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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201611166570.3 (22)申请日 2016.12.16 (71)申请人 江南大学 地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800 号 (72)发明人 丁重阳王琼艾连中李进伟 苑畅汪瑞石贵阳 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211 代理人 彭素琴 (51)Int.Cl. C12P 19/04(2006.01) A23L 33/125(2016.01) (54)发明名称 一种调控灵芝胞外多糖中单糖组成及比例 的方法 (57)摘要 本发明。
2、公开了一种调控灵芝胞外多糖中单 糖组成及比例的方法， 属于微生物发酵领域。 本 发明方法为通过添加葡萄糖-6-磷酸调控灵芝胞 外多糖中葡萄糖、 甘露糖和半乳糖的比例。 实现 具有特定单糖组成和比例的灵芝多糖的合成， 应 用该方法生产的灵芝多糖具有有效抑制肿瘤细 胞的生物活性， 抑制率可达80以上， 为将来合 成具有较高生物活性、 结构均一、 生产可控的灵 芝多糖奠定基础。 权利要求书1页 说明书4页 CN 106755183 A 2017.05.31 CN 106755183 A 1.一种调控灵芝胞外多糖中单糖组成及比例方法， 其特征在于， 所述方法是在灵芝的 发酵培养基中添加0.10.6g/。
3、L的葡萄糖-6-磷酸进行发酵。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述发酵培养基每L含有葡萄糖1525g， 胰蛋白胨46g， 无氨基酵母38g， 初始pH67。 3.根据权利要求1或2所述的方法， 其特征在于， 所述调控灵芝胞外多糖中单糖组成及 比例是指控制胞外多糖中葡萄糖的含量占胞外多糖总量的比例80。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述调控灵芝胞外多糖中单糖组成及比例 是指控制胞外多糖中葡萄糖： 甘露糖： 半乳糖1314:34:13。 5.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述调控灵芝胞外多糖中单糖组成及比例 是指控制胞外多糖中葡萄糖： 甘露糖： 半乳糖。
4、1011:56:34。 6.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于， 所述调控灵芝胞外多糖中单糖组成及比例 是指控制胞外多糖中葡萄糖： 甘露糖： 半乳糖910:67:23。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述发酵是以0.51g菌丝体/L培养基的 接种量进行接种， 在2533， 150200r/min发酵57d。 8.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述添加0.10.6g/L的葡萄糖-6-磷酸在 发酵第096h向发酵培养基中添加。 9.应用权利要求1-2,4-8任一所述方法生产的灵芝胞外多糖。 10.权利要求12,48任一所述方法在制备含灵芝胞外多糖的功能性食品、 保健。
5、品方 面的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106755183 A 2 一种调控灵芝胞外多糖中单糖组成及比例的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种调控灵芝胞外多糖中单糖组成及比例的方法， 属于微生物发酵领 域。 背景技术 0002 灵芝(Ganoderma lucidum)是名贵的食药用真菌， 我国古代称其子实体为 “仙草” ， 卫生部已经批准灵芝为食品新资源。 灵芝多糖是灵芝主要的有效化学物质之一， 是一类以 葡萄糖为主的 -(1,3)和 -(1,4)键连接而成的多糖或杂多糖类大分子物质。 包括灵芝多糖 在内的食用真菌多糖的产生与分泌是一个非常复杂的过程， 在不同培养批次之间， 。
6、较难得 到分子量相同的多糖组分， 即使能得到分子量相同的多糖组分， 它们的单糖组成及比例也 难以达到完全一致。 目前所报道的众多结构不一的灵芝多糖或高或低均表现出一定的生物 活性， 但上述的这种不均一性使得其在功能性食品或食品组分方面的基础和应用基础研究 难以有效的深入展开。 因此， 如何高效、 稳定地合成具有特定单糖组成和比例的灵芝多糖是 一个亟待突破的瓶颈问题。 发明内容 0003 本发明的目的是提供一种调控灵芝胞外多糖中单糖组成及比例方法， 所述方法是 在灵芝的发酵培养基中添加0.10.6g/L的葡萄糖-6-磷酸进行发酵。 0004 在本发明的一种实施方式中， 所述发酵培养基每L含有葡萄。
