技术领域：
本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一个水稻锌指蛋白基因DNA片段(基因)的分离克隆、功能验证和应用。
背景技术：
植物由于其固着生长的生物学特性，使植物在生长发育过程中与环境密切相关，并且在生长过程中不可避免地受环境信号的调控并遭遇到各种逆境胁迫，如盐碱、贫瘠、干旱的土地，寒冷、冰冻的气候，各种病原微生物的侵害等，而干旱、盐碱、高温等非生物胁迫是目前引起世界范围内农作物减产的主要原因，世界各国政府及科研人员都迫切希望通过生物技术途径帮助解决这个重大问题。植物对逆境的响应和适应不仅通过生理生化过程，还需要通过分子细胞水平的调控，所以研究植物在逆境条件下的生长发育特性，尤其在分子水平揭示这种特性，是培育能在逆境条件下正常生长发育的植物的重要基础；更是利用现代生物技术改良植物获得抗逆性强的植物的先决条件。
干旱、高盐和低温等环境胁迫已极大的限制了全世界粮食产量的提高，干旱是限制农业生产的最主要因素。据统计，干旱对世界粮食作物的影响在各种自然灾害中居于首位，其危害相当于其它自然灾害之和。因此，认识植物对干旱的反应机制，提高植物的抗旱性，是农业增产的重要基础。在干旱等逆境下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度地减少环境所造成的伤害并得以生存。干旱对植物的影响主要是引起渗透胁迫并抑制植物的生长、损伤植物细胞，最终引起DNA的降解而导致植物细胞的死亡。干旱对植物的影响，仅有一部分可能是植物的一种适应反应，许多反应是因胁迫而致的生理损伤结果。这一过程与植物对高盐及低温引起的渗透胁迫的反应相似。
现有的研究表明，渗透胁迫能够诱导或抑制基因的表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。泛素(Ubiquitin)是一种在真核生物中普遍存在的由76个氨基酸组成的小蛋白，其氨基酸序列和结构都高度保守。泛素介导的蛋白质降解是通过泛素/26S蛋白酶体途径实现的。其基本过程是：泛素分子在ATP存在的情况下被泛素激活酶(E1)激活，使泛素的C末端甘氨酸结合到E1的半胱氨酸巯基上，然后转移到泛素结合酶(E2)的半胱氨酸巯基上，最后在泛素连接酶(E3)的作用下，共价连接到靶蛋白分子的赖氨酸残基上，形成多聚Ub-靶蛋白复合物；该复合物被26S蛋白酶体所识别并被降解成小肽或氨基酸，同时释放Ub供循环利用。大量研究表明，由泛素介导的蛋白质降解是生物体维持自身正常生长发育和适应环境的重要生理生化过程。目前，在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中已经鉴定出XERICO(KO et al.，2006)、SIZ1(Catala et al.，2006)、SDIR1(Zhang et al.，2007)、DRIP1和DRIP2(Qin et al.，2008)以及PUB22和PUB23(Cho et al.，2008)等泛素连接酶直接参与植物对干旱反应关键步骤的控制，超量表达或抑制这些基因的表达能显著增强植物的抗旱性，这些研究表明泛素介导的蛋白质降解在植物抗旱反应中起着重要作用。
水稻是世界主要粮食作物，全世界约三分之二的人口以稻米为食。而我国是最大的稻米生产国和消费国，其稻作面积和稻作总产量分别占全世界23％和37％，世界范围内的降水减少和分布不均对其生产影响很大。再者，我国每年用水总量为5000亿m3，农业用水占70％，而水稻又是农业耗水的第一大户，其耗水量占全国总用水量的54％左右，占农业总用水量的65％以上。随着我国人口的不断增加，工业的快速发展和生态环境的恶化，我国正面临着越来越严重的缺水问题，干早严重制约着我国粮食产量的提高，因此进行水稻抗早性研究，对于提高作物抗早性和减少农业生产用水具有重要意义。但目前在水稻中培育出的抗旱转基因水稻还较少，因此找出水稻中与抗旱相关的泛素连接酶，培育抗旱的品种对提高水稻产量具有重要意义。
发明内容：
本发明所要解决的技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种水稻抗旱性OsSINAT5基因及其编码蛋白与应用，可提高水稻的抗旱性。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种水稻抗旱性OsSINAT5基因在培育抗旱性水稻中的应用，该水稻抗旱性OsSINAT5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
含有水稻抗旱性OsSINAT5基因的重组表达载体在培育抗旱性水稻中的应用，所述重组表达载体分为OsSINAT5超量表达载体和抑制表达载体，该超量表达载体是将全长OsSINAT5基因CDS SEQ ID NO：3定向克隆到pubix.nc 1300.ntap.gck载体Ubiquitin启动子下得到的重组表达载体，该抑制表达载体是利用pANDA载体通过PCR克隆如SEQ ID NO：4所示的OsSINAT5基因编码前92个氨基酸的DNA 序列得到的抑制表达载体。
一种培育抗旱水稻的方法，是将含有水稻抗旱性OsSINAT5基因的重组表达载体导入水稻细胞中，得到抗旱水稻，该重组表达载体分为OsSINAT5超量表达载体和抑制表达载体，该超量表达载体是将全长OsSINAT5基因CDS SEQ ID NO：3定向克隆到pubix.nc1300.ntap.gck载体Ubiquitin启动子下得到的重组表达载体，该抑制表达载体是利用pANDA载体通过PCR克隆如SEQ ID NO：4所示的OsSINAT5基因编码前92个氨基酸的DNA序列得到的抑制表达载体。
利用上述基因的编码蛋白：
1)利用RNAi或者其它技术抑制OsS INAT5基因的表达，本发明利用pANDA载体，通过PCR克隆如SEQ ID No：4所示的该水稻OsSINAT5基因编码前92个氨基酸的DNA序列构建RNAi表达载体；
2)、水稻抗旱性基因OsSINAT5构建RNAi表达载体导入植物组织或细胞，得到转基因植株。
本发明所提供的与水稻抗旱性相关的基因，名称为OsSINAT5(与拟南芥中SINAT5同源)，该基因在水稻基因组数据库TIGR中的编号为Os03g24040，编码一个含有“SINA”结构域的RING类型的泛素连接酶，该基因的CDS全长906bp，编码302aa的蛋白。到目前还没有任何关于OsSINAT5功能的研究报道。本发明所述基因即是稻基因组数据库TIGR中的编号为Os03g24040的基因，来源于水稻，是下列核苷酸序列之一：
1)序列表SEQ ID No：1的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID No：2蛋白质序列的多核苷酸；
