的多细胞球中细胞与外部环境的相互作用可大部分 得到重建， 因此， 和细胞单层相比， 多细胞球能更好地模拟体内细胞的微环境。 正因为此， 多 细胞球在基。
10、因及功能表达等很多方面更接近于正常人体细胞。 0005 通常的细胞培养有贴壁、 悬浮两种生长方式。 悬浮生长限于少数几类细胞,如白细 胞、 淋巴组织细胞以及腹水癌细胞等。 大部分的细胞如肝细胞为贴壁生长,虽然肝细胞失去 接触抑制的特性,但是在普通培养条件下,细胞仍然以二维生长为主。 因此， 为实现肝细胞 的三维生长,创造避免贴壁的生长条件是现阶段亟待解决的技术问题。 发明内容 0006 本发明所要解决的技术问题在于提供一种缓释生长因子多细胞球培养膜板。 0007 本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述缓释生长因子多细胞球培养膜板 的构建方法。 0008 为解决上述技术问题， 本发明的技术方案。
11、是： 0009 一种缓释生长因子多细胞球培养膜板， 是聚酸酐包载由海藻酸钠保护的成纤维细 胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF)所得到的， 所述海藻酸钠具有网状结构， 成纤维 细胞生长因子(FGF)和肝细胞生长因子(HGF)嵌在该网状结构的孔隙中。 0010 上述缓释生长因子多细胞球培养膜板中所述聚酸酐是一类新型的医用高分子材 料， 具有生物降解特性。 具有( )所示分子结构， 说明书 1/8 页 3 CN 106754365 A 3 0011 0012 据R基的不同， 可将聚酸酐分为脂肪族聚酸酐、 芳香族聚酸酐、 杂环族聚酸酐、 聚酰 酸酐、 聚酰胺酸酐、 可交联的酸酐、 含磷聚酸酐。
12、等。 0013 优选的， 上述缓释生长因子多细胞球培养膜板， 所述聚酸酐为芳香族聚酸酐P (CPP-SA)(聚酸酐 聚1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸)， 具有()所示分子结构， 0014 0015 优选的， 上述缓释生长因子多细胞球培养膜板， 所述膜板中各成分的用量比按重 量份数计为聚酸酐94.8-97.8份、 海藻酸钠0.5-2份、 成纤维细胞生长因子0.01-0.1份和肝 细胞生长因子0.01-0.1份。 0016 上述缓释生长因子多细胞球培养膜板的构建方法， 具体步骤如下： 0017 (1)配置有机相： 将聚酸酐 聚1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸(P(CPP-SA) 与表。
13、面活性剂双十二烷基二甲基溴化铵(DDDABr)以20-40:1-1.5的质量比混合； 室温下 溶于二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷体积比为1-2:1-5的混合溶液中， 至聚酸酐完全溶解， 得有机相溶液A备用； 0018 (2)配置水相： 成纤维细胞生长因子(FGF)溶于0.8海藻酸钠溶液中配成600ng/ mLFGF多糖保护溶液； 肝细胞生长因子(HGF)溶于0.8海藻酸钠溶液中配成600ng/mL HGF 多糖保护溶液； 按体积比0.1-1:1-0.1将FGF多糖保护溶液和HGF多糖保护溶液进行混合， 得 水相溶液B备用； 0019 (3)有机相溶液A和水相溶液B按体积比20-50： 1-2。
14、投放， 在2-6水浴中， 通风橱 内磁力搅拌下缓慢滴加水相溶液B到有机相溶液A中， 30min后放入室温下通风橱内磁力搅 拌8h,乳化后制得油包水微球乳液； 0020 (4)将乳化后制得的油包水微球乳液在室温下， 通风橱内环境湿度为50-70的 条件下浇铸在干净的玻璃皿基底上， 待有机溶剂和水完全挥发后， 得到有序的凹孔状具有 缓释生长因子的多细胞球培养膜板。 0021 优选的， 上述缓释生长因子多细胞球培养膜板的构建方法， 具体步骤如下： 0022 (1)配置有机相： 将聚酸酐 聚1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸 (P(CPP-SA) 与表面活性剂双十二烷基二甲基溴化铵(DDDABr)。