7、糖1525g， 胰蛋白胨4 6g， 无氨基酵母38g， 初始pH67。 0005 在本发明的一种实施方式中， 所述发酵培养基每L含有葡萄糖20g， 胰蛋白胨5g， 无 氨基酵母(YNB)5g， 初始pH67。 0006 在本发明的一种实施方式中， 所述调控灵芝胞外多糖中单糖组成及比例是指控制 胞外多糖中葡萄糖的含量占胞外多糖总量的比例80。 0007 在本发明的一种实施方式中， 所述调控灵芝胞外多糖中单糖组成及比例是指控制 胞外多糖中葡萄糖： 甘露糖： 半乳糖1314:34:13。 0008 在本发明的一种实施方式中， 所述调控灵芝胞外多糖中单糖组成及比例是指控制 胞外多糖中葡萄糖： 甘露糖：。
8、 半乳糖1011:56:34。 0009 在本发明的一种实施方式中， 所述调控灵芝胞外多糖中单糖组成及比例是指控制 胞外多糖中葡萄糖： 甘露糖： 半乳糖910:67:23。 0010 在本发明的一种实施方式中， 所述发酵是在2533， 150200r/min发酵57d。 0011 在本发明的一种实施方式中， 所述发酵是以0.51g菌丝体/L培养基的接种量进 行接种。 0012 在本发明的一种实施方式中， 所述发酵是在发酵第096h向发酵培养基中加入 0.10,6g/L葡萄糖-6-磷酸。 0013 本发明的第二个目的是提供应用所述方法生产的灵芝胞外多糖。 说明书 1/4 页 3 CN 10675。
9、5183 A 3 0014 本发明的第三个目的是提供所述方法在制备含灵芝胞外多糖的功能性食品、 保健 品方面的应用。 0015 有益效果： 本发明可通过调控葡萄糖-6-磷酸的添加量和添加时间， 实现具有特定 单糖组成和比例的灵芝多糖的合成， 应用该方法生产的灵芝多糖具有有效抑制肿瘤细胞的 生物活性， 抑制率达80以上， 为将来合成具有较高生物活性、 结构均一、 生产可控的灵芝 多糖奠定基础。 具体实施方式 0016 多糖提取： 取100ml发酵液滤液， 加0.4倍的95工业酒精， 搅拌20min， 4000r/min 离心5min， 去除蛋白， 上清液加2.25倍95工业酒精， 搅拌20min。
10、， 4过夜。 10000r/min离心 5分钟， 去上清， 沉淀加30ml蒸馏水溶解， 10000r/min离心10min， 清夜冷冻干燥后为灵芝胞 外多糖粉。 0017 多糖水解： 称取20毫克左右多糖粗品于水解管中， 加入2ml 1mol/L的硫酸水溶液， 封管， 于105水解8小时， 水解液用碳酸钡中和， 离心洗涤2次， 上清液合并后冷冻干燥， 得 到的干燥物即为游离单糖。 0018 衍生化： 称取上述干燥单糖样加入10mg盐酸羟胺， 加入1mg肌醇作为内标， 0.5ml吡 啶， 于90水浴中保持30分钟； 取出冷却后加入0.5ml乙酸酐于90水浴中保持30分钟， 待 样品冷却后进行GC。
11、分析。 0019 色谱分析条件： 采用岛津GC-14A气相色谱仪、 OV1701石英毛细管柱、 FID检测器， 气 化室温度260， 检测器温度250， 柱温起始温度120， 保持3分钟， 每分钟升10， 至195 ， 保留0.1分钟。 每分钟升3， 至240， 保留10分钟。 载气压力(N2)0.60kg/cm2， 燃气压力 (H2)0.65kg/cm2， 助燃气压力(空气)0.50kg/cm2， 分流比为30:1。 0020 单糖分析： 以内标法定出各单糖含量。 0021 0022 式中Ai表示某单糖样品峰面积； AIi表示样品中加入的肌醇内标峰面积； AIs表示标 样中加入的肌醇内标峰面。
12、积； As表示某单糖标样峰面积； Ws表示某单糖标样的重量(mg)； WIs 表示标样中加入的肌醇内标的重量(mg)； WIi表示样品中加入的肌醇内标的重量(mg)； W表示 称取糖样品的重量(mg)。 0023 基本培养基(gL-1)： 葡萄糖20， 胰蛋白胨5， 无氨基酵母(YNB)5， 初始pH6.0， 用 于灵芝的种子培养和液体发酵培养。 0024 灵芝多糖对体外肿瘤细胞抑制率的测定： 本实验选取皮肤基底癌细胞A431和人乳 腺癌细胞MDA-MB-231两株细胞。 细胞贴壁均匀后， 用胰蛋白酶消化配置成合适浓度的细胞 悬浮液。 采用96孔板， 每孔加100 L细胞悬浮液。 空白组中加等。
13、量的DMEM完全培养基， 于细胞 箱中培养一天。 将96孔板中原来的培养基去除， 分别更换不同剂量的DMEM培养基配置的多 糖样品100 L(浓度为2g/L)。 每个样品设6个复孔作为平行。 空白组更换新的DMEM培养基。 加 样后继续在细胞箱中培养。 每孔加入2 L噻唑蓝(thiazolyl blue)， 在细胞箱中再继续培养 4h。 将每孔中的培养液更换为150 L的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide DMSO)。 在双波长 570nm(检测波长)和630nm(参考波长)酶标仪上测定吸光值A。 按照公式计算肿瘤抑制率： 说明书 2/4 页 4 CN 106755183 A 4。