3)与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列具有90％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
4)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No：1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为在0.1XSSPE(或0.1XSSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
序列表中序列1的DNA序列由4963个碱基组成，含有四个外显子，分别为自5′端第601位到第799位碱基；自5′端第2254位到第2477位碱基；自5′端第2381位到第3216位碱基；自5′端第3681位到第4363位碱基。该序列编码SEQ ID No：2的核苷酸残基序列。
与水稻耐旱性相关的基因OsSINAT5的编码蛋白OsSINAT5，是具有序列表中SEQ ID No：2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID No：2的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No：2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID No：2衍生的蛋白质。
序列表中序列2氨基酸残基序列是由302个氨基酸残基组成的蛋白质。
含有本发明基因OsSINAT5的表达载体、转基因细胞系及寄主菌均属于本发明的保护范围。
扩增OsSINAT5中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
用于构建所述植物表达载体的出发载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。利用任意一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明的OsSINAT5基因在植物中超量表达就表现旱敏感，而将此基因抑制表达后，植物表现为耐旱。
本发明的基因在构建到植物表达载体上时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一个强启动子或诱导性启动子，也可使用增强子。
携带有本发明OsSINAT5基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射以及电穿孔等常规生物技术方法转入植物细胞，并培育出抗旱性得到改良的植物。被转化的植物寄主可以是水稻、玉米、小麦等单子叶植物，也适用于烟草、大豆等双子叶植物，培育抗旱的植物品种。
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明：
图1为采用ClustalW软件(公开使用软件)将水稻OsSINAT5蛋白与其拟南芥中同源蛋白进行同源性比较结果。
黑色表示高度保守的氨基酸，“*” 分别表示其保守的ring-finger和zinc-finger。
图2-A和图2-B为OsSINAT5和OsSINAT5RING突变的E3泛素连接酶反应。其中：
图2-A为OsSINAT5RING finger结构域的示意图和氨基酸突变位点。
图2-B为OsSINAT5蛋白的体外泛素化反应。
在体外用小麦的E1、人的E2和6xHis标签泛素(Ub)，与GST-OsSINAT5 和GST-OsSINAT5(H71Y)RING突变的融合蛋白共孵育做E3活性检测。左边的数字显示蛋白的分子量，单位为千道尔顿(kD)。RC表示共孵育时间，单位为分钟(min)。GST为实验的负对照。样品经8％SDS-PAGE电泳分离，Western用Nickel-HRP检测His标签的泛素。
图3为GFP-OsSINAT5融合蛋白在水稻原生质体中的亚细胞定位。
转染后18h用激光共聚焦显微观察目的蛋白定位。上排图中从左到右依次为：GFP对照在明场、绿色荧光下以及明场和绿色荧光合并下的结果；下排图中从左到右依次为：GFP-OsSINAT5融合蛋白在明场、绿色荧光下以及明场和绿色荧光合并下的结果。
图4-A为OsSINAT5超表达转基因植物Northern杂交检测。
第一道为对照，其余为转基因独立转基因株系，每个样品的加样量为10ug的总RNA，28SrRNA作为RNA加样对照。
图4-B为OsSINAT5RANi转基因植物RT-PCR检测。
第一道为对照，其余为转基因独立转基因株系，OsActin1基因被作为内参。
图5-A至图5-D为OsSINAT5转基因植物对干旱的不同反应。
对培养于1/2MS培养基两个星期大的植物进行干旱处理实验，从左到右依次为OsSINAT5超表达植物(OsSINAT5-OV)，野生型(WT)，OsSINAT5RNAi抑制植物(OsSINAT5-RNAi)。
图5-A为干旱处理五天后，OsSINAT5转基因植物与野生型比较的结果。
图5-B为干旱处理六天后复水前，OsSINAT5转基因植物与野生型比较的结果。
图5-C为干旱处理六天复水1d后，OsSINAT5转基因植物与野生型比较的结果。
图5-D为干旱处理六天复水1d后，OsSINAT5转基因植物与野生型成活率统计(n＝15)。
具体实施方式：
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1、植物抗逆性相关蛋白OsSINAT5及其编码基因的获得
微陈列(Microarray)分析的结果表明水稻Os03g24040基因是一个受干旱 诱导的基因，利用BLAST程序发现它与拟南芥中SINAT5高度同源，于是命名为OsSINAT5。根据水稻已公布序列，设计引物扩增OsSINAT5基因的蛋白编码区(SEQ ID No：3)，用于进一步研究。克隆PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，59℃30sec；72℃1min，28个循环；72℃延伸10min。特异性引物如下：
F1(5’-GG ATGGCCTCAGTTACTTATATTG-3’)，斜体碱基为HindIII酶切位点；
F2(5’-GG TCACTGTTCCTTCCAAATTCTC-3’)，斜体碱基为BamHI酶切位点)
