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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610135737.3 (22)申请日 2016.03.10 CCTCC M 2016086 2016.03.07 C12N 1/20(2006.01) C12P 17/18(2006.01) C12R 1/465(2006.01) (71)申请人 杭州中美华东制药有限公司 地址 310011 浙江省杭州市拱墅区祥符桥 866 号 (72)发明人 吴萍 杨永梅 颜仁江 方一民 张薇 (54) 发明名称 筑波链霉菌及其在制备他克莫司中的应用 (57) 摘要 本 发 明 公 开 了 一 种 筑 波 链 霉 菌 (streptomyces。
2、 tsukubaensis)HDW68 及其应用， 该菌种由中国典型培养物保藏中心保藏， 保藏号 为 CCTCC M 2016086， 保藏日期为 ： 2016 年 03 月 07 日。本发明还公开了一种由此菌株发酵制备他 克莫司中间体的方法。本发明提供的发酵工艺经 1吨、 4吨、 20吨发酵罐的生产实践， 证明其生产能 力稳定， 发酵单位高且发酵副产物 (FK520) 相对 较少， 大大地降低了后提取的难度， 适宜工业化大 生产且获得的他克莫司产品质量高。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书11页 。
3、附图2页 CN 105624068 A 2016.06.01 CN 105624068 A 1.一种筑波链霉菌(streptomycestsukubansis)HDW68， 由中国典型培养物保藏中心 保藏， 保藏号为CCTCCM2016086， 保藏日期为： 2016年03月07日。 2.如权利要求1所述的保藏号为CCTCCM2016086的菌株在发酵制备他克莫司中的应 用。 3.应用权利要求1所述的保藏号为CCTCCM2016086的菌株发酵制备他克莫司的方法， 其特征在于包括下列步骤： a.发酵菌株采用保藏编号为CCTCCM2016086的菌株； b.将CCTCCM2016086的菌株接入。
4、摇瓶种子培养基， 250rpm， 培养2230h， 得摇瓶种子 液； 将摇瓶种子液按种子罐培养基体积0.020.05的接种量接种于种子罐， 搅拌速度 150250rpm， 培养2230h； 将种子罐培养液按发酵培养基体积515的量接种于发酵罐培养基， 搅拌速度150 250rpm， 发酵培养67天， 收集发酵液； 其中培养温度均为2630。 4.如权利要求3所述的方法， 其特征在于所述步骤b中摇瓶、 种子罐培养过程中按重量 体积比计， 碳源为0.54.0， 优选0.53.0， 最优选为1.22.5； 氮源为0.24.0， 优选0.53.5， 最优选为0.52.0； 无机盐为0.22.0， 优选。
5、0.21.5， 最优选0.2 1.0； 其余为水。 5.如权利要求3所述的方法， 其特征在于所述步骤b中发酵培养过程中培养基按重量体 积比计， 碳源为3.012.0， 优选3.010.0， 最优选7.09.0； 氮源为1.08.0， 优 选1.06.0， 最优选2.94.5； 无机盐为0.22.0， 优选0.21.5， 最优选0.25 1.0； 氨基酸为0.22.0， 优选0.21.5， 最优选0.51.0； 其余为水。 6.如权利要求4所述的方法， 其特征在于 所述碳源选自可溶性淀粉， 大豆油， 葡萄糖、 玉米淀粉、 甘油、 麦芽糖、 蔗糖中的一种或 几种； 优选可溶性淀粉， 大豆油， 葡萄。
6、糖、 玉米淀粉、 甘油、 麦芽糖中的一种或几种； 最优选葡 萄糖、 玉米淀粉、 甘油中的一种或几种； 所述氮源选酵母浸出粉、 玉米粉、 热黄豆饼粉、 大豆蛋白粉、 豆粕粉、 生豆粉、 啤酒酵母 粉、 固体玉米浆、 硫酸铵中的一种或几种； 优选热黄豆饼粉、 大豆蛋白粉、 生豆粉、 啤酒酵母 粉、 固体玉米浆、 硫酸铵中的一种或几种； 更优选热黄豆饼粉、 啤酒酵母粉、 硫酸铵中的一种 或几种； 所述无机盐CaCO3、 K2HPO4、 NaCl、 KNO3， MgSO4、 KCl、 KH2PO4中的一种或几种； 优选CaCO3、 K2HPO4、 NaCl、 KNO3、 KH2PO4中的一种或几种； 。
