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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710048875.2 (22)申请日 2017.01.23 (71)申请人 嵊州市派特普科技开发有限公司 地址 312400 浙江省绍兴市嵊州市经济开 发区浦南大道388号科创大楼301室 (72)发明人 施春华张美芬 (74)专利代理机构 北京华仲龙腾专利代理事务 所(普通合伙) 11548 代理人 李静 (51)Int.Cl. C12P 21/06(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/16(200。
2、6.01) C07K 1/14(2006.01) (54)发明名称 一种从米糠中提取活性蛋白的方法 (57)摘要 本发明提供一种从米糠中提取活性蛋白的 方法， 1） 预处理： 在米糠中加入异丙醇， 搅拌， 加 入正己烷浸提， 调浆， 倒入胶体磨， 离心， 取米糠 粕真空脱溶， 得脱脂米糠粕； 2） 酶解和提取： 在米 糠粕中加蒸馏水， 微波提取， 调pH， 加入米糠粨1 2%重量份的复合酶， 搅拌， 灭酶， 离心取上清液； 3） 分离纯化： 超滤， 凝胶层析， 冷冻干燥， 得活性 蛋白； 本发明对米糠进行脱脂、 微波提取， 酶解、 分离纯化， 提高得到提取物的活性蛋白含量， 得 到的活性蛋白纯。
3、度高。 权利要求书1页 说明书4页 CN 106801081 A 2017.06.06 CN 106801081 A 1.一种从米糠中提取活性蛋白的方法， 其特征在于： 所述方法包括以下步骤： 1） 预处理： 在米糠中加入异丙醇， 搅拌， 加入正己烷浸提， 调浆， 倒入胶体磨， 离心， 取米 糠粕真空脱溶， 得脱脂米糠粕； 2） 酶解和提取： 在米糠粕中加蒸馏水， 微波提取， 调pH， 加入米糠粨12%重量份的复合 酶， 搅拌， 灭酶， 离心取上清液； 3） 分离纯化： 超滤， 凝胶层析， 冷冻干燥， 得活性蛋白。 2.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法， 其特征在于： 所述步。
4、骤1 中的米糠与异丙醇的体积比为1： 2.56.3， 米糠与正己烷的体积比为1： 2.76.2； 所述步骤2） 中蒸馏水中含有0.10.1%的苯氧基乙醇和0.010.1%的对氨基苯甲酸盐。 3.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法， 其特征在于： 所述步骤1 中调浆后倒入胶体磨822min， 于32004800r/min离心825min， 得米糠粕和混合油， 取米糠 粕， 真空脱溶的真空度为0.050.2MPa， 温度为4060。 4.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法， 其特征在于： 所述步骤2 中加入米糠重量3045倍的蒸馏水， 微波提取的微波功率为35045。
5、0w， 在4555下微波提 取23次， 每次3050min。 5.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法， 其特征在于： 所述步骤2 中调pH至5.86.3， 所述复合酶由纤维素酶25份、 糖化酶25份、 木瓜蛋白酶25份、 乙醛脱 氢酶0.20.7份、 单宁酶0.61份、 单甘脂 0.10.3份， 搅拌酶解时间为5080min。 6.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法， 其特征在于： 所述步骤3 超滤的滤膜截留分子量为800014000Da， 超滤压力为4104Pa。 7.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法， 其特征在于： 所述步骤3 中凝胶层析的。