14、 0025 0026 实施例1 0027 灵芝种子培养： 取0.5cm2大小的菌块， 接种于装液量80mL/250mL三角瓶的基本培 养基中， 150rmin-1、 30培养7d。 0028 灵芝发酵培养： 500ml三角瓶中加入150ml培养基， 初始pH 6.0， 110灭菌20分钟。 接种量为0.5g湿重灵芝菌丝体， 150rmin-1、 30培养7d。 0029 发酵结束后， 测定灵芝胞外多糖中的单糖组成。 结果显示， 灵芝多糖中葡萄糖、 甘 露糖和半乳糖所占比例分别为81.64、 9.44和6.98。 0030 实施例2 0031 灵芝种子培养： 取0.5cm2大小的菌块， 接种于装。
15、液量80mL/250mL三角瓶的基本培 养基中， 150rmin-1、 30培养7d。 0032 灵芝发酵培养： 500ml三角瓶中加入150ml培养基， 葡萄糖-6-磷酸的添加量为 0.1g/L， 初始pH 6.0， 110灭菌20分钟。 接种量为0.5g湿重灵芝菌丝体， 150rmin-1、 30 培养7d。 0033 发酵结束后， 测定灵芝胞外多糖中的单糖组成。 结果显示， 当葡萄糖-6-磷酸添加 量为0.1g/l时， 灵芝多糖中葡萄糖、 甘露糖和半乳糖所占比例分别为69.47、 16.66和 8.89。 0034 实施例3 0035 灵芝种子培养： 取0.5cm2大小的菌块， 接种于装。
16、液量80mL/250mL三角瓶的基本培 养基中， 150rmin-1、 30培养7d。 0036 灵芝发酵培养： 500ml三角瓶中加入150ml培养基， 葡萄糖-6-磷酸的添加量为 0.3g/L， 初始pH 6.0， 110灭菌20分钟。 接种量为0.5g湿重灵芝菌丝体， 150rmin-1、 30 培养7d。 0037 发酵结束后， 测定灵芝胞外多糖中的单糖组成。 结果显示， 当葡萄糖-6-磷酸添加 量为0.3g/L时， 葡萄糖、 甘露糖和半乳糖所占比例分别为53.02、 29.02和15.51。 0038 实施例4 0039 灵芝种子培养： 取0.5cm2大小的菌块， 接种于装液量80m。
17、L/250mL三角瓶的基本培 养基中， 150rmin-1、 30培养7d。 0040 灵芝发酵培养： 500ml三角瓶中加入150ml培养基， 葡萄糖-6-磷酸的添加量为 0.6g/L， 初始pH 6.0， 110灭菌20分钟。 接种量为0.5g湿重灵芝菌丝体， 150rmin-1、 30 培养7d。 0041 发酵结束后， 测定灵芝胞外多糖中的单糖组成。 结果显示， 当葡萄糖-6-磷酸添加 量为0.6g/L时， 葡萄糖、 甘露糖和半乳糖所占比例分别为49.92、 34.33和13.89。 0042 实施例5 0043 培养基和培养方法同实施例1， 区别在于， 在发酵48h时添加0.3g/l。
18、葡萄糖-6-磷 酸。 发酵结束后， 测定灵芝胞外多糖中的单糖组成。 结果显示， 发酵48h添加葡萄糖-6-磷酸 时， 葡萄糖、 甘露糖和半乳糖所占比例分别为67.27、 19.80和10.44。 0044 实施例6 说明书 3/4 页 5 CN 106755183 A 5 0045 培养基和培养方法同实施例1， 区别在于， 在发酵96h时添加0.3g/l葡萄糖-6-磷 酸。 发酵结束后， 测定灵芝胞外多糖中的单糖组成。 结果显示， 发酵96h添加葡萄糖-6-磷酸 时， 葡萄糖、 甘露糖和半乳糖所占比例分别为77.59、 10.56和7.96。 0046 实施例7 0047 培养基和培养方法同实。
19、施例3， 区别在于， 将0.3g/L葡萄糖-6-磷酸替换为0.3g/L 葡萄糖-1-磷酸。 发酵结束后， 测定灵芝胞外多糖中的单糖组成。 结果显示， 当葡萄糖-1-磷 酸添加量为0.3g/L发酵7d， 葡萄糖、 甘露糖和半乳糖所占比例分别为84.06、 8.69和 6.87。 0048 实施例8 0049 培养基和培养方法同实施例3， 区别在于， 将0.3g/L葡萄糖-6-磷酸替换为0.3g/L 果糖-1， 6-二磷酸。 发酵结束后， 测定灵芝胞外多糖中的单糖组成。 结果显示， 当果糖-1， 6- 二磷酸添加量为0.3g/L发酵7d， 葡萄糖、 甘露糖和半乳糖所占比例分别为81.05、 11.40 和7.30。 0050 实施例9 0051 对实施例1-8制备的灵芝多糖抗肿瘤活性进行测定， 结果如表1所示。 实施例26 的方法制备的灵芝多糖对肿瘤细胞的抑制率均为60以上， 具有较强的生物活性。 0052 表1 灵芝多糖对癌细胞的抑制作用 0053 0054 虽然本发明已以较佳实施例公开如上， 但其并非用以限定本发明， 任何熟悉此技 术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内， 都可做各种的改动与修饰， 因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。 说明书 4/4 页 6 CN 106755183 A 6 。