7、更优选CaCO3、 K2HPO4、 KH2PO4中的一种或几种。 7.如权利要求5所述的方法， 其特征在于 所述碳源选自可溶性淀粉、 玉米淀粉、 甘油、 葵花籽油、 糊精、 葡萄糖、 土豆淀粉、 麦芽 糖、 蔗糖、 菜油、 甘露醇中的一种或几种； 优选可溶性淀粉、 玉米淀粉、 甘油、 葵花籽油、 糊精、 葡萄糖、 土豆淀粉、 麦芽糖、 菜油、 甘露醇中的一种或几种， 最优选玉米淀粉、 甘油、 糊精、 葡 萄糖中的一种或几种。 8.如权利要求5所述的方法， 其特征在于所述氮源选自豆粕粉、 生豆粉、 肉胨、 啤酒酵母 粉、 面包酵母粉、 热黄豆饼粉、 固体玉米浆、 硫酸铵、 鱼胨、 酵母浸出膏、 。
8、尿素、 棉籽饼粉、 酵母 权利要求书 1/2 页 2 CN 105624068 A 2 浸出粉、 蚕蛹粉、 玉米蛋白粉中的一种或几种； 优选豆粕粉、 生豆粉、 肉胨、 啤酒酵母粉、 面包 酵母粉、 热黄豆饼粉、 固体玉米浆、 硫酸铵、 酵母浸出膏、 尿素、 玉米蛋白粉中一种或几种； 更 优选为啤酒酵母粉、 面包酵母粉、 热黄豆饼粉、 固体玉米浆、 硫酸铵、 肉胨中一种或几种。 9.如权利要求5所述的方法， 其特征在于所述无机盐选自CaCO3、 MgSO4、 K2HPO4、 NaCl、 KNO3， ZnSO4、 KCl、 KH2PO4中的一种或几种； 优选CaCO3、 MgSO4、 K2HPO4。
9、、 NaCl、 KNO3、 KH2PO4中的 一种或几种； 最优选CaCO3、 K2HPO4、 NaCl中的一种或几种。 10.如权利要求5所述的方法， 其特征在于所述氨基酸选自亮氨酸， L-异亮氨酸、 L-缬氨 酸、 谷氨酸、 谷氨酸钠、 L-组氨酸中一种或几种； 优选为自亮氨酸， L-异亮氨酸、 L-缬氨酸、 谷 氨酸、 谷氨酸钠中一种或几种； 最优选为L-异亮氨酸、 谷氨酸钠中一种或几种。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105624068 A 3 筑波链霉菌及其在制备他克莫司中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种新型微生物及其用途和应用， 尤其涉及一种筑波链霉菌及其在制 备他克。
10、莫司中的应用。 背景技术 0002 他克莫司(Tacrolimus)又名FK506， 其化学结构属23元大环内酯类抗生素， 为一种 强力的新型免疫抑制剂。 在分子水平， 本品的作用是由细胞质内与之结合的蛋白FKBP12介 导的。 FKBP12使得本品进入细胞内， 并形成复合物， 该复合物竞争性地与钙调素特异性地结 合并抑制钙调素， 后者介导T细胞内-钙依赖性抑制性信号传递系统， 从而阻止一系列淋巴 因子基因转录。 体内外实验证明， 他克莫司是一强效的免疫抑制剂， 可抑制细胞毒淋巴细胞 的形成， 移植排斥反应主要是由后者引起。 该药抑制T细胞活化及TH细胞依赖性的B细胞增 殖， 以及淋巴因子的生。
11、成如白细胞介素2， 白细胞介素3及 -干扰素， 以及白细胞介素-2受体 的表达。 他克莫司可抑制皮肤、 心脏、 肾、 肝移植的排斥反应， 延长同种移植物的存活时间， 已在啮齿类动物、 犬、 灵长类动物和人类身上得到证实。 上市以来已广泛用于肝、 肾和骨髓 移植的急慢性排斥治疗。 0003 目前有关他克莫司生产方法的报道主要有美国专利US4894366， US4929611， US5116756， US5264355， US5496727和US5624842。 这些专利报道了用不同的链霉菌株生产他 克莫司， 产量不是很高， US5116756专利中提到的streptomycessp.MA6858。