15、以20:1的质量比混合； 室温下溶于二甲 基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷体积比为1:3的混合溶液中， 至聚酸酐完全溶解， 得有机相溶液A 备用； 0023 (2)配置水相： 成纤维细胞生长因子(FGF)溶于0.8海藻酸钠溶液中配成600ng/ mLFGF多糖保护溶液； 肝细胞生长因子(HGF)溶于0.8海藻酸钠溶液中配成600ng/mL HGF 多糖保护溶液； 按体积比1:1将FGF多糖保护溶液和HGF多糖保护溶液进行混合， 得水相溶液 说明书 2/8 页 4 CN 106754365 A 4 B备用； 0024 (3)有机相溶液A和水相溶液B按体积比25： 2投放， 在4水浴中， 通风橱内磁力。
16、搅 拌下缓慢滴加水相溶液B到有机相溶液A中， 30min后放入室温下通风橱内磁力搅拌8h,乳化 后制得油包水微球乳液； 0025 (4)将乳化后制得的油包水微球乳液在室温下， 通风橱内环境湿度为65的条件 下浇铸在干净的玻璃皿基底上， 待有机溶剂和水完全挥发后， 得到有序的凹孔状具有缓释 生长因子的多细胞球培养膜板。 0026 本发明的有益效果是： 0027 上述缓释生长因子多细胞球培养膜板， 利用聚酸酐对生物体具有良好的生物相容 性， 特别是聚酸酐降解过程具有表面溶蚀性， 首次以具有表面溶蚀性能的聚酸酐为模板材 料， 包载经海藻酸钠保护的细胞生长因子， 利用乳化、 溶剂挥发技术制备出具有凹槽。
17、空间 (孔径5 m-100 m)、 而且缓慢释放细胞因子的三维多细胞球培养膜板。 0028 不同于现有技术中聚酸酐包载生长因子， 本发明采用聚酸酐制备细胞培养模板， 而使用海藻酸钠包载生长因子后制备凹槽， 用于细胞培养。 通过对多孔膜板制备、 影响因 素、 细胞因子释放、 体外细胞毒性试验等研究， 证明所述多细胞球培养膜板具有适宜多细胞 球立体培养的凹槽空间， 可以缓慢释放活性细胞因子， 无细胞毒性， 可以促进细胞三维增殖 培养， 为进一步多细胞球立体培养研究奠定了基础。 附图说明 0029 图1是多细胞球培养膜板结构放大图； 0030 图2为缓释生长因子多细胞球培养膜板红外光谱图(IR)； 。
18、0031 图3是缓释生长因子多细胞球培养膜板扫描电镜图， 可以看到在多细胞球培养膜 板中存在着有序的周期性结构， 形成孔洞比较均一的凹槽状， 约为12 m左右， 孔洞呈单层排 布， 孔深约为2.8 m左右， 孔洞和玻璃皿基底之间也存在一层较薄的聚酸酐层面； 0032 图4是聚酸酐浓度0.2mg/ml扫描电镜； 0033 图5是聚酸酐浓度0.8mg/ml扫描电镜； 0034 图6是聚酸酐浓度3.2mg/ml扫描电镜； 0035 图7是DMF-CH2CL2(1： 3)溶剂凹孔状膜板扫描电镜； 0036 图8是DMF-CHCL3(1： 3)溶剂凹孔状膜板扫描电镜； 0037 图9是湿度为20时凹孔状。
19、膜板扫描电镜； 0038 图10是湿度为40时凹孔状膜板扫描电镜； 0039 图11是湿度为60时凹孔状膜板扫描电镜； 0040 图12是多细胞球培养膜板缓释FGF生长因子曲线； 0041 图13是多细胞球培养膜板缓释HGF生长因子曲线。 0042 图14是多细胞球培养膜板体外累积释放FGF曲线和HGF曲线,A:缓释FGF生长因子 曲线； B:缓释HGF生长因子曲线。 具体实施方式 0043 下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。 说明书 3/8 页 5 CN 106754365 A 5 0044 下述实施例所用仪器与材料为： 0045 聚酸酐 聚1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷。
