《利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法.pdf（10页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610793327.8 (22)申请日 2016.08.31 (71)申请人 江苏省农业科学院 地址 210014 江苏省南京市玄武区孝陵卫 钟灵街50号 (72)发明人 邹烨王道营卞欢李鹏鹏 王立蔡盼盼孙冲诸永志 徐为民 (74)专利代理机构 北京远大卓悦知识产权代理 事务所(普通合伙) 11369 代理人 史霞 (51)Int.Cl. C07K 14/78(2006.01) C07K 1/14(2006.01) (54)发明名称 利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸 提。
2、方法 (57)摘要 本发明涉及胶原蛋白的提取方法。 更具体地 说， 本发明涉及一种利用响应面法优化胶原蛋白 的超声辅助酸提方法， 包括： 取新鲜或冷冻的中 华鳖裙边切碎后进行除杂处理； 取除杂后的样品 以料液比为1:1030加入0.30.6mol/L的乙酸 溶液， 并置于超声反应器中进行间歇式超声提 取， 每超声第一预定时间后， 间歇第二预定时间， 如此反复， 离心后取上清液， 再向上清液中添加 NaCl， 静置盐析后过滤， 蛋白沉淀用同浓度的乙 酸复溶后， 依次对乙酸和蒸馏水透析， 最后冷冻 干燥得到样品； 第一预定时间小于等于第二预定 时间。 本发明提供了一种提取效率高， 胶原蛋白 溶解度。
3、好， 原料利用价值和胶原蛋白利用率均较 高的胶原蛋白超声辅助酸提方法。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 106220727 A 2016.12.14 CN 106220727 A 1.一种利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 步骤一、 取新鲜或冷冻的中华鳖裙边切碎后以料液比为1:1030加入质量分数为1.0 3.0的NaCl溶液， 于20下搅拌612h， 然后在500010000rpm下高速匀浆13min后， 收集一次沉淀， 以料液比为1:1030加入0.30.6mol/L的Na2CO3溶液， 于20下搅拌6 12h， 然后在500010000。
4、rpm下高速匀浆13min后， 收集二次沉淀， 以料液比为1:2030加 入0.20.4mol/L的EDTA水溶液浸泡除杂， 于20下搅拌612h， 然后在500010000rpm下 高速匀浆13min， 收集三次沉淀， 用蒸馏水反复洗涤， 充分沥干后备用， 再加入与质量分数 为1.03.0的NaCl溶液同量的质量分数为520的异丙醇溶液， 于20浸泡1230h， 然后在500010000rpm下高速匀浆13min， 收集四次沉淀， 然后用蒸馏水反复洗涤， 充分 沥干后备用； 步骤二、 取步骤一中充分沥干后的四次沉淀， 以料液比为1:1030加入0.30.6mol/L 的乙酸溶液， 并置于超声。
5、反应器中进行间歇式超声提取， 每超声第一预定时间后， 间歇第二 预定时间， 如此反复， 超声功率为50300W， 超声时间为5070min， 然后在10003000rmp 下离心36min后取上清液， 再向上清液中添加NaCl， 直至盐浓度为0.9mol/L， 静置盐析18 30h后过滤， 蛋白沉淀用0.30.6mol/L的乙酸复溶后， 依次对0.1mol/L的乙酸和蒸馏水 透析， 最后冷冻干燥得到样品； 其中， 所述第一预定时间小于等于所述第二预定时间。 2.如权利要求1所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法， 其特征在于， 所述第一预定时间为2s， 所述第二预定时间为26s。 3。