12、和US5624842中提 到的streptomycestsukubaensis的他克莫司生产菌株， 生产他克莫司的产量都很低， 其发 酵液中他克莫司的浓度最高只有37 .8mg/L。 中国专利 发酵生产他克莫司的方法 (CN201310644714.1)报道一种链霉菌产他克莫司为385 g/ml， 且需中间补料， 工艺繁琐。 中 国专利 一种链霉菌及其应用 (CN200810019003.4)公开的最高发酵单位为550 g/ml。 中国 专利 一种高纯度他克莫司的制备方法 (CN201210447477.5)公开的最高发酵单位为491 g /m l ， 但未 提 及发 酵 工艺 。 中国 专 。
13、利 基因 工程 菌筑 波 链霉 菌L 20 及其 应 用 (CN201510664086.2)提到基因工程菌通过摇瓶发酵单位可达到716mg/L。 0004 国外期刊 JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology (2009,36 (12):1467-1471)一文 StraindevelopmentofStreptomycessp.fortacrolimus productionusingsequentialadaptation 中提到通过逐渐提高培养基中他克莫司的浓 度600-1600 g/ml来增加菌株对产物的耐受性， 最终获得的菌株在5L发。
14、酵罐中达到972 g/ ml。 国内期刊 微生物学杂志 2014年10月第34卷第5期中的 抗性突变他克莫司高产菌株的 选育 提到通过抗性突变育种得到高产菌株H-493， 在50L发酵罐中能达到918 g/ml， 但未经 过工业化试生产。 这两种菌株都涉及抗性突变选育， 其菌种后期的稳定性有待考察。 0005 综上所述， 国内外报道的他克莫司发酵生产技术中， 采用抗性突变菌株、 基因工程 菌的发酵技术单位高， 但该发酵技术只经过小试试验未经过工业化生产确认； 采用常规菌 株的发酵工艺单位低， 并且发酵副产物较多， 特别是其中的同分异构体FK520的含量较高， 因为是同分异构很难通过后期的纯化工。
15、艺去除， 导致后提取工艺较为复杂， 大大地增加了 说明书 1/11 页 4 CN 105624068 A 4 后续的提纯难度， 难以获得高纯度的最终产品， 从而难以更好地进行产业化生产。 发明内容 0006 本发明的目的是针对上述问题， 提供一种发酵单位高且副产物少的他克莫司产生 菌。 0007 本发明所提供筑波链霉菌HDW68， 分类命名为streptomycestsukubansisHDW68， 由中国典型培养物保藏中心保藏(简称CCTCC)， 保藏号为： CCTCCM2016086， 保藏日期为： 2016年03月07日。 所述的保藏号为CCTCCM2016086的菌株是从云南新平哀牢山。
16、周围的土 壤中筛选得到的。 0008 所述的保藏号为CCTCCM2016086的菌株的菌落特征： 菌落橘红色或红色， 近圆 形， 菌落直径2-4mm， 菌落隆起且分瓣， 中心陷落成坑。 0009 根据微生物形态学及国外相关资料的描述， 结合保藏号为CCTCCM2016086的菌 株的各种培养特征和形态特征， 该保藏号为CCTCCM2016086的菌株应属于链霉菌属， 定名 为streptomycestsukubansisHDW68。 0010 本发明的另一目的是提供该菌株在制备他克莫司中的应用。 0011 所述的保藏号为CCTCCM2016086的菌株可应用于发酵制备他克莫司。 该制备方 法包。
17、括下列步骤： 0012 a.发酵菌株采用保藏编号为CCTCCM2016086的菌株； 0013 b.菌株培养： 将按常规方法制备的30甘油菌丝冷冻管(即工作菌种库)接入摇 瓶进行种子培养得摇瓶种子液； 将摇瓶种子液接种于摇瓶发酵培养基中或种子罐中培养； 将种子罐培养液接种于发酵罐培养基培养， 收集发酵液； 优选在发酵培养过程中无需进行 补料， 待种子罐菌丝生长良好接入发酵罐后， 根据发酵液实际情况从pH、 菌浓、 搅拌转速、 溶 氧及菌丝镜检情况等方面来控制发酵过程即可。 0014 c.发酵产物提取： 提取、 浓缩、 预结晶、 层析、 结晶和干燥。 0015 其中所述的步骤b为： 将按常规方法。