20、-癸二酸P(CPP-SA)(Wcpp:Wsa75： 25)： GCP相对分子质量测定： P(CPP-SA)聚酸酐的重均相对分子质量Mw20000。 天津市第三中心 医院肝胆疾病研究所研制， 制备方法见文献于美丽聚酸酐-比柔比星控释植入剂的研究及 应用J.生物医学工程学杂志2002； 19(2)： 69-79； 于美丽抗膀胱癌纳米控释植入剂的制备 及动物实验研究J.中华临床杂志2002； 2(10):41-43； 双十二烷基二甲基溴化铵(DDDA Br)购于SIGMA-ALDRICH， 美国； 二甲基甲酰胺(DMF)分析纯、 二氯甲烷分析纯(含水量 0.05)、 三氯甲烷分析纯(含水量0.02)。
21、、 海藻酸钠分析纯购自天津市基准化学试剂有 限公司； 成纤维细胞生长因子fibroblast growth factor,(FGF)、 肝细胞生长因子 Hepatocyte growth factor(HGF)购自天津市联星生物技术有限公司； 成纤维细胞生长因 子(FGF)检测试剂盒、 人肝细胞生长因子定量测定(HGF)ELISA试剂盒购自上海裕平生物科 技有限公司。 NCTC clone 929(小鼠成纤维细胞L-929)中国食品药品检定研究院。 0046 离心机Eppendorff德国， 真空干燥机Yamato日本， 扫描电镜Phenom， FEI Company， 美国， 酶标仪(芬兰雷。
22、勃公司， MK3)。 0047 实施例1 0048 缓释生长因子多细胞球培养膜板结构表征 0049 配置有机相： 将400mg聚酸酐P(CPP-SA)与20mg双十二烷基二甲基溴化铵(DDDA Br)室温下溶于500ml二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷体积比为1:3的混合溶液中， 使聚酸酐 完全溶解， 聚酸酐浓度为0.8mg/ml,DDDABr浓度为0.04mg/ml。 0050 配置水相： 成纤维细胞生长因子(FGF)溶于0.8海藻酸钠溶液中配成20ml浓度为 600ng/mL FGF海藻酸钠保护溶液。 肝细胞生长因子(HGF)溶于0.8海藻酸钠溶液中配成 20ml 600ng/mL HGF。
23、海藻酸钠保护溶液。 0051 按体积比1： 1混合FGF海藻酸钠保护溶液和HGF海藻酸钠保护溶液40ml。 0052 在4水浴中， 通风橱内磁力搅拌下缓慢滴加水相溶液到有机相溶液中， 有机相溶 液和水相溶液的体积比25： 2， 30min后放入室温下通风橱内磁力搅拌8h,乳化后制得油包水 微球乳液； 将制备的乳化后制得油包水微球乳液在室温下， 通风橱内环境湿度为65的条 件下(温度25)浇铸在干净的玻璃皿基底上， 待有机溶剂和水完全挥发后， 得到有序的凹 孔状具有缓释生长因子的多细胞球培养膜板， 将所制备的缓释生长因子多细胞球培养膜板 进行预处理干燥后喷金， 进行扫描电镜分析， 观察多孔膜板结。
24、构， 如图1所示。 0053 实施例2 0054 缓释生长因子多细胞球培养膜板的构建 0055 A.有机相配置： 将聚酸酐 聚1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸(P(CPP-SA)与 表面活性剂双十二烷基二甲基溴化铵(DDDABr)以40:1.5的质量比混合； 室温下溶于二甲 基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷体积比为1:1的混合溶液中， 至聚酸酐完全溶解， 得有机相溶液A 备用； 0056 B.水相配置： 成纤维细胞生长因子(FGF)溶于0.8海藻酸钠溶液中配成600ng/ mLFGF多糖保护溶液； 肝细胞生长因子(HGF)溶于0.8海藻酸钠溶液中配成600ng/mL HGF 多糖保护溶液； 。