6、.如权利要求1所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法， 其特征在于， 所述步骤一中， 新鲜或冷冻的中华鳖裙边与质量分数为2.0的NaCl溶液的料液比为1:20， 搅拌时间为9h。 4.如权利要求1所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法， 其特征在于， 所述步骤一中， 所述一次沉淀与0.5mol/L的Na2CO3溶液的料液比为1:20， 搅拌时间为9h。 5.如权利要求1所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法， 其特征在于， 所述步骤一中， 所述二次沉淀与0.3mol/L的EDTA水溶液的料液比为1:25， 搅拌时间为10h。 6.如权利要求3所述的利用响应面法优化。
7、胶原蛋白的超声辅助酸提方法， 其特征在于， 所述步骤一中， 所述三次沉淀与质量分数为10的异丙醇溶液的料液比为1:20， 于20浸 泡24h。 7.如权利要求1所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法， 其特征在于， 所述步骤一中的搅拌均为连续磁力搅拌。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106220727 A 2 利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法 技术领域 0001 本发明涉及一种胶原蛋白的提取方法。 更具体地说， 本发明涉及一种利用响应面 法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法。 背景技术 0002 胶原蛋白是动物组织中的一类结构蛋白， 具有粘度大、 溶解度低和变性温度低等 特。
8、点。 以上特点在一定程度上限制了它的应用。 它的提取方法主要有酸提取法、 碱提取法、 酶提取法和热水提取法等。 用酸碱提取时间长， 试剂用量大， 产生大量的有害废弃物， 提取 率低。 酶提取法能够保持胶原蛋白结构的完整性， 但是提取成本高， 并且提取时间较长， 提 取率较低。 热水提取法虽然成本很低， 但是提取率也低。 发明内容 0003 本发明的一个目的是解决至少上述问题， 并提供至少后面将说明的优点。 0004 本发明还有一个目的是提供一种提取效率高， 胶原蛋白溶解度好， 原料利用价值 和胶原蛋白利用率均较高的胶原蛋白超声辅助酸提方法。 0005 为了实现本发明的这些目的和其它优点， 提供。
9、了一种利用响应面法优化胶原蛋白 的超声辅助酸提方法， 包括以下步骤： 0006 步骤一、 取新鲜或冷冻的中华鳖裙边切碎后以料液比为1:1030加入质量分数为 1.03.0的NaCl溶液， 于20下搅拌612h， 然后在500010000rpm下高速匀浆13min 后， 收集一次沉淀， 以料液比为1:1030加入0.30.6mol/L的Na2CO3溶液， 于20下搅拌6 12h， 然后在500010000rpm下高速匀浆13min后， 收集二次沉淀， 以料液比为1:2030 加入0.20.4mol/L的EDTA水溶液浸泡除杂， 于20下搅拌612h， 然后在500010000rpm 下高速匀浆1。
10、3min， 收集三次沉淀， 用蒸馏水反复洗涤， 充分沥干后备用， 再加入与质量分 数为1.03.0的NaCl溶液同量的质量分数为520的异丙醇溶液， 于20浸泡12 30h， 然后在500010000rpm下高速匀浆13min， 收集四次沉淀， 然后用蒸馏水反复洗涤， 充分沥干后备用； 0007 步骤二、 取步骤一中充分沥干后的四次沉淀， 以料液比为1:1030加入0.3 0.6mol/L的乙酸溶液， 并置于超声反应器中进行间歇式超声提取， 每超声第一预定时间后， 间歇第二预定时间， 如此反复， 超声功率为50300W， 超声时间为5070min， 然后在1000 3000rmp下离心36mi。
11、n后取上清液， 再向上清液中添加NaCl， 直至盐浓度为0.9mol/L， 静置 盐析1830h后过滤， 蛋白沉淀用0.30.6mol/L的乙酸复溶后， 依次对0.1mol/L的乙酸和 蒸馏水透析， 最后冷冻干燥得到样品； 0008 其中， 所述第一预定时间小于等于所述第二预定时间。 0009 优选的是， 所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中， 所述第一 预定时间为2s， 所述第二预定时间为26s。 0010 优选的是， 所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中， 所述步骤 说明书 1/6 页 3 CN 106220727 A 3 一中， 新鲜或冷冻的中华鳖裙边与质量分。