18、制备的30甘油菌丝冷冻管(工作菌种库)按 摇瓶种子培养基体积的0.81.2接入摇瓶种子培养基， 250rpm， 培养2230h， 得摇瓶种 子液； 将摇瓶种子液按种子罐培养基体积的0.020.05的接种量接种于种子罐， 搅拌速 度150250rpm， 培养2230h； 将种子罐培养液按发酵培养基体积的515的量接种于发 酵罐培养基， 搅拌速度150250rpm， 发酵培养67天， 收集发酵液； 其中培养温度均为26 30。 0016 本发明还公开了培养基： 按重量体积比计， 摇瓶、 种子罐培养过程中的碳源为0.5 4.0， 优选0.53.0， 最优选为1.22.5； 氮源为0.24.0， 优选。
19、0.53.5， 最 优选为0.52.0； 无机盐为0.22.0， 优选0.21.5， 最优选0.21.0； 其余为水。 0017 其中碳源选自可溶性淀粉， 大豆油， 葡萄糖、 玉米淀粉、 甘油、 麦芽糖、 蔗糖中的一 种或几种； 优选可溶性淀粉， 大豆油， 葡萄糖、 玉米淀粉、 甘油、 麦芽糖中的一种或几种； 最优 选葡萄糖、 玉米淀粉、 甘油中的一种或几种。 0018 其中氮源选酵母浸出粉、 玉米粉、 热黄豆饼粉、 大豆蛋白粉、 豆粕粉、 生豆粉、 啤酒 酵母粉、 固体玉米浆、 硫酸铵中的一种或几种； 优选热黄豆饼粉、 大豆蛋白粉、 生豆粉、 啤酒 酵母粉、 固体玉米浆、 硫酸铵中的一种或几。
20、种； 更优选热黄豆饼粉、 啤酒酵母粉、 硫酸铵中的 说明书 2/11 页 5 CN 105624068 A 5 一种或几种。 0019 其中无机盐CaCO3、 K2HPO4、 NaCl、 KNO3， MgSO4、 KCl、 KH2PO4中的一种或几种； 优选 CaCO3、 K2HPO4、 NaCl、 KNO3、 KH2PO4中的一种或几种； 更优选CaCO3、 K2HPO4、 KH2PO4中的一种或 几种。 0020 按重量体积比计， 发酵培养过程中的碳源为3.012.0， 优选3.010.0)， 最 优选7.09.0； 氮源为1.08.0， 优选1.06.0， 最优选2.94.5； 无机盐为。
21、0.2 2.0， 优选0.21.5， 最优选0.251.0； 氨基酸为0.22.0， 优选0.21.5， 最优 选0.51.0； 其余为水。 0021 其中碳源选自可溶性淀粉、 玉米淀粉、 甘油、 葵花籽油、 糊精、 葡萄糖、 土豆淀粉、 麦芽糖、 蔗糖、 菜油、 甘露醇中的一种或几种； 优选可溶性淀粉、 玉米淀粉、 甘油、 葵花籽油、 糊精、 葡萄糖、 土豆淀粉、 麦芽糖、 菜油、 甘露醇中的一种或几种， 最优选玉米淀粉、 甘油、 糊 精、 葡萄糖中的一种或几种。 0022 其中氮源选自豆粕粉、 生豆粉、 肉胨、 啤酒酵母粉、 面包酵母粉、 热黄豆饼粉、 固体 玉米浆、 硫酸铵、 鱼胨、 酵。
22、母浸出膏、 尿素、 棉籽饼粉、 酵母浸出粉、 蚕蛹粉、 玉米蛋白粉中的 一种或几种； 优选豆粕粉、 生豆粉、 肉胨、 啤酒酵母粉、 面包酵母粉、 热黄豆饼粉、 固体玉米 浆、 硫酸铵、 酵母浸出膏、 尿素、 玉米蛋白粉中一种或几种； 更优选为啤酒酵母粉、 面包酵母 粉、 热黄豆饼粉、 固体玉米浆、 硫酸铵、 肉胨中一种或几种。 0023 其中无机盐选自CaCO3、 MgSO4、 K2HPO4、 NaCl、 KNO3， ZnSO4、 KCl、 KH2PO4中的一种或几 种； 优选CaCO3、 MgSO4、 K2HPO4、 NaCl、 KNO3、 KH2PO4中的一种或几种； 最优选CaCO3、 。
23、K2HPO4、 NaCl 中的一种或几种。 0024 其中氨基酸选自亮氨酸， L-异亮氨酸、 L-缬氨酸、 谷氨酸、 谷氨酸钠、 L-组氨酸中一 种或几种； 优选为自亮氨酸， L-异亮氨酸、 L-缬氨酸、 谷氨酸、 谷氨酸钠中一种或几种； 最优 选为L-异亮氨酸、 谷氨酸钠中一种或几种。 0025 经发酵完成放罐后， 对发酵产物进行提取、 浓缩、 预结晶、 层析、 结晶和干燥后可以 获得纯度达99以上的他克莫司。 0026 本发明的技术效果主要体现在： 0027 1、 本发明所公开的筑波链霉菌是目前用于生产的一种高单位的他克莫司产生菌， 发酵性能优良， 可用于大规模生产。 本发明提供的发酵工艺。