25、按体积比0.1:1混合FGF多糖保护溶液和HGF多糖保护溶液， 得水相溶液B备 用； 说明书 4/8 页 6 CN 106754365 A 6 0057 C.有机相溶液A和水相溶液B按体积比20： 1投放， 在4水浴中， 通风橱内磁力搅拌 下缓慢滴加水相溶液B到有机相溶液A中， 30min后放入室温下通风橱内磁力搅拌8h,乳化后 制得油包水微球乳液； 0058 D.将乳化后制得的油包水微球乳液在室温下， 通风橱内环境湿度为50的条件下 浇铸在干净的玻璃皿基底上， 待有机溶剂和水完全挥发后， 得到有序的凹孔状具有缓释生 长因子的多细胞球培养膜板。 0059 实施例3 0060 缓释生长因子多细胞。
26、球培养膜板的构建 0061 A.有机相配置： 将聚酸酐 聚1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸(P(CPP-SA)与 表面活性剂双十二烷基二甲基溴化铵(DDDABr)以30:1的质量比混合； 室温下溶于二甲基 甲酰胺(DMF)和二氯甲烷体积比为2： 5的混合溶液中， 至聚酸酐完全溶解， 得有机相溶液A备 用； 0062 B.水相配置： 成纤维细胞生长因子(FGF)溶于0.8海藻酸钠溶液中配成600ng/ mLFGF多糖保护溶液； 肝细胞生长因子(HGF)溶于0.8海藻酸钠溶液中配成600ng/mL HGF 多糖保护溶液； 按体积比1:0.1混合FGF多糖保护溶液和HGF多糖保护溶液， 得水相。
27、溶液B备 用； 0063 C.有机相溶液A和水相溶液B按体积比50： 2投放， 在4水浴中， 通风橱内磁力搅拌 下缓慢滴加水相溶液B到有机相溶液A中， 30min后放入室温下通风橱内磁力搅拌8h,乳化后 制得油包水微球乳液； 0064 D.将乳化后制得的油包水微球乳液在室温下， 通风橱内环境湿度为60的条件下 浇铸在干净的玻璃皿基底上， 待有机溶剂和水完全挥发后， 得到有序的凹孔状具有缓释生 长因子的多细胞球培养膜板。 0065 实施例4 0066 配置0.2mg/ml、 0.8mg/ml、 3.2mg/ml浓度聚酸酐观察凹孔状膜板的形貌变化。 0067 溶剂的选择对于凹孔状膜板的形貌和柔韧度。
28、起到了很大的作用， 实验选择二氯甲 烷、 三氯甲烷、 二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷体积比1:3混合物、 二甲基甲酰胺(DMF)和三 氯甲烷体积比1:3混合物， 进行了多细胞球培养膜板的比较研究。 0068 一定的湿度条件是制备凹孔状膜板的先决条件， 实验利用饱和氯化钠溶液控制环 境湿度， 湿度50-75条件下控制所成凹孔状膜板孔径的大小。 0069 1.多细胞球培养膜板缓释FGF和HGF生长因子测定 0070 多细胞球培养膜板是由聚酸酐包载海藻酸钠保护的成纤维细胞生长因子(FGF)和 肝细胞生长因子(HGF)组成， 海藻酸钠具有网状结构， FGF和HGF嵌在网状孔隙中可以保持良 好的生物活。
29、性， 聚酸酐具有表面溶蚀性， 在细胞培养体系中可以缓慢释放FGF和HGF。 0071 以PBS缓冲液100mL作为溶出介质， 放入2x2cm2多细胞球培养膜板。 温度370.5 。 分别于各时间点(0d,2d,4d,6d,8d,10d,12d,14d,16d,18d,20d)取样100 L。 每次取样 后,立即补充同温度的PBS缓冲液100 L。 0072 多细胞球培养膜板缓释FGF测定： 按照人成纤维细胞生长因子21(fgf-21)ELI SA 试剂盒说明书进行。 0073 多细胞球培养膜板缓释HGF测定： 按照人肝细胞生长因子定量测定(HGF)ELISA试 说明书 5/8 页 7 CN 1。