12、数为2.0的NaCl溶液的料液比为1:20， 搅拌时间 为9h。 0011 优选的是， 所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中， 所述步骤 一中， 所述一次沉淀与0.5mol/L的Na2CO3溶液的料液比为1:20， 搅拌时间为9h。 0012 优选的是， 所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中， 所述步骤 一中， 所述二次沉淀与0.3mol/L的EDTA水溶液的料液为1:25， 搅拌时间为10h。 0013 优选的是， 所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中， 所述步骤 一中， 所述三次沉淀与质量分数为10的异丙醇溶液的料液比为1:20， 于20浸泡24h。
13、。 0014 优选的是， 所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中， 所述步骤 一中的搅拌均为连续磁力搅拌。 0015 本发明至少包括以下有益效果： 超声辅助酸提方法提取胶原蛋白具有操作简单、 处理时间短、 蛋白得率高及能耗较低等优点。 该方法得到的中华鳖裙边胶原蛋白得率为 19.8(w/w)， 蛋白纯度为59.6(w/w)， 和传统酸提法比较， 蛋白提取率增加了48.5(w/ w)， 纯度提高了19.3(w/w)。 与传统酸提法相比， 超声辅助酸提极大地改善了胶原蛋白的 溶解性， 采用超声辅助提取后， 胶原蛋白的溶解性提高了16.522.7。 0016 本发明的其它优点、 目标和特。
14、征将部分通过下面的说明体现， 部分还将通过对本 发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。 附图说明 0017 图1为本发明的方法和对比例的方法所得胶原蛋白的氮溶指数的对比图； 0018 图2为本发明的超声时间固定时， 超声功率和液料比对超声辅助酸性胶原蛋白提 取的影响的响应面图； 0019 图3为本发明的液料比固定时， 超声功率和超声时间对超声辅助酸性胶原蛋白提 取的影响的响应面图； 0020 图4为本发明的超声功率固定时， 料液比和超声时间对超声辅助酸性胶原蛋白提 取的影响的响应面图。 具体实施方式 0021 下面结合附图对本发明做进一步的详细说明， 以令本领域技术人员参照说明书文 字能。
15、够据以实施。 0022 应当理解， 本文所使用的诸如 “具有” 、“包含” 以及 “包括” 术语并不配出一个或多 个其它元件或其组合的存在或添加。 0023 本发明提供一种利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法， 包括以下步 骤： 0024 步骤一、 取新鲜或冷冻的中华鳖裙边切碎后以料液比为1:1030加入质量分数为 1.03.0的NaCl溶液， 于20下搅拌612h， 以去除水溶性和盐溶性蛋白。 然后在5000 10000rpm下高速匀浆13min后， 收集一次沉淀， 以料液比为1:1030加入0.30.6mol/L 的Na2CO3溶液， 于20下搅拌612h， 以除去非胶原蛋白成分和色。
16、素。 然后在5000 10000rpm下高速匀浆13min后， 收集二次沉淀， 以料液比为1:2030加入0.20.4mol/L 说明书 2/6 页 4 CN 106220727 A 4 的EDTA水溶液浸泡除杂， 以除去矿物质。 于20下搅拌612h， 然后在500010000rpm下高 速匀浆13min， 收集三次沉淀， 用蒸馏水反复洗涤， 充分沥干后备用。 再加入与质量分数为 1.03.0的NaCl溶液同量的质量分数为520的异丙醇溶液， 于20浸泡1230h， 然 后在500010000rpm下高速匀浆13min， 收集四次沉淀， 以除去脂肪， 然后用蒸馏水反复 洗涤， 充分沥干后备用。