24、经过摇瓶、 小试(1吨发酵罐)、 中 试(4吨发酵罐)及20吨生产发酵罐进行试验及生产， 其生产能力稳定。 经检测， 用本发明提 供的菌株及发酵培养方法制备的他克莫司效价达到1100 g/ml或以上， 从而为后续的工业 化生产提供了良好的基础。 0028 2、 本发明所公开的菌株从云南新平哀牢山周围的土壤中筛选得到的， 在优化工艺 后， 经多年实验及生产， 其菌株稳定性良好。 经生理生化、 培养特征及基因测序证明该菌株 为筑波链霉菌。 0029 3、 本发明所公开的筑波链霉菌的发酵副产物相对较少， 特别是他克莫司的重要副 产物也是同分异构体FK520的含量明显减少， 降低了后提取的难度， 提取。
25、和纯化的工艺相对 简单， 大大提高了收率和纯度， 在工业化生产上更具优势。 0030 菌株保藏情况： 保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)， 保藏地址为中国. 武汉 .武汉大学， 保藏编号为CCTCCNO:M2016086， 分类命名为筑波链霉菌HDW68 说明书 3/11 页 6 CN 105624068 A 6 (streptomycestsukubansisHDW68)。 保藏日期为2016年03月07日。 附图说明 0031 图1为按中国专利 一种链霉菌及其应用 (CN200810019003.4)实施例6制备得到 的样品的FK520含量HPLC图； 0032 图2、 3、 。
26、4为以本申请实施例7制备得到的不同样品的FK520含量HPLC图。 具体实施方式 0033 通过下面给出的具体实施例， 可以进一步清楚的了解本发明， 但他们不是对本发 明的限定。 0034 实施例1： 保藏号为CCTCCM2016086的菌株的培养特征 0035 将保藏号为CCTCCM2016086的菌株接种于高氏一号、 葡萄糖天门冬素等用于观 察形态特征的培养基。 28培养一定的时间5、 7、 10天， 观察并进行描述。 0036 保藏号为CCTCCM2016086的菌株在各种培养基上的菌落特征 0037 0038 实施例2： 碳源利用及生理生化特征 0039 生理生化性质采用链霉菌分类中的。
27、标准方法。 0040 保藏号为CCTCCM2016086的菌株的生理生化反应为： 在明胶培养基上能液化明 胶， 胨化牛奶， 不能凝固牛奶， 淀粉水解阴性， 不利用纤维素， 硝酸盐还原阴性。 0041 利用Biolog(GEN)自动微生物鉴定系统对菌株streptomycestsukubaensis进 行了94种表型测试， 包括71种碳源利用情况检测以及23种化学敏感性检测： 将菌株接种特 定的平板培养基， 33恒温培养2天， 用无菌棉签将平板上的菌体洗下， 与接种液(IF-A)混 合， 制成菌悬液， 用浊度计调整至92T/IF-A。 用8孔电动加液器将菌悬液分别加在Biolog (GEN)微孔。
28、的各孔中， 每孔100 l。 将微孔鉴定板放在33培养箱中， 分别在培养12h、 24h、 32h后将其置于Biolog读数仪上读取结果。 0042 经Biolog读数仪分析代谢指纹， 筑波链霉菌streptomycestsukubaensis对3种化 说明书 4/11 页 7 CN 105624068 A 7 学物质敏感； 菌株可较强利用其中17种碳源， 对其它54种碳源利用能力较弱或不能利用。 菌 株。 Biolog系统给出36h鉴定结果。 Biolog鉴定结果见表1和表2。 0043 表1筑波链霉菌对BiologGEN板上23种化学物质的化学敏感性 0044 0045 说明： +， 阳性。