提取两周苗龄的野生型水稻日本晴的幼苗总RNA反转录得到第一链cDNA。以其为模板，用F1和F2进行PCR扩增。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为900kb的条带。用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收该片段。将该回收片段与载体pGEM-T Easy连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定，测序结果表明扩增到了OsSINAT5基因的蛋白编码区，OsSINAT5基因的蛋白编码区序列如SEQ ID No：3所示，由906个脱氧核糖核苷酸组成，编码SEQ ID No：2所示的蛋白。
实施例2、OsSINAT5蛋白的泛素连接酶活性
采用体外表达OsSINAT5蛋白及其RING finger突变蛋白OsSINAT5(H71)的方法来考察其是否具有泛素蛋白连接酶活性。
2，1原核表达载体pGEX-OsSINAT5的构建
根据OsSINAT5基因的序列设计其特异性引物，将OsSINAT5全长CDS定向克隆入pGEX-6p-1融合蛋白表达载体中，用热击法转入大肠杆菌XL1-Blue中。融合蛋白的表达、纯化均按分子克隆中操作步骤进行。纯化后的融合蛋白用于Ubiquitination反应。克隆PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，59℃30sec；72℃1min，28个循环；72℃延伸10min特异性引物序列如下
F1：5’-GG ATGGCCTCAGTTACTTATATTG-3’，斜体碱基为BamHI酶切位点；
F2：5’-GG TCACTGTTCCTTCCAAATTCTC-3’，斜体碱基EcoRI为酶切位点)
2，2OsSINAT5RING finger突变蛋白的获得
如图1和图2-A所示，OsSINAT5存在保守的RING finger结构域，为了验证OsSINAT5蛋白的E3连接酶是否与RING finger结构域有关，我们利用快速定点突变试剂盒(Stratagene)把OsSINAT5CDS第211位胞嘧啶C突变为腺嘌呤A，使读码框由CAT突变为AAT，如图2-A所示，编码氨基酸由组氨酸(H)变为酪氨酸(Y)，破坏了RING finger结构域的保守性。获得包含点突变的OsSINAT5CDS序列后，按照2，1中OsSINAT5原核表达载体的构建方法进行pGEX-OsSINAT5(H71Y)的构建。H71Y点突变的特异性引物序列如下：
F1：5’-CATCAGTGCTCTAATGGTtATACATTGTGCTCTGGATGC-3’
F2：5’GCATCCAGAGCACAATGTAtaACCATTAGAGCACTGATG-3’2，3OsSINAT5及OsSINAT5(H71Y)突变蛋白体外泛素化反应
在小麦(Triticum aestivum)E1(GI：136632)、人的E2(UBCh5b)和6xHis标签泛素(Ub)、纯化了的GST融合的E3(～1μg)及ATP存在的共同作用下，His-Ub可以与GST-E3连接，并且随着His-Ub的不断增加，形成多聚泛素(Poly-Ub)链，蛋白的分子量也随之增加。而蛋白是否有与His-Ub连接，可以通过SDS-PAGE凝胶电泳按分子量大小分离蛋白后，用Nickel-HRP杂His-Ub经Western实验(选用0.2μm的PVDF膜)，分析是否GST-E3已经加上Poly-Ub。
将纯化了的GST、GST-OsSINAT5、GST-OsSINAT5(H71Y)蛋白加入1.5μL 20×reaction buffer(1M Tris pH7.5，40mM ATP sigma，100mM MgCl2，40mMDTT)，3μL E1(粗提的E1，大约50ng)，3ul E2(粗提的E2，约40ng)，2μL纯化的His-Ub(约2μg)，加ddH2O至总体积为30μL。在Eppendorf Thermomixercomfort仪器上，30℃，900rpm孵育，为了进一步验证OsSINAT5是否会随着孵育时间的增加加上更多的Ub，我们对OsSINAT5野生型蛋白设置了15min，30min，60min三个孵育时间，缺E1、缺E2、GST对照以及OsSINAT5(H71Y)蛋白反应时间均为90min。反应后每管各加入10μl 4×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水中煮5-10min，取15μL进行SDS-PAGE电泳。电泳后进行Western杂交检测。如图2-B中所示，纯化的GST-OsSINAT5蛋白在与小麦的E1和人的E2共孵育的条件下，可以检 测出OsSINAT5具有体外泛素化的活性，并且随着孵育时间15min、30min、60min的增加，形成越来越多的多聚泛素(Poly-Ub)链。然而，OsSINAT5(H71Y)蛋白在孵育90min后仍未检测到任何多聚泛素链，OsSINAT5蛋白突变体OsSINAT5(H71Y)的E3连接酶的活性完全消失了，说明OsSINAT5蛋白中完整的RING结构确实是OsSINAT5蛋白E3连接酶活性必须的。
实施例3、OsSINAT5蛋白的亚细胞定位
为了进一步验证OsSINAT5蛋白的亚细胞定位，本发明根据OsSINAT5基因的序列设计其特异性引物，利用pGDG(Goodin et al.，2002)载体构建了pGDG-OsSINAT5表达载体，通过水稻原生质体转染(Chen et al.，2006)使融合基因在植物细胞内瞬间表达，转染后18h用激光共聚焦显微观察目的蛋白定位。克隆PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃ 30sec，59℃ 30sec；72℃ 1min，28个循环；72℃延伸10min特异性引物如下：
F1(5’-GG ATGGCCTCAGTTACTTATATTG-3’)，斜体碱基为HindIII酶切位点；
F2(5’-GG TCACTGTTCCTTCCAAATTCTC-3’)，斜体碱基为BamHI酶切位点)；
用激光共聚焦显微观察瞬间表达结果显示，GSF对照在整个细胞中，包括细胞质和细胞核中均能检测到，而GFP-OsSINAT5蛋白绝大多数分布于细胞核，这一结果与其在拟南芥中同源蛋白SINAT5是一致的。
实施例4、OsSINAT5基因超量表达、抑制表达载体的构建和转化
为了能更好地阐明此基因的功能，申请人将其在水稻中抑制表达和超量表达，从转基因植物的表型来验证。