17、。 0025 步骤二、 取步骤一中充分沥干后的四次沉淀， 以料液比为1:1030加入0.3 0.6mol/L的乙酸溶液， 并置于超声反应器中进行间歇式超声提取， 每超声第一预定时间后， 间歇第二预定时间， 其中， 所述第一预定时间小于等于所述第二预定时间， 如此反复， 超声 功率为50300W， 超声时间为5070min。 分阶段进行超声提取， 使得提取更加充分、 均匀， 同时缩短了超声提取的时间。 然后在10003000rmp下离心36min后取上清液， 再向上清 液中添加NaCl， 直至盐浓度为0.9mol/L， 静置盐析1830h后过滤， 蛋白沉淀用0.3 0.6mol/L的乙酸复溶后，。
18、 依次对0.1mol/L的乙酸和蒸馏水透析， 最后冷冻干燥得到样品。 通 过透析进一步纯化以上步骤提取得到的酸性胶原蛋白。 0026 所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中， 所述第一预定时间为 2s， 所述第二预定时间为26s， 以使超声波的能量充分释放到混合物中， 且不引起过高的 温度。 且超声时间短， 间歇时间长， 以使得超声混合更加均匀， 且混合物保持在一定的范围 内。 0027 所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中， 所述步骤一中， 新鲜 或冷冻的中华鳖裙边与质量分数为2.0的NaCl溶液的料液比为1:20， 搅拌时间为9h。 0028 所述的利用响应面法优。
19、化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中， 所述步骤一中， 所述 一次沉淀与0.5mol/L的Na2CO3溶液的料液比为1:20， 搅拌时间为9h。 0029 所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中， 所述步骤一中， 所述 二次沉淀与0.3mol/L的EDTA水溶液的料液比为1:25， 搅拌时间为10h。 0030 所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中， 所述步骤一中， 所述 三次沉淀与质量分数为10的异丙醇溶液的料液比为1:20， 于20浸泡24h。 0031 所述的利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法中， 所述步骤一中的搅拌 均为连续磁力搅拌。 0032 对比例 00。
20、33 一种胶原蛋白的酸提方法， 包括以下步骤： 0034 步骤一、 取新鲜或冷冻的中华鳖裙边切碎后以料液比为1:20加入质量分数为 2.0的NaCl溶液， 于20下连续磁力搅拌9h。 然后在8000rpm下高速匀浆2min后， 收集一次 沉淀， 以料液比为1:20加入0.5mol/L的Na2CO3溶液， 于20下连续磁力搅拌9h。 然后在 8000rpm下高速匀浆2min后， 收集二次沉淀， 以料液比为1:25加入0.3mol/L的EDTA水溶液浸 泡除杂。 于20下连续磁力搅拌10h， 然后在8000rpm下高速匀浆2min， 收集三次沉淀， 用蒸 馏水反复洗涤， 充分沥干后备用。 再以料液。
21、比为1:20加入质量分数为10的异丙醇溶液， 于 20浸泡24h， 然后在8500rpm下高速匀浆2min， 收集四次沉淀， 然后用蒸馏水反复洗涤， 充 分沥干后备用。 0035 步骤二、 取步骤一中充分沥干后的四次沉淀， 以料液比为1:20加入0.4mol/L的乙 酸溶液， 搅拌均匀。 然后在2000rmp下离心5min后取上清液， 再向上清液中添加NaCl， 直至盐 说明书 3/6 页 5 CN 106220727 A 5 浓度为0.9mol/L， 静置盐析24h后过滤， 蛋白沉淀用0.4mol/L的乙酸复溶后， 依次对0.1mol/ L的乙酸和蒸馏水透析， 最后冷冻干燥得到样品。 003。
22、6 实施例1 0037 一种利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法， 包括以下步骤： 0038 步骤一、 取新鲜或冷冻的中华鳖裙边切碎后以料液比为1:20加入质量分数为 2.0的NaCl溶液， 于20下搅拌9h。 然后在8000rpm下高速匀浆2min后， 收集一次沉淀， 以 料液比为1:20加入0.5mol/L的Na2CO3溶液， 于20下搅拌9h。 然后在8000rpm下高速匀浆 2min后， 收集二次沉淀， 以料液比为1:25加入0.3mol/L的EDTA水溶液浸泡除杂。 于20下搅 拌10h， 然后在8000rpm下高速匀浆2min， 收集三次沉淀， 用蒸馏水反复洗涤， 充分沥干后。