6、凝胶悬液由凝胶、 磷酸氢二钠和减盐缓冲液组成， 凝胶与减盐缓冲液的质量 比为1： 0.3： 13， 所述碱盐缓冲液为体积比例为1： 0.83.6混合的0.020.4mol/L NaOH溶液 和含有0.050.8mol/L NaCl的PBS磷酸盐缓冲溶液。 8.根据权利要求1所述的一种从米糠中提取活性蛋白的方法， 其特征在于： 所述步骤3 中凝胶层析后在洗脱液中加入碘颜色反应和茚三酮反应， 收集有显色反应的洗脱液。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106801081 A 2 一种从米糠中提取活性蛋白的方法 技术领域 0001 本发明属于天然产物提取技术领域， 具体涉及一种从米糠中提取活性蛋白的。
7、方 法。 背景技术 0002 米糠是稻谷加工中最重要的一类副产品。 米糠不仅含有丰富的脂质 （1622%） 、 粗 蛋白 （1216%） ， 还含有多种天然活性物质， 如植酸、 谷维素、 - 氨基丁酸、 脂多糖、 生育酚 等。 目前我国米糠年产量已达到1800万吨， 但利用率只有10%， 大部分作为低价值饲料使用， 造成了极大浪费。 0003 米糠蛋白是一种营养价值很高的植物蛋白质， 其中可溶性蛋白约占70%， 必需氨基 酸组成接近人体需要模式， 且赖氨酸和蛋氨酸含量高于大米及其它谷物含量， 可弥补谷物 蛋白某些氨酸酸不足的缺陷。 0004 现有技术如， 中国发明授权专利， 授权公告号CN 1。
8、03351422 B， 该发明公开了一种 从糙米或/和米糠中提取天然生物活性蛋白的方法， 包括： 将糙米或/和米糠经脱脂处理得 到脱脂米粉； 将脱脂米粉与氯化钠水溶液混合， 然后经振荡提取、 第一分离收集上清液， 即 为总盐溶性蛋白溶液； 向总盐溶性蛋白溶液加入乙醇， 混合均匀， 经静置、 第二分离后除去 沉淀部分， 得到生物活性蛋白溶液； 将生物活性蛋白溶液经后处理除乙醇、 除盐分以及干燥 后得到天然生物活性蛋白。 该发明方法采用氯化钠和乙醇两种食品级原料， 能够从糙米或/ 和米糠中提取天然生物活性蛋白， 低成本， 无污染。 该发明方法制备的天然生物活性蛋白， 可以用作制备保健食品、 作为食。
9、品添加剂和应用到化妆品中， 具有广阔的应用前景， 但该提 取方法略为简单， 提取到的提取物中活性蛋白可能不太高， 含有杂质。 0005 现有技术如， 中国发明授权专利， 授权公告号CN 103833786 B， 该发明提供一种米 糠营养和活性物质的高效提取方法。 该方法包括 （1） 全脂米糠筛分除杂；（2） 酸浸泡提取植 酸；（3） 高速剪切辅助复配溶剂浸提米糠毛油；（4） 酶法提取米糠蛋白。 该发明方法可从全脂 米糠中先后高效的提取出植酸、 脂肪和蛋白质， 实现了全脂米糠的高值化全利用， 提高其附 加值， 避免资源浪费， 但该发明提取米糠活性蛋白的纯度不高， 在提取率上还具有提升空 间。 发。
10、明内容 0006 本发明针对上述技术问题提供一种从米糠中提取活性蛋白的方法， 对米糠进行脱 脂、 酶解、 分离纯化， 提高得到提取物的活性蛋白含量， 得到的活性蛋白纯度高， 提高了米糠 的利用价值， 避免资源浪费。 0007 本发明针对上述技术问题所采取的方案为： 一种从米糠中提取活性蛋白的方法， 方法包括以下步骤： 1） 预处理： 在米糠中加入异丙醇， 搅拌， 加入正己烷浸提， 调浆， 倒入胶体磨， 离心， 取米 糠粕真空脱溶， 得脱脂米糠粕； 说明书 1/4 页 3 CN 106801081 A 3 2） 酶解和提取： 在米糠粕中加蒸馏水， 微波提取， 调pH， 加入米糠粨12%重量份的复。
11、合 酶， 搅拌， 灭酶， 离心取上清液； 3） 分离纯化： 超滤， 凝胶层析， 冷冻干燥， 得活性蛋白； 本发明对米糠进行脱脂、 微波提 取， 酶解、 分离纯化， 提高得到提取物的活性蛋白含量， 得到的活性蛋白纯度高。 0008 步骤2） 中蒸馏水中含有0.10.1%的苯氧基乙醇和0.010.1%的对氨基苯甲酸盐。 0009 作为优选， 步骤1中的米糠与异丙醇的体积比为1： 2.56.3， 米糠与正己烷的体积 比为1： 2.76.2， 通过高速剪切辅助复配溶剂浸提的方法， 对米糠中的脂肪进行分离。 0010 作为优选， 步骤1中调浆后倒入胶体磨822min， 于32004800r/min离心8。