29、； -， 阴性； B， 不确定 0046 表2筑波链霉菌对Biolog(GEN)板上71种碳源的利用能力 0047 说明书 5/11 页 8 CN 105624068 A 8 0048 说明书 6/11 页 9 CN 105624068 A 9 0049 0050 说明： +， 阳性； -， 阴性； B， 不确定 0051 实例3： 他克莫司的生产发酵培养 0052 采用CCTCCM2016086的菌株 0053 1.摇瓶种子培养 0054 培养基： 可溶性淀粉0.3g， 大豆油0.2g， 酵母浸出粉0.1g， 玉米粉0.1g， KH2PO4 0.1g， CaCO30.1g， pH自然， 加水。
30、至100ml。 0055 接种量： 按0.8ml/瓶的接种量 0056 培养： 28,24h， 250rpm 0057 在菌丝长起， 有明显挂壁现象后， 将100ml摇瓶种子培养液接入种子罐中培养。 0058 2.种子罐培养 0059 培养基： 可溶性淀粉1.5kg， 大豆油1kg， 酵母浸出粉0.5kg， 玉米粉0.5kg， KH2PO4 0.5kg， CaCO30.5kg， pH自然， 加水至0.5吨。 0060 装量： 1吨发酵罐内装培养基0.5吨， 121灭菌30min。 0061 接种量： 100ml摇瓶种子。 0062 培养： 28,30h， 150rpm 0063 3.发酵罐培养。
31、 0064 培养基： 土豆淀粉10kg， 甘油2.5kg， 葵花籽油2.5kg， 豆粕粉2kg， 生豆粉2kg， 肉胨 1kg， 亮氨酸1kg， CaCO30.5kg、 MgSO40.5kg， 加水至0.5吨， 调pH8.5。 0065 装量： 1吨发酵罐内装培养基0.5吨。 0066 接种量： 75L的种子液 0067 培养温度： 28,起始调节罐压0.05MPa， 空气流量在1： (0.60.2)vvm， 搅拌转速 250rpm。 代谢过程中当相对溶氧值低于30时， 先调大空气流量到1： (10.2)vvm； 当相对 溶氧值再次低于30时， 调大搅拌桨变频值(搅拌桨变频值在(150250)。
32、rpm之间)； 如果相 对溶氧值再次低于30， 则在(0.050.08)MPa范围内增大罐压(发酵过程中罐压维持在 (0.020.08)之间)。 发酵周期为7天。 0068 放罐单位： 1323 g/ml 0069 实例4： 他克莫司的生产发酵培养 0070 采用CCTCCM2016086的菌株 0071 1.摇瓶种子培养 0072 培养基： 麦芽糖3g， 甘油6g， 生豆粉3g， 大豆蛋白粉1.5g， 固体玉米浆6g， CaCO3 0.6g、 NaCl2.4g， KNO31.5g， 加水定容至300ml， pH自然 0073 接种量： 按1ml/瓶的接种量 0074 培养： 26,30h， 。
33、250rpm 0075 在菌丝长起， 有明显挂壁现象后， 将300ml摇瓶种子培养液接入种子罐中培养。 0076 2.种子罐培养 说明书 7/11 页 10 CN 105624068 A 10 0077 培养基： 麦芽糖10kg， 甘油20kg， 生豆粉10kg， 大豆蛋白粉5kg， 固体玉米浆20kg， CaCO32kg、 NaCl8kg， KNO35kg， 加水定容至1吨， pH自然。 0078 装量： 4吨发酵罐内装培养基1吨， 121灭菌30min。 0079 接种量： 300ml摇瓶种子。 0080 培养： 26,27h， 200rpm 0081 3.发酵罐培养 0082 培养基： 。
34、可溶性淀粉150kg， 菜油25kg， 甘露醇75kg， 玉米蛋白粉50kg， 酵母浸出膏 75kg， 热黄豆粉12.5kg， 尿素12.5kg， L-异亮氨酸12.5kg， 谷氨酸12.5kg， L-缬氨酸12.5kg， KH2PO412.5kg， KNO312.5kg， CaCO312.5kg， 加水定容至2.5吨， 调pH8.8。 0083 装量： 4吨发酵罐内装培养基2.5t， 121灭菌30min。 0084 接种量： 250L的种子液 0085 培养温度： 27,起始调节罐压0.05MPa， 空气流量在1： (0.60.2)vvm， 搅拌转速 200rpm。 代谢过程中当相对溶氧值。