30、06754365 A 7 剂盒检测说明书检测。 0074 2.多细胞球培养膜板体外细胞毒性试验 0075 多细胞球培养膜板体外细胞毒性试验依据GB/T 16886.5-2003医疗器械生物学评 价第5部分体外细胞毒性试验方法进行。 0076 采用四唑盐(MTT)比色法， 0.22 m滤器过滤的含10胎牛血清MEM培养液为浸提介 质； 样品2.0g， 加浸提介质10.0ml， 37浸提24h后得到浸提原液； 细胞株： NCTC clone 929； 浸提介质为空白对照， 30cm2的高密度聚乙烯加入浸提介质5.0ml， 置37， 浸提24h为阴性 对照， 含5二甲基亚砜的浸提介质为阳性对照。 0。
31、077 细胞悬液制备： 将正常传代培养的L-929细胞， 经0.25胰酶消化制成浓度为1 104/ml的细胞悬液， 接种于96孔板， 每孔200 l， 每组6孔， 置5CO2培养箱内37培养24h。 0078 浸提液交换： 细胞培养24h后， 弃去原培养液， 空白组用浸提介质交换， 阴性对照组 用浸提比例为6cm2/ml高密度聚乙烯浸提液交换， 阳性对照组用含5二甲基亚砜的浸提介 质交换， 试验样品组用浸提液进行交换。 置5CO2培养箱内37， 培养72h。 0079 吸光度的测定： 更换培养液后， 取培养72h的孔板， 每孔加入40 l 5g/L 四唑盐 (MTT)溶液继续培养4h后弃去孔内。
32、液体， 加入150 L二甲基亚砜， 置振荡器上振荡10min， 在 酶标仪570nm和630nm处测定各孔吸光度。 按下式计算相对增殖率(RGR)。 0080 0081 A样品组(阴性、 阳性组)吸光度 0082 A0空白对照组吸光度 0083 细胞毒性评价等级 0084 级别 相对增殖率 级别 相对增殖率 0级 100 3级 3049 1级 8099 4级 029 2级 5079 0085 结果如下： 0086 1.缓释生长因子多细胞球培养膜板IR光谱图和扫描电镜结果， 见图2、 3。 0087 2.缓释生长因子多细胞球培养膜板影响因素 0088 3.聚酸酐溶液浓度的影响 0089 聚酸酐溶。
33、液浓度与所制成凹孔状膜板的孔径大小呈负相关。 环境湿度为55， 二 甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷体积比为1:3的混合溶液为溶剂， 聚酸酐浓度分别为0.2mg/ ml、 0.8mg/ml、 3.2mg/ml制成凹孔状膜板的SEM图如下， 分别为图4-6， 由SEM图可观察到随着 聚酸酐溶液浓度越大， 所得到孔径越小。 这是由于随着聚酸酐浓度增加， 溶液粘度增大导致 对流作用变弱， 水分子间碰撞融合几率变小， 水分子周围的聚酸酐浓度增大， 相邻水分子间 融合速度减小， 制得的凹孔状膜板孔洞的尺寸也随之变小。 0090 4.溶剂的影响 0091 溶剂的选择对于凹孔状膜板的形貌和柔韧度起到了很大的作。
34、用， 实验选择二氯甲 烷、 三氯甲烷、 二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷1:3混合物、 二甲基甲酰胺(DMF)和三氯甲烷 说明书 6/8 页 8 CN 106754365 A 8 1:3混合物， 进行了多细胞球培养膜板的比较研究。 分别选择二氯甲烷和三氯甲烷为溶剂所 制备的凹孔状膜板柔韧度差， 为提高膜板柔韧度， 实验分别选择二甲基甲酰胺(DMF)和二氯 甲烷1:3混合物、 二甲基甲酰胺(DMF)和三氯甲烷1:3混合物为溶剂， 聚酸酐溶液浓度1.2mg/ ml， 环境湿度为55， 制成凹孔状膜板的SEM如图5和图6。 0092 由于溶剂的沸点二氯甲烷低于三氯甲烷， 用二甲基甲酰胺(DMF)和二。