OsSINAT5基因超量表达和RNAi载体采用Gateway技术(Invitrogen)。超量表达载体构建方法如下：将全长OsSINAT5基因CDS(SEQ ID No：3)定向克隆到pubix.nc1300.ntap.gck载体(Puig at el.，2001)Ubiquitin启动子下，用于得到水稻pUbiquitin-OsSINAT5超量表达植物。抑制表达(RNAi)载体构建方法如下：通过Blast程序比对发现在水稻中OsSINAT5基因还有五个同源基因且具有较高的同源性，但是其编码前92个氨基酸的DNA序列存在明显的特异性(SEQ ID No：4)，选择其作为构建RNAi载体的靶序列。通过PCR克隆该目 的序列，选用pANDA载体(Miki and Shimamoto，2003)，重组反应按Invitrogen公司提供的重组克隆试剂盒说明书进行。
通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法将其导入到水稻品种“日本晴”中，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、炼苗移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻遗传转化方法应用Qu等人报道的方法(Qu et al.，2006)。简要介绍如下：
4，1水稻转化涉及的培养基
1)愈伤组织诱导培养基
NB：N6大量元素及微量元素十B5有机成分十铁盐十脯氨酸500mg/L 十酶水解干酪素(CEH)300mg/L 十2，4-D 2.5mg/L 十蔗糖30g/L 十植物凝胶2.5g/L，pH5.8。
2)愈伤组织继代培养基
L3：L3大量元素及微量元素十L3有机成分十铁盐十脯氨酸500mg/L 十谷氨酰胺500mg/L 十2，4-D 2.5mg/L 十麦芽糖30g/L 十植物凝胶2.8g/L，pH5.8。
3)愈伤组织共培养培养基
NS：N6大量元素及微量元素十B5 有机成分+铁盐十酶水解干酪素(CEH)1000mg/L 十蔗糖30g/L 十葡萄糖10g/L 十乙酰丁香酮200umol/L 十植物凝胶2.3g/L，pH5.2。
4)愈伤组织筛选培养基
S40：L3大量元素及微量元素十L3有机成分十铁盐十脯氨酸500mg/L 十谷氨酰胺500mg/L 十2，4-D 2.5mg/L 十氨苄青霉素200mg/L 十头孢霉素250mg/L十麦芽糖30g/L 十潮霉素40mg/L 十植物凝胶3.0g/L，pH5.8。
5)愈伤组织预分化培养基
PDL：N6大量元素及微量元素十B5 有机成分十铁盐十脯氨酸500mg/L十酶水解干酪素((CEH)300mg/L 十6-BA 1.0mg/L 十NAA2.0mg/L 十ABA5.0mg/L 十潮霉素50mg/L 十蔗糖30g/L 十植物凝胶3.0g/L，pH5.8。
6)愈伤组织分化培养基
DL：N6大量元素及微量元素十B5有机成分十铁盐十脯氨酸500mg/L十酶水解干酪素((CEH)300mg/L 十6-BA 2.0mg/L 十KT1.0mg/L 十NAA1.0mg/L 十IAA1.0mg/L 十麦芽糖30g/L 十植物凝胶3.0g/L，pH5.8。
7)生根及壮苗培养基
1/2MS：1/2MS大量元素和微量元素十1/2MS有机成分十铁盐十蔗糖30g/L 十潮霉素20mg/L 十植物凝胶3.0g/L，pH5.8。
8)CC培养基
CC大量元素及微量元素十CC有机成分十铁盐十脯氨酸500mg/L 十谷氨酰胺500mg/L 十酶水解干酪素(CEH)300mg/L 十2，4-D 2.5mg/L 十蔗糖30g/L 十植物凝胶2.5g/L，pH5.8。
9)N6培养基
N6基本成分十脯氨酸500mg/L十酶水解干酪素(CEH)300mg/L十2，4-D2.5mg/L 十蔗糖30g/L 十植物凝胶2.5g/L，pH5.8。
10)YENB培养基
YE酵母粉提取物7.5g/L 十营养肉汤8g/L 十琼脂粉15g/L，pH7.0。
11)LB培养基
蛋白胨10g/L 十酵母粉5g/L 十NaCl 10g/L 十琼脂粉15g/L，pH7.0。
12)SOB培养基
蛋白胨20g/L 十酵母粉5g/L 十NaCl 0.5g/L 十琼脂粉15g/L，pH7.0。
13)SOC培养基
SOB培养基(已灭菌)十20ml 除菌的1mol/L葡萄糖液。
4，2农杆菌感受态的制备
1)农杆菌EHA105菌株单菌落，接种于5mlYENB液体培养基中，28℃，200rpm培养至OD600值为0.4。
2)取农杆菌菌液1ml，按1∶100比例加入100ml YENB液体培养基中，28℃，250rpm，振荡培养2.5～3h。
3)将培养液倒入用冰预冷的无菌离心管中，置冰上冷却10min，4℃4000rpm离心5min，弃上清，尽量倒尽残液。
4)加入34ml预冷的0.1M CaCl2重悬沉淀，置冰上1h。
5)4℃，4000rpm，离心5min，弃上清，尽量流尽残液。
6)加20％甘油(冰中预冷)20ml，4℃ 4000rpm离心5min，弃上清。
7)在沉淀中加入2ml 10％的甘油，每管80ul分装于1.5ml离心管，-80℃冰箱保存。
4，3愈伤组织诱导及继代
1)将成熟水稻种子去壳。
2)70％酒精消毒1～3min。
3)用0.1％的升汞消毒15min，其间不断摇动。
4)用无菌水洗4～5次，并用灭菌滤纸吸干。
5)将米粒平放于2，4-D浓度为2.5mg/L的愈伤组织诱导培养基NB上，于26℃暗培养8～10d，统计愈伤组织诱导率。
6)将愈伤组织转入继代培养基L3中继代，10～15d后进行共培养。
4，4农杆菌对水稻愈伤组织的转化
1)挑取-80℃保存的农杆菌转化子在含有抗生素的LB固体培养基上划线(50mg/L Kanamycin，50mg/L Rifampicin)，28℃暗培养至长出菌落。
2)挑取单菌落于5mL含有抗生素的LB液体培养基中(50mg/L Kanamycin，50mg/LRifampicin)，28℃、225rpm振荡培养16～24h。
3)从中取1ml菌液加入到50mL AB(含50mg/L Kanamycin，50mg/L Rifampicin)液体培养基中，28℃、225rpm振荡培养，OD600＝1.0。
4)室温，4000rpm离心20min，倒掉液体，收集菌体。
5)将菌体重悬于10ml加有200umol/L乙酰丁香酮的AAM液体培养基，10℃，4000rpm离心10min，倒掉液体，收集菌体。
6)用含有200umol/L乙酰丁香酮AAM液体培养基重悬菌体，定容到50ml。
7)挑选颜色新鲜、淡黄色、致密、生长旺盛的颗粒状胚性愈伤组织和农杆菌菌液按一定的比例混合，侵染30min。
8)愈伤组织适当干燥后，放入加有200umol/L乙酰丁香酮共培养培养基上，26℃，暗培养3d。
4，5抗性愈伤组织的筛选和幼苗分化
1)共培养后的愈伤组织用无菌水漂洗10次以上。
2)再用含250mg/L头孢霉素和200mg/L氨苄青霉素的无菌水在25℃、150rpm条件下振荡1～2h。
3)洗净、适当干燥，放入40mg/L潮霉素筛选压的筛选培养基上，26℃暗培养，15～20d后，进行第二轮筛选。