35、低于30时， 先调大空气流量到1： (10.2)vvm； 当相对 溶氧值再次低于30时， 调大搅拌桨变频值(搅拌桨变频值在(150250)rpm之间)； 如果相 对溶氧值再次低于30， 则在(0.050.08)MPa范围内增大罐压(发酵过程中罐压维持在 (0.020.08)之间)。 发酵周期为7天。 0086 发酵液放罐单位： 1288 g/ml。 0087 实例5： 他克莫司的生产发酵培养 0088 采用CCTCCM2016086的菌株 0089 1.摇瓶种子培养 0090 培养基： 葡萄糖20g， 蔗糖20g， 啤酒酵母粉10g， 豆粕粉30g， MgSO45g， KCl10g， CaCO。
36、35g， pH自然， 加水定容至1000ml， 分装10瓶。 0091 接种量： 按1ml/瓶的接种量 0092 培养： 30,22h， 250rpm 0093 在菌丝长起， 有明显挂壁现象后， 将1000ml摇瓶种子培养液接入种子罐中培养。 0094 2.种子罐培养 0095 培养基： 葡萄糖40kg， 蔗糖40kg， 啤酒酵母粉20kg， 豆粕粉60kg， MgSO410g， KCl 20g， CaCO310g， 泡敌2kg， pH自然， 加水定容至2吨。 0096 装量： 4吨发酵罐内装培养基2吨， 121灭菌30min。 0097 接种量： 1000ml摇瓶种子。 0098 培养： 3。
37、0,22h， 200rpm 0099 3.发酵罐培养 0100 培养基： 蔗糖125kg， 葡萄糖25kg， 麦芽糖150kg， 鱼胨25kg， 棉籽饼粉75kg， 酵母浸 出粉50kg， 蚕蛹粉50kg， 谷氨酸25kg， L-组氨酸25kg， ZnSO415kg， KCl25kg， CaCO310kg， 加 水定容至2.5t， 调pH9.0 0101 装量： 4吨发酵罐内装培养基2.5吨 0102 接种量： 375L的种子液 0103 培养温度： 29,起始调节罐压0.05MPa， 空气流量在1： (0.60.2)vvm， 搅拌转速 150rpm。 代谢过程中当相对溶氧值低于30时， 先调。
38、大空气流量到1： (10.2)vvm； 当相对 说明书 8/11 页 11 CN 105624068 A 11 溶氧值再次低于30时， 调大搅拌桨变频值(搅拌桨变频值在(150250)rpm之间)； 如果相 对溶氧值再次低于30， 则在(0.050.08)MPa范围内增大罐压(发酵过程中罐压维持在 (0.020.08)之间)。 发酵周期为6天。 0104 发酵液放罐单位： 1363 g/ml。 0105 实例6： 他克莫司的生产发酵培养 0106 采用CCTCCM2016086的菌株 0107 1.摇瓶种子培养 0108 培养基： 甘油6g， 玉米淀粉9g， 啤酒酵母粉1.2g， 硫酸铵1.8。
39、g， K2HPO43g， CaCO33g， pH自然， 加水定容至600ml， 分装6瓶。 0109 接种量： 按1.2ml/瓶的接种量 0110 培养： 29,28h， 250rpm 0111 在菌丝长起， 有明显挂壁现象后， 将600ml摇瓶种子培养液接入种子罐中培养。 0112 2.种子罐培养 0113 培养基： 甘油15kg， 玉米淀粉22.5kg， 啤酒酵母粉3kg， 硫酸铵4.5kg， K2HPO47.5kg， CaCO37.5kg， 泡敌1.5kg， pH自然， 定容至1.5吨。 0114 装量： 4吨发酵罐内装培养基1.5吨， 121灭菌30min。 0115 接种量： 600。
40、ml摇瓶种子。 0116 培养： 28,28h， 250rpm 0117 3.发酵罐培养 0118 培养基： 甘油140kg， 葡萄糖280kg， 玉米淀粉210kg， 肉胨70kg， 啤酒酵母粉105kg， 热黄豆粉35kg， 固体玉米浆70Kg， 硫酸铵35kg， L-异亮氨酸35Kg， 谷氨酸钠35kg， K2HPO4 21kg， NaCl28kg， CaCO321kg， 泡敌14kg， 加水定容至7吨， 调pH9.5。 0119 装量： 20吨发酵罐内装培养基7吨 0120 接种量： 0.35吨的种子液 0121 培养温度： 30,起始调节罐压0.05MPa， 空气流量在1： (0.6。