12、25min， 得米糠粕和混合油， 取米糠粕， 真空脱溶的真空度为0.050.2MPa， 温度为4060， 脱除米 糠中的脂肪和杂质。 0011 作为优选， 步骤2中加入米糠重量3045倍的蒸馏水， 微波提取的微波功率为350 450w， 在4555下微波提取23次， 每次3050min， 使细胞内部的温度将迅速上升， 从而使 细胞内部的压力超过细胞壁膨胀所能承受的能力， 结果细胞破裂， 其内的有效成分自由流 出。 0012 作为优选， 步骤2中调pH至5.86.3， 复合酶由纤维素酶25份、 糖化酶25份、 木瓜 蛋白酶25份、 乙醛脱氢酶0.20.7份、 单宁酶0.61份、 单甘脂 0.10。
13、.3份， 搅拌酶解时间为 5080min， 利用复合酶可降解多种蛋白质， 提高蛋白质的提取率和纯度， 复合酶的酶解效率 高而且酶解时间快， 效果好。 0013 作为优选， 步骤3超滤的滤膜截留分子量为800014000Da， 超滤压力为4104Pa， 去除多肽、 多糖和盐以获得高纯度的活性蛋白。 0014 作为优选， 步骤3中凝胶层析的凝胶悬液由凝胶、 磷酸氢二钠和减盐缓冲液组成， 凝胶与减盐缓冲液的质量比为1： 0.3： 13， 碱盐缓冲液为体积比例为1： 0.83.6混合的0.02 0.4mol/L NaOH溶液和含有0.050.8mol/L NaCl的PBS磷酸盐缓冲溶液， 用NaCl 。
14、进行柱效 检测与丙酮进行柱效检测效果一样， 凝胶层析后的洗脱液中的活性蛋白纯度高。 0015 作为优选， 步骤3中凝胶层析后在洗脱液中加入碘颜色反应和茚三酮反应， 收集有 显色反应的洗脱液， 获得高含量的活性蛋白的溶液。 0016 与现有技术相比， 本发明的有益效果： 通过高速剪切辅助复配溶剂浸提的方法， 对 米糠中的脂肪进行分离、 加入苯氧基乙醇和对氨基苯甲酸盐， 再通过微波提取使细胞内部 的温度将迅速上升， 从而使细胞内部的压力超过细胞壁膨胀所能承受的能力， 结果细胞破 裂其内的有效成分自由流出， 苯氧基乙醇和对氨基苯甲酸盐具有促进细胞壁破裂的作用， 从而酶解可降解多种蛋白质， 提高蛋白质。
15、的提取率和纯度、 分离纯化， 提高得到提取物的活 性蛋白含量， 得到的活性蛋白纯度高。 具体实施例 0017 以下结合实施例作进一步详细描述： 实施例1 一种从米糠中提取活性蛋白的方法， 方法包括以下步骤： 1） 预处理： 在米糠中加入异丙醇， 搅拌， 加入正己烷浸提， 调浆， 倒入胶体磨， 离心， 取米 糠粕真空脱溶， 得脱脂米糠粕； 说明书 2/4 页 4 CN 106801081 A 4 2） 酶解和提取： 在米糠粕中加蒸馏水， 微波提取， 调pH， 加入米糠粨12%重量份的复合 酶， 搅拌， 灭酶， 离心取上清液； 3） 分离纯化： 超滤， 凝胶层析， 冷冻干燥， 得活性蛋白； 本发明。
16、对米糠进行脱脂、 微波提 取， 酶解、 分离纯化， 提高得到提取物的活性蛋白含量， 得到的活性蛋白纯度高。 0018 步骤2） 中蒸馏水中含有0.10.1%的苯氧基乙醇和0.010.1%的对氨基苯甲酸盐。 0019 步骤1中的米糠与异丙醇的体积比为1： 2.56.3， 米糠与正己烷的体积比为1： 2.7 6.2， 通过高速剪切辅助复配溶剂浸提的方法， 对米糠中的脂肪进行分离。 0020 步骤1中调浆后倒入胶体磨822min， 于32004800r/min离心825min， 得米糠粕和 混合油， 取米糠粕， 真空脱溶的真空度为0.050.2MPa， 温度为4060， 脱除米糠中的脂肪 和杂质。 。
17、0021 步骤2中加入米糠重量3045倍的蒸馏水， 微波提取的微波功率为350450w， 在45 55下微波提取23次， 每次3050min， 使细胞内部的温度将迅速上升， 从而使细胞内部的 压力超过细胞壁膨胀所能承受的能力， 结果细胞破裂， 其内的有效成分自由流出。 0022 步骤2中调pH至5.86.3， 复合酶由纤维素酶25份、 糖化酶25份、 木瓜蛋白酶25 份、 乙醛脱氢酶0.20.7份、 单宁酶0.61份、 单甘脂 0.10.3份， 搅拌酶解时间为5080min， 利用复合酶可降解多种蛋白质， 提高蛋白质的提取率和纯度， 复合酶的酶解效率高而且酶 解时间快， 效果好。 0023 步。