4)抗性愈伤先进行预分化，26℃，暗培养；待抗性愈伤组织变成嫩白而坚硬时，再放入到分化培养基中，26℃，光照培养。
4，6壮苗、驯化及移栽
1)将分化得到的幼苗移入生根培养基中培养。
2)再生苗长至15cm高且根较为粗壮时将瓶口打开，在培养瓶中加入一些无菌水并保持湿度进行驯化。
3)长出新根时，将苗取出，根部的培养基小心用流水洗净，接于从水稻田中取来的土壤中进行移栽。
4)为使移栽后的的苗子保持85％的湿度，采用塑料膜覆盖，2d后适当进行通风，4d后揭去膜，进行常规管理。
实施例5、OsSINAT5基因超量表达、抑制表达转基因植物的分子检测
本发明OsSINAT5基因超量表达、抑制表达转基因植物总RNA提取采用TRIzol法(Invitrogen)。OsSINAT5基因超量表达转基因植物分子检测采用Northern杂交，有关实验操作方法按《分子克隆》进行。将10μg总RNA在甲醛变性胶中电泳后，转移至Hybond-N+(Amersham)尼龙膜上。α-32P-dCTP标记的OsSINAT5探针按随机引物标记试剂盒(Promega)说明书进行。杂交程序参考Sambrook(1989)等方法进行。28SrRNA作为RNA加样对照，Northern杂交至少重复两次。结果如图4-A所示，与对照WT相比，本发明克隆的基因OsSINAT5在大多数转基因株系中表达量增加，可以用于进一步表型鉴定。
OsSINAT5基因的抑制表达转基因分子检测采用RT-PCR法。RNA样品首先用DNaseI消化，除去基因组DNA的污染。根据Promega公司MMLV(Cat.M170A)使用方法进行cDNA第一链合成：冰上依次加入下列反应组分：总RNA2μg，0.05μg Oligo-dT，加ddH2O至12μL混匀，75℃5min，冰上冷却；再依 次加入如下组分：5×反应缓冲液5μL；RibonucLeose inhibitor 25U；dNTPs(10mM)5μL，MMLV Reverse transcriptase(200U/μL)1μL，加水至25μL，42℃反应1h，70℃10min终止反应，置于冰上；将合成的单链cDNA稀释10倍，作为RT-PCR反应的模板。
OsActin1基因被作为内参，反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，60℃30sec；72℃35sec，26个循环；72℃延伸10min。其特异性引物如下：
F1(5’-CGTCTGCGATAATGGAACTGG-3’)
F2(5’-CTGCTGGAATGTGCTGAGAGAT-3’)
选择OsSINAT5特异性片段进行检测，PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，59℃30sec；72℃1min，28个循环；72℃延伸10min。特异性引物如下：
F1(5’-GGAAGCTTATGGCCTCAGTTACTTATATTG-3’)；
F2(5’-GGGGATCCTCACTGTTCCTTCCAAATTCTC-3’)
RT-PCR结如4-B所示，与对照WT相比，本发明克隆的基因OsSINAT5在大多数转基因株系中表达量下降，可以用于进一步表型鉴定。
实施例6、OsSINAT5基因超量表达、抑制表达转基因植物对干旱处理的不同反应
在实施例5的结果前提下，本发明首先对OsSINAT5基因超量表达、抑制表达转基因植物T3代植物进行了纯合体筛选。具体步骤如下：每个植株选取30粒种子去壳，70％乙醇表面消毒1min，30％漂白液消毒30min，灭菌水洗5遍，用无菌镊子播种在含潮霉素的1/2MS(Murashige&Skong)培养基平皿上进行筛选，野生型日本晴作为对照，培养条件为28℃，持续光照强度为2500lux，16h光照/8h黑暗。两周后统计发芽及成活率，本发明默认100％成活率的植株为纯合体，每个纯合体植物单独取样并进行相应的分子检测。取分子检测和潮霉素筛选结果一致的株系用于接下来的表型鉴定。
本发明选取四条独立的超量表达和两条独立的抑制表达转基因纯合水稻用于表型筛选。具体步骤如下：每条纯和转基因株系选15粒种子去壳，70％乙醇表面消毒1min，30％漂白液消毒30min，灭菌水洗5遍，用无菌镊子播种在均盛有100ml 1/2MS(Murashige&Skong)培养基的圆筒形培养瓶中，野生型日本晴作 为对照，培养条件为28℃，持续光照强度为2500lux，16h光照/8h黑暗。等培养至两周大时，OsSINAT5超表达植物(OsSINAT5-OV)，野生型(WT)，OsSINAT5RNAi抑制植物(OsSINAT5-RNAi)植物状态无明显区别。打开培养瓶盖子，不浇水进行干旱处理。
干旱五天后，如图5-A所示，OsSINAT5超表达植物(OsSINAT5-OV)大多数萎奄，叶片下垂，出现严重的旱胁迫表现，对照野生型(WT)也有部分叶片开始下垂，OsSINAT5RNAi抑制植物(OsSINAT5-RNAi)则基本保持着正常的生长状态。
干旱六天后复水前，如图5-B所示，OsSINAT5超表达植物(OsSINAT5-OV)叶片出现不可恢复的干枯，绝大多数对照野生型(WT)和OsSINAT5RNAi抑制植物(OsSINAT5-RNAi)均已萎奄，部分开始出现不可恢复的干枯。
复水一天后，如图5-C所示，OsSINAT5超表达植物(OsSINAT5-OV)叶片完全不能恢复，对照野生型(WT)有部分叶片恢复正常生长状态，相比，绝大多数OsSINAT5RNAi抑制植物(OsSINAT5-RNAi)均可恢复至正常生长状态。植物在干旱后的复水能力也是抗旱的一个重要指标，在复水后，如图5-D所示，OsSINAT5RNAi抑制植物(OsSINAT5-RNAi)存活率最高(54％)，对照野生型存活率为27％，而OsSINAT5超表达植物(OsSINAT5-OV)却均已不可恢复的萎奄，不能恢复生长。干旱及复水实验表明，OsSINAT5超量表达降低了植物的耐旱性，而OsSINAT5抑制表达后则增强了植物的耐旱性。这些结果证实了OsSINAT5在植物对干旱的响应中起了重要的作用。
序列表
<110>湖南农业大学
<120>水稻抗旱性OsSINAT5基因及其编码蛋白与应用
<130>PHW09012
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>4963
<212>DNA
<213>Oryza sativa
<400>1
acattatttt cgggagcaag acatgaggag ctcaaatcag ttcctttccg aacacagcac 60
acccctcctt gacatgggcc ggcccaaggc ccagcacctg tatctggtta cggtatacta 120