35、氯甲烷1:3混 合物制备的凹孔状膜板孔洞(图7)小于由二甲基甲酰胺(DMF)和三氯甲烷1:3混合物为溶剂 的孔洞(图8)， 但孔洞的有序性高于二甲基甲酰胺(DMF)和三氯甲烷1:3混合物为溶剂的凹 孔状膜板。 孔洞的有序性以及大小差异是由于溶剂的挥发速度不同所导致的， 而溶剂的挥 发速度又取决于其分子量以及饱和蒸汽压， 通常情况下， 溶剂的挥发速度随其饱和蒸汽压 的降低而降低， 因此， 低饱和蒸汽压的溶剂挥发的速度慢， 相邻水分子间有更多机会合并形 成孔洞尺寸较大。 较大尺寸孔洞会打乱水分子间原有的均匀排列， 因此降低凹孔状膜板孔 洞的有序性。 选择具有合适挥发速度的溶剂对有序多孔膜的形成至关。
36、重要。 0093 5.湿度的影响 0094 二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷体积比为1:3的混合溶液为溶剂， 聚酸酐浓度为 1.2mg/ml， 不同湿度对凹孔状膜板结构形成以及有序性的影响， 如图9-11所示， 在湿度为 20时凹孔状膜板孔洞尺寸偏小， 孔洞数目较少； 在40湿度下凹孔状膜板孔洞尺寸变大 且数目增多， 形成较为有序的六方密堆积排列； 在60湿度凹孔状膜板中有比较大孔洞存 在， 一致性稍差。 这种现象是由于环境湿度小时， 浮在液面上的微乳液中水滴挥发快， 凹孔 状膜板孔洞较小； 在45湿度下， 空气中水分子会抵消挥发导致的损失， 形成更大尺寸的孔 洞； 当在60及以上的湿度时， 。
37、大量的空气中的水蒸气由于有机溶剂挥发导致的溶液表面 温度降低而冷凝在液面上， 使水分子聚集形成较大尺寸的孔洞。 0095 6.多细胞球培养膜板缓释FGF和HGF生长因子 0096 根据多细胞球培养膜板各个时间点释放液的吸光度值， 分别经标准曲线得出FGF 和HGF浓度,绘制出多细胞球培养膜板体外累积释放FGF曲线和HGF曲线。 结果显示,20d的累 积释放率FGF达到55.7,HGF达到48.2(见图12， 图13),由于聚酸酐具有表面溶蚀性， 因 此释放初期基本无突释。 0097 7.多细胞球培养膜板体外细胞毒性试验结果 0098 72h阴性对照组RGR为98.8， 细胞毒性反应为1级； 阳。
38、性对照组RGR为4.2， 细胞 毒性反应为4级。 试验系统反应成立。 多细胞球培养膜板浸提液细胞相对增殖率RGR为 73.4， 细胞毒性反应为2级。 0099 综上所述， 本发明所述缓释生长因子多细胞球培养膜板的最优化构建条件如下： 0100 聚酸酐 聚1,3-双(对羧基苯氧基)丙烷-癸二酸(P(CPP-SA)与表面活性剂双十 二烷基二甲基溴化铵(DDDABr)以20:1的质量比投料， 成纤维细胞生长因子(FGF)溶于 0.8海藻酸钠溶液中配成600ng/mLFGF多糖保护溶液。 肝细胞生长因子(HGF)溶于0.8海 藻酸钠溶液中配成600ng/mL HGF多糖保护溶液。 1:1混合FGF多糖。
39、保护溶液和HGF多糖保护 溶液 0101 聚酸酐和1:1混合FGF多糖保护溶液和HGF多糖保护溶液按25:2体积比投放， 温度 25， 湿度65。 0102 根据多细胞球培养膜板各个时间点释放液的吸光度值， 分别经标准曲线得出FGF 说明书 7/8 页 9 CN 106754365 A 9 和HGF浓度,绘制出多细胞球培养膜板体外累积释放FGF曲线和HGF曲线。 结果显示,20d的累 积释放率FGF达到55.7,HGF达到48.2(见图14),由于聚酸酐具有表面溶蚀性， 因此释放 初期基本无突释。 0103 上述参照实施例对该一种缓释生长因子多细胞球培养膜板及其构建方法进行的 详细描述， 是说明性的而不是限定性的， 可按照所限定范围列举出若干个实施例， 因此在不 脱离本发明总体构思下的变化和修改， 应属本发明的保护范围之内。 说明书 8/8 页 10 CN 106754365 A 10 图1 图2 说明书附图 1/4 页 11 CN 106754365 A 11 图3 图4 图5 图6 说明书附图 2/4 页 12 CN 106754365 A 12 图7 图8 图9 图10 说明书附图 3/4 页 13 CN 106754365 A 13 图11 图12 图13 图14 说明书附图 4/4 页 14 CN 106754365 A 14 。