23、备 用。 再以料液比为1:20加入质量分数为10的异丙醇溶液， 于20浸泡24h， 然后在8500rpm 下高速匀浆2min， 收集四次沉淀， 以除去脂肪， 然后用蒸馏水反复洗涤， 充分沥干后备用。 0039 步骤二、 取步骤一中充分沥干后的四次沉淀， 以料液比为1:20加入0.4mol/L的乙 酸溶液， 并置于超声反应器中进行间歇式超声提取， 每超声2s后， 间歇4s， 如此反复， 超声功 率为200W， 超声时间为60min。 然后在2000rmp下离心5min后取上清液， 再向上清液中添加 NaCl， 直至盐浓度为0.9mol/L， 静置盐析24h后过滤， 蛋白沉淀用0.4mol/L的乙。
24、酸复溶后， 依 次对0.1mol/L的乙酸和蒸馏水透析， 最后冷冻干燥得到样品。 0040 响应面是特定的响应值与对应的因素构成的三维空间， 映射在二维平面上形成等 高线， 可直观地反映各因素的交互作用以及对响应值的影响。 响应面曲面的坡度可反映该 因素对蛋白质提取率影响的强弱程度。 响应曲面相对平缓， 说明其可容忍处理条件的影响。 等高线图的形状表明变量间的交互作用是否显著， 椭圆等高线表明变量间的交互作用显 著， 圆形等高线表明交互作用不显著。 响应面曲线较陡， 说明该提取参数对响应值的作用越 显著， 反之， 某提取参数对响应值的作用较小， 表现为曲线平缓。 0041 当超声时间固定在水平。
25、0时， 超声功率和液料比对超声辅助酸性胶原蛋白提取的 影响见响应面图1， 超声功率和液料比对超声辅助酸性胶原蛋白提取得率呈二次方效应， 当 液料比较低时， 提高超声功率， 超声辅助酸性胶原蛋白的得率先升高后下降。 图2是固定液 料比为20:1mL/g时， 超声功率和超声时间对超声辅助酸性胶原蛋白提取的影响， 超声功率 和超声时间对超声辅助酸性胶原蛋白提取得率也呈二次方效应， 超声功率和超声时间对应 的曲面比较陡峭， 说明这两个因素相对结果影响显著， 这与方差分析的结果一致。 图3是固 定超声功率为200W时， 料液比和超声时间对超声辅助酸性胶原蛋白提取的影响， 提取率随 着液料比及超声时间的增。
26、加先升高， 但增加幅度不明显。 0042 羟脯氨酸标准曲线的绘制 0043 精确称取羟脯氨酸100mg， 用0.001mol/L的盐酸溶解， 配制成1mg/mL的羟脯氨酸储 备液， 取1mL储备液稀释至100mL配制成10 g/mL的标准溶液。 配制1mg以0.001mol/L的盐酸 作为空白液， 在羟脯氨酸标准溶液和空白液中分别加入氯胺T溶液2mL， 混匀， 室温下静置 20min， 加入高氯酸溶液2mL， 混匀， 室温下静置5min， 加入对甲基氨基苯甲酸2mL， 混匀， 60 加热20min进行显色反应， 最后置于冷水中冷却。 以空白液调零， 测定560nm处的吸光度， 绘 制标准曲线。。
27、 0044 样品中羟脯氨酸含量的测定 0045 取实施例1中的待测样品约10mg于安瓿瓶中， 加入1mL 6mol/L的盐酸， 用酒精喷灯 说明书 4/6 页 6 CN 106220727 A 6 封口后于130下水解3h， 取出用蒸馏水定容至10mL， 滤纸过滤， 取1mL按羟脯氨酸标准曲线 的测定方法， 以空白调零， 测定待测样品的吸光度。 由羟脯氨酸标准曲线换算出样品液中羟 脯氨酸的浓度。 0046 溶解性(氮溶指数NSI)的测定 0047 将实施例1中的胶原蛋白样品0.4000g均匀分散于20mL蒸馏水中， 室温下放置 30min， 用0.1mol/L的HCL溶液或0.1mol/L N。
28、aOH溶液调节溶液的pH值， 用均质机在13400rpm 下均质1min， 定容至25mL， 分散液以4000rpm的速度离心15min， 取上清液及胶原蛋白样品用 凯氏定氮法测含氮量， 公式如下： 0048 NSI()(上清液中的含氮量/样品中总氮量)100 0049 如图1所示， 位于上方的曲线表示利用本发明的超声辅助酸提胶原蛋白的氮溶指 数随pH的变化， 位于下方的曲线表示常规酸提胶原蛋白的氮溶指数随pH的变化， 可以看出， 超声辅助酸提方法提取胶原蛋白具有操作简单、 处理时间短、 蛋白得率高及能耗较低等优 点。 该方法得到的中华鳖裙边胶原蛋白得率为19.8(w/w)， 蛋白纯度为59.。