agtctgcagt taagtaatta attaattatg gtatgtgata cttttctcaa tacgtaataa 180
tgttcacttt gatgttattt tcatccatac tatttttaga taaagttacc aaaaatttta 240
actaccttaa gtttattgcc aaattttagc aagtaattat gaaatcttgc caaattttgg 300
caaccttgcc aaaattttga caacttagct aaaatttggt aatgccaaaa cttgataagg 360
ttaaaaatgg tagcaaagtg aacaagcccg aaatggtgtg ttaaccactt cggttaatta 420
atttcagtac tcagttcatt aaattaatta aagaaaggcc gaatccctag aggtggggaa 480
cgggtgggcc cgcgcaaacg ccacgaggaa gaaagagaga gaaaaggtta gcaactttca 540
cgggacaaaa accagcagac tagtcagata tacatatact cctcctcaac aaaacaaaac 600
aaaaaacgcg agaagagaga gagagaagct tttaattcga attctctctc tcatcacggc 660
ttcttctgct tctccttctc ctcccccctc atccctcctc cgccggtagc cgccggccgg 720
gagcgagcag cgagcgagac cggagcccgc cggagccggt ctcgctcccc cctcctccct 780
tgttcgcgcc acccccgagg tacatcccgc cgatctctct ctttctctct ctcgttggtc 840
tgctctgtga tttttttttt ttttgccaag gctgttcttt atttggcaca gagattgttt 900
tttttttcct tctttgcggg tgtccggttc gagtccacgg ggtttgactc tgccggaaat 960
ggttcgaatg cggcggccgg agggcggagg aggggttttg gggggcgttc ttggtgggtt 1020
ggtttgcgcc gagtctttgt taatttgtta gggttcttga tctgatgcgg cttctcgttg 1080
ccgggatgcg cttgcctcat ggctgaattc aaacaggccg gtctctctct ccctccctct 1140
ctcccgtcag ccgtgtgctt tgaccgagta agtttttgaa cttcgattgg ttgagctggg 1200
ggttcttgac tttttcttac tccacgaatg ttcctttttg cacaatgggg ctactaatga 1260
atggaaagct agagatggtg tgcctaatgg tgatgtgccg tcattgtgtt agctcggatt 1320
tgtactgcga atttgcgagc tcacatgctc agctgatgat gtgttgatcc agggagtata 1380
tataattggt tggtagagta cttgctagat tgtgctcacg ggtctcattt caaagttcag 1440
tatgaaatct tggttgtaaa gtagtactag tgttttgtta atcgttaggg agtacttctc 1500
ctgcattttt cttaattttt tccctttaaa aactgtaggt ggatttgtta ttagtaaagc 1560
tgatttgtgc caaatagaaa ttctgtttta tccgcagtaa ggtactgtaa acagtacttg 1620
caggcactag ggtttattgg caaggttttc tatgttacat tttaataaat gccacctttt 1680
tcttcgtcaa aagaagccac ggttataaag aaaaagtgaa gcattaattg atgtaaatgc 1740
acgaactaca aatttccaca aatataaacc ttttaataaa atccacaaat gaaagaaaaa 1800
tgcagttcac acaccaatct ctttctcaaa atttacactt ttcttataac aggtatgcta 1860
aattttctta atacaaagca tatacaaaac atcacaagca ctatagacat tcatgacata 1920
tctgttgcat aggacaatat gcagtatgaa gacctggctg gtcaaaactt ccgatgcaca 1980
tgtgaggccc tatccatgtg ctttcttgat ttctgctcct ttatggccct atctccttca 2040
aagcccttaa acacttcaac agtgtccaat catactatga gactgtatgg atatgggcat 2100
atggctatac ttttgatgag gcaatgattt tttttgttaa taatagtgtt aataggaagt 2160
gttgaattgg ttttttaaaa ggaagtattt aagcattgaa tttgtcattt attttgactc 2220
actaataaca cagatagttc tctttcctag caggacccct tacaatatct agtgtattta 2280
tggcctcagt tacttatatt gatgactccg gttctgaggt aattgatcct ccaaagactg 2340
aggtgctgga tgttaccgaa cttgctggtg atcctgttcc gcattcacca aaaccaaatg 2400
tggtagtttc tagcagtgtg cgtgaactgc ttgaatgtcc agtctgcctg agcgcaatgt 2460
atcctcccat tcatcaggtg cacatatacc acttattgaa tcttttttgc acttaaaaag 2520
gatattttct tgtatggaag tcacttggga aacaaaatgc gtgtttcatt taattgcatt 2580