41、0.2)vvm， 搅拌转速 150rpm。 代谢过程中当相对溶氧值低于30时， 先调大空气流量到1： (10.2)vvm； 当相对 溶氧值再次低于30时， 调大搅拌桨变频值(搅拌桨变频值在(150250)rpm之间)； 如果相 对溶氧值再次低于30， 则在(0.050.08)MPa范围内增大罐压(发酵过程中罐压维持在 (0.020.08)之间)。 发酵周期为7天。 0122 发酵液放罐单位： 1184 g/ml。 0123 实例7： 他克莫司的生产发酵培养 0124 采用CCTCCM2016086的菌株 0125 1.摇瓶种子培养 0126 培养基： 葡萄糖1g， 玉米淀粉5g， 热黄豆饼粉1。
42、0g， CaCO37.5g， pH自然， 加水定容至 500ml， 分装5瓶。 0127 接种量： 按1.0ml/瓶的接种量 0128 培养： 28,26h， 250rpm 0129 在菌丝长起， 有明显挂壁现象后， 将500ml摇瓶种子培养液接入种子罐中培养。 0130 2.种子罐培养 说明书 9/11 页 12 CN 105624068 A 12 0131 培养基： 葡萄糖3kg， 玉米淀粉15kg， 热黄豆饼粉30kg， CaCO33kg， 泡敌1.5kg， pH自 然， 定容至1.5吨。 0132 装量： 4吨发酵罐内装培养基1.5吨， 121灭菌30min。 0133 接种量： 50。
43、0ml摇瓶种子。 0134 培养： 28,25h， 200rpm 0135 3.发酵罐培养 0136 培养基： 糊精910kg， 面包酵母粉78kg， 啤酒酵母粉221kg， 固体玉米浆65Kg， 硫酸铵 13kg， CaCO332.5kg， CaCO36.5kg， 泡敌42kg， 加水定容至13吨， 调pH8.9。 0137 装量： 20吨发酵罐内装培养基13吨 0138 接种量： 1.5吨的种子液 0139 培养温度： 26,起始调节罐压0.05MPa， 空气流量在1： (0.60.2)vvm， 搅拌转速 150rpm。 代谢过程中当相对溶氧值低于30时， 先调大空气流量到1： (10.2。
44、)vvm； 当相对 溶氧值再次低于30时， 调大搅拌桨变频值(搅拌桨变频值在(150250)rpm之间)； 如果相 对溶氧值再次低于30， 则在(0.050.08)MPa范围内增大罐压(发酵过程中罐压维持在 (0.020.08)之间)。 发酵周期为6.5天。 0140 按照上述发酵条件和工艺， 在20吨发酵罐进行3批发酵试验， 发酵单位分别为1158 g/ml、 1161 g/ml和1216 g/ml。 0141 实施例8： FK520含量测定 0142 测定方法： HPLC法检测 0143 样品： 实施例7中的发酵液 0144 对照样： 按中国专利 一种链霉菌及其应用 (CN20081001。
45、9003.4)实施例6制备的 样品。 0145 色谱条件： 0146 色谱柱： C8柱(4.6150mm,5 m)； 0147 流速： 1.0mL/min； 0148 进样体积： 20 l； 0149 检测波长:210nm； 0150 柱温:60； 0151 记录时间： 65min(其中样品的间隔时间不得少于1min)； 0152 流动相： 溶液A和溶液B的混合液， 梯度时间程序表见下表。 说明书 10/11 页 13 CN 105624068 A 13 0153 0154 溶液A： 0.02mol/L磷酸二氢钾溶液， 用磷酸调pH至3.5。 0155 溶液B： 乙腈。 0156 空白： 丙酮。 0157 结果： 0158 经HPLC检测后， 以按中国专利 一种链霉菌及其应用 (CN200810019003.4)实施例 6制备的样品中FK520含量为3.58， 见附图1。 以实施例7制备得到的样品的FK520含量为分 别1.47、 1.55、 1.61， 见附图2、 3、 4。 两者相比， FK520含量下降50。 说明书 11/11 页 14 CN 105624068 A 14 图1 图2 图3 说明书附图 1/2 页 15 CN 105624068 A 15 图4 说明书附图 2/2 页 16 CN 105624068 A 16 。