29、6(w/w)， 和传 统酸提法比较， 蛋白提取率增加了48.5(w/w)， 纯度提高了19.3(w/w)。 与传统酸提法相 比， 超声辅助酸提极大地改善了胶原蛋白的溶解性， 采用超声辅助提取后， 胶原蛋白的溶解 性提高了16.522.7。 0050 实施例2 0051 一种利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法， 包括以下步骤： 0052 步骤一、 取新鲜或冷冻的中华鳖裙边切碎后以料液比为1:10加入质量分数为 1.0的NaCl溶液， 于20下搅拌6h。 然后在5000rpm下高速匀浆1min后， 收集一次沉淀， 以 料液比为1:10加入0.3mol/L的Na2CO3溶液， 于20下搅拌6。
30、h。 然后在5000rpm下高速匀浆 1min后， 收集二次沉淀， 以料液比为1:20加入0.2mol/L的EDTA水溶液浸泡除杂。 于20下搅 拌6h， 然后在5000rpm下高速匀浆1min， 收集三次沉淀， 用蒸馏水反复洗涤， 充分沥干后备 用。 再以料液比为1:10加入质量分数为5的异丙醇溶液， 于20浸泡12h， 然后在5000rpm 下高速匀浆1min， 收集四次沉淀， 然后用蒸馏水反复洗涤， 充分沥干后备用。 0053 步骤二、 取步骤一中充分沥干后的四次沉淀， 以料液比为1:10加入0.3mol/L的乙 酸溶液， 并置于超声反应器中进行间歇式超声提取， 每超声2s后， 间歇2s。
31、， 如此反复， 超声功 率为50W， 超声时间为50min。 然后在1000rmp下离心3min后取上清液， 再向上清液中添加 NaCl， 直至盐浓度为0.9mol/L， 静置盐析18h后过滤， 蛋白沉淀用0.3mol/L的乙酸复溶后， 依 次对0.1mol/L的乙酸和蒸馏水透析， 最后冷冻干燥得到样品。 0054 实施例3 0055 一种利用响应面法优化胶原蛋白的超声辅助酸提方法， 包括以下步骤： 0056 步骤一、 取新鲜或冷冻的中华鳖裙边切碎后以料液比为1:30加入质量分数为 3.0的NaCl溶液， 于20下搅拌2h。 然后在10000rpm下高速匀浆3min后， 收集一次沉淀， 以 料。
32、液比为1:30加入0.6mol/L的Na2CO3溶液， 于20下搅拌12h。 然后在10000rpm下高速匀浆 3min后， 收集二次沉淀， 以料液比为1:30加入0.4mol/L的EDTA水溶液浸泡除杂。 于20下搅 拌12h， 然后在10000rpm下高速匀浆3min， 收集三次沉淀， 用蒸馏水反复洗涤， 充分沥干后备 用。 再以料液比为1:30加入质量分数为20的异丙醇溶液， 于20浸泡30h， 然后在 10000rpm下高速匀浆3min， 收集四次沉淀， 然后用蒸馏水反复洗涤， 充分沥干后备用。 说明书 5/6 页 7 CN 106220727 A 7 0057 步骤二、 取步骤一中充。
33、分沥干后的四次沉淀， 以料液比为1:30加入0.6mol/L的乙 酸溶液， 并置于超声反应器中进行间歇式超声提取， 每超声2s， 间歇6s， 如此反复， 超声功率 为300W， 超声时间为70min。 然后在3000rmp下离心6min后取上清液， 再向上清液中添加 NaCl， 直至盐浓度为0.9mol/L， 静置盐析30h后过滤， 蛋白沉淀用0.6mol/L的乙酸复溶后， 依 次对0.1mol/L的乙酸和蒸馏水透析， 最后冷冻干燥得到样品。 0058 尽管本发明的实施方案已公开如上， 但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用， 它完全可以被适用于各种适合本发明的领域， 对于熟悉本领域的人员而言， 可容易地 实现另外的修改， 因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下， 本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的图例。 说明书 6/6 页 8 CN 106220727 A 8 图1 图2 说明书附图 1/2 页 9 CN 106220727 A 9 图3 图4 说明书附图 2/2 页 10 CN 106220727 A 10 。