gcttttacta tcttgaatcc tgctatcata tttgtagtct ggcctgatct atttgaactt 2640
atctagatga tttcctggtt taaaacggtc gttctgagct gctttttcac atatgttctg 2700
ttccactacc aaattgttac ccatgtattt aagcaccaaa aaagaagtta gctaagatag 2760
tatgtacaat atgcacattg ttgtactatg ttgtaagttg taaccccaac tctttttctg 2820
ctaatgcagt gctctaatgg tcatacattg tgctctggat gcaaaccaag ggttcacaat 2880
cgctgtccaa cttgtaggca tgaactgggt aatattagat gtcttgctct cgagaaggtg 2940
gctgcgtcgc ttgaacttcc atgcaagtac cagaacttcg ggtgtgtagg catttatcct 3000
tactactgca agctgaagca tgagtcacag tgccaatata ggccttatag ctgtccatat 3060
gctggatctg aatgcacagt tgctggtgac attccatact tggtgaatca cttgaaagat 3120
gaccacaagg ttgacatgca taatggctgc accttcaacc atcgctatgt caagtcgaat 3180
cctcatgaag ttgagaatgc cacctggatg cttacggtat cccctcgtta actccaccat 3240
gttagttatt gtgaagtata tcactgatgt ttacttatgc aaagattggt tcacttgtct 3300
gctaagatag tccatatttc tgtactgagt tttatgagcc tttctgtaaa aataaacatt 3360
ggttcacttg tacagtatga ttgcactctg tacttttcat gtcaactgag gatgctgatc 3420
atgcagcata gttattggtc taaaataatc tctcacctat gaagaaacta tgcatcagaa 3480
tatccatctg cttccatttc caaaaaaaaa aaaaaaaact ttgtctgctt tacagcacaa 3540
taatagcatt tggacagggc tcttgatctg caaccttttc ttgctgcttt ctaagtgcaa 3600
tataaaatta agaatttcct tctaatctgt tcttttccat tgaacaaaat ggactaagta 3660
actataatgc ttccatctag gttttcagct gctttggcca gtacttctgc ctacatttcg 3720
aagcatttca gctggggatg gcacctgtgt acatcgcctt cctgaggttc atgggtgatg 3780
acttggaagc aaagaactac agctacagcc tggaggtagg aggcactggc cgcaaaatga 3840
tctggcaagg ggttccccgg agcatcagag acagccatcg gaaggtccgg gatagctatg 3900
atgggcttat catccaacgg aacatggcct tgttcttctc tggtggagaa aggaaggagc 3960
tcaaattgcg ggtcactggg agaatttgga aggaacagtg aaaataaaat gtgaaatgat 4020
ctgttcatcg ttcttaaccc ttgcatgaac ctatgtatca tcacagtgcg agaattatag 4080
ccattcatag gcagtgactc taaaatgaag acttgtaatg ttattagctt gttttagcta 4140
ccatcttctg ttagattggt gcctgtggat gactagatga cagtcatgta gaccagagtg 4200
gcactattgt agaattcctg gcaaacttct ctttgccttg aactgcttgt tgagttgcca 4260
ttctgtggta tagggaaatc taatggcaat tcatgagatg aatgtgttga actctttttc 4320
atgtttccag catatttcta gcttctttgt tcattctttc agcatatctc tagcttgttt 4380
gttcattctt tcagcatatt tctagctatg ttaaggcatg atctgaaagt tcttaagaat 4440
cggatatgct gtaacaaatc atggtgaaat gtcatgtagc atgtaccatt tccttttatc 4500
ttaaatgctg cttttgaatt ggagggtgaa taccagaatg attttgtaag ctttttccga 4560
ataaagtttc aacttggtgt gcaagattaa atcggggttg agcacccaga gtaaatatta 4620
gtagaagata aaatgaagtg ctgatttttt ttcttaaaga aaaaacaaga gttgaagcgc 4680
tagaatcaat aatttgatct gcatcatgtc cggagtagta ctgtttgtac gctataggag 4740
caataatgtt gtgcccgtac gttactgcct tcccttcaat tgtctgcacc tctgcacccg 4800
tcgtactact gtgtcgtgga cgtggcacct tatctgaagg atttcacaaa atttgctcat 4860
ggaagtaagg gttaagggag tagtttgctt tgatgcccag atcaactcta ccaaaatttg 4920
gtattgttaa ctcaataagt gtttttgatt tttttttctt tgc 4963
<210>2
<211>301
<212>PRT
<213>Oryza sativa
<400>2
Met Ala Ser Val Thr Tyr Ile Asp Asp Ser Gly Ser Glu Val Ile Asp