18、骤3超滤的滤膜截留分子量为800014000Da， 超滤压力为4104Pa， 去除多肽、 多糖和盐以获得高纯度的活性蛋白。 0024 步骤3中凝胶层析的凝胶悬液由凝胶、 磷酸氢二钠和减盐缓冲液组成， 凝胶与减盐 缓冲液的质量比为1： 0.3： 13， 碱盐缓冲液为体积比例为1： 0.83.6混合的0.020.4mol/L NaOH溶液和含有0.050.8mol/L NaCl的PBS磷酸盐缓冲溶液， 用NaCl 进行柱效检测与丙酮 进行柱效检测效果一样， 凝胶层析后的洗脱液中的活性蛋白纯度高。 0025 步骤3中凝胶层析后在洗脱液中加入碘颜色反应和茚三酮反应， 收集有显色反应 的洗脱液， 获得高。
19、含量的活性蛋白的溶液。 0026 实施例2 一种从米糠中提取活性蛋白的方法， 方法包括以下优选步骤： 1） 预处理： 在米糠中加入异丙醇， 米糠与异丙醇的体积比优选为1： 3， 搅拌， 加入正己烷 浸提， 米糠与正己烷的体积比优选为1： 3， 调浆， 倒入胶体磨中胶磨9min， 于3500r/min离心 8min， 得米糠粕和混合油， 取米糠粕， 真空脱溶的真空度优选为0.1MPa， 温度优选为52， 得 脱脂米糠粕； 2） 酶解和提取： 加入优选的米糠重量38倍的蒸馏水， 微波提取， 微波功率优选为380w， 在52下微波提取3次， 每次优选40min， 调pH至6.1， 加入优选的米糠粨1。
20、.2%重量份的复合 酶， 搅拌酶解55min， 酶解温度优选为42， 沸水灭酶， 离心取上清液； 3） 分离纯化： 超滤， 滤膜截留分子量优选为12000Da， 超滤压力为4104Pa， 凝胶层析， 在洗脱液中加入碘颜色反应和茚三酮反应， 收集有显色反应的洗脱液， 冷冻干燥， 得活性蛋 白。 0027 步骤2） 中蒸馏水中含有0.1%的苯氧基乙醇和0.01%的对氨基苯甲酸盐。 0028 上述步骤13中的超滤、 凝胶层析等常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技 说明书 3/4 页 5 CN 106801081 A 5 术， 具体操作步骤在此不作详细描述， 参考国标GB/T 5009.5-2010。
21、 中凯式定氮法 （N 5.95） 测定上述米糠活性蛋白提取率为47.4%以上， 纯度在57.8%以上。 0029 步骤2中复合酶由优选的纤维素酶4份、 糖化酶3.5份、 木瓜蛋白酶4份、 乙醛脱氢酶 0.6份、 单宁酶0.7份、 单甘脂 0.18份， 利用复合酶可降解多种蛋白质， 提高蛋白质的提取率 和纯度， 复合酶的酶解效率高而且酶解时间快， 效果好。 0030 步骤3中凝胶层析的凝胶悬液由凝胶、 磷酸氢二钠和减盐缓冲液组成， 凝胶与减盐 缓冲液的质量比优选为1： 0.3： 2， 碱盐缓冲液为体积比例为1： 3混合的0.4mol/L NaOH溶液 和含有0.2mol/L NaCl的PBS磷酸。
22、盐缓冲溶液， 用NaCl 进行柱效检测与丙酮进行柱效检测 效果一样， 凝胶层析后的洗脱液中的活性蛋白纯度高， 凝胶与减盐缓冲液的质量比不仅限 于1： 0.3： 13， 还应包括1： 0.3： 1、 1： 0.3： 1.1、 1： 0.3： 1.2、 1： 0.3： 1.31： 0.3： 2.99、 1： 0.3： 3。 0031 步骤1中的米糠与异丙醇的体积比不仅限于1： 2.56.3， 还应包括1： 2.5、 1： 2.51、 1： 2.52、 1： 2.531： 6.29、 1： 6.3， 米糠与正己烷的体积比不仅限于1： 2.76.2， 还应包括 1： 2.7、 1： 2.71、 1： 2.72、 1.2.731： 6.19、 1： 6.2。 0032 以上实施方式仅用于说明本发明， 而并非对本发明的限制， 本领域的普通技术人 员， 在不脱离本发明的精神和范围的情况下， 还可以做出各种变化和变型。 因此， 所有等同 的技术方案也属于本发明的范畴， 本发明的专利保护范围应由权利要求限定。 说明书 4/4 页 6 CN 106801081 A 6 。