1 5 10 15
Pro Pro Lys Thr Glu Val Leu Asp Val Thr Glu Leu Ala Gly Asp Pro
20 25 30
Val Pro His Ser Pro Lys Pro Asn Val Val Val Ser Ser Ser Val Arg
35 40 45
Glu Leu Leu Glu Cys Pro Val Cys Leu Ser Ala Met Tyr Pro Pro Ile
50 55 60
His Gln Cys Ser Asn Gly His Thr Leu Cys Ser Gly Cys Lys Pro Arg
65 70 75 80
Val His Asn Arg Cys Pro Thr Cys Arg His Glu Leu Gly Asn Ile Arg
85 90 95
Cys Leu Ala Leu Glu Lys Val Ala Ala Ser Leu Glu Leu Pro Cys Lys
100 105 110
Tyr Gln Asn Phe Gly Cys Val Gly Ile Tyr Pro Tyr Tyr Cys Lys Leu
115 120 125
Lys His Glu Ser Gln Cys Gln Tyr Arg Pro Tyr Ser Cys Pro Tyr Ala
130 135 140
Gly Ser Glu Cys Thr Val Ala Gly Asp Ile Pro Tyr Leu Val Asn His
145 150 155 160
Leu Lys Asp Asp His Lys Val Asp Met His Asn Gly Cys Thr Phe Asn
165 170 175
His Arg Tyr Val Lys Ser Asn Pro His Glu Val Glu Asn Ala Thr Trp
180 185 190
Met Leu Thr Val Phe Ser Cys Phe Gly Gln Tyr Phe Cys Leu His Phe
195 200 205
Glu Ala Phe Gln Leu Gly Met Ala Pro Val Tyr Ile Ala Phe Leu Arg
210 215 220
Phe Met Gly Asp Asp Leu Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Tyr Ser Leu Glu
225 230 235 240
Val Gly Gly Thr Gly Arg Lys Met Ile Trp Gln Gly Val Pro Arg Ser
245 250 255
Ile Arg Asp Ser His Arg Lys Val Arg Asp Ser Tyr Asp Gly Leu Ile
260 265 270
Ile Gln Arg Asn Met Ala Leu Phe Phe Ser Gly Gly Glu Arg Lys Glu
275 280 285
Leu Lys Leu Arg Val Thr Gly Arg Ile Trp Lys Glu Gln
290 295 300
<210>3
<211>906
<212>DNA
<213>Oryza sativa
<400>3
atggcctcag ttacttatat tgatgactcc ggttctgagg taattgatcc tccaaagact 60
gaggtgctgg atgttaccga acttgctggt gatcctgttc cgcattcacc aaaaccaaat 120
gtggtagttt ctagcagtgt gcgtgaactg cttgaatgtc cagtctgcct gagcgcaatg 180
tatcctccca ttcatcagtg ctctaatggt catacattgt gctctggatg caaaccaagg 240
gttcacaatc gctgtccaac ttgtaggcat gaactgggta atattagatg tcttgctctc 300
gagaaggtgg ctgcgtcgct tgaacttcca tgcaagtacc agaacttcgg gtgtgtaggc 360
atttatcctt actactgcaa gctgaagcat gagtcacagt gccaatatag gccttatagc 420
tgtccatatg ctggatctga atgcacagtt gctggtgaca ttccatactt ggtgaatcac 480
ttgaaagatg accacaaggt tgacatgcat aatggctgca ccttcaacca tcgctatgtc 540
aagtcgaatc ctcatgaagt tgagaatgcc acctggatgc ttacggtttt cagctgcttt 600
ggccagtact tctgcctaca tttcgaagca tttcagctgg ggatggcacc tgtgtacatc 660
gccttcctga ggttcatggg tgatgacttg gaagcaaaga actacagcta cagcctggag 720
gtaggaggca ctggccgcaa aatgatctgg caaggggttc cccggagcat cagagacagc 780
catcggaagg tccgggatag ctatgatggg cttatcatcc aacggaacat ggccttgttc 840
ttctctggtg gagaaaggaa ggagctcaaa ttgcgggtca ctgggagaat ttggaaggaa 900
cagtga 906
<210>4
<211>276
<212>DNA
<213>Oryza sativa
<400>4
atggcctcag ttacttatat tgatgactcc ggttctgagg taattgatcc tccaaagact 60
gaggtgctgg atgttaccga acttgctggt gatcctgttc cgcattcacc aaaaccaaat 120
gtggtagttt ctagcagtgt gcgtgaactg cttgaatgtc cagtctgcct gagcgcaatg 180
tatcctccca ttcatcagtg ctctaatggt catacattgt gctctggatg caaaccaagg 240
gttcacaatc gctgtccaac ttgtaggcat gaactg 276