技术领域
本发明涉及抗体工程技术领域，具体涉及全人源的抗PD-1的单克隆抗体、及其获得方法与应用。
背景技术
免疫调节在机体免疫应答过程中起着极其重要的作用，而免疫活性细胞的活化对整个免疫应答的调节极其关键。研究表明，T细胞活化和增殖依赖于双重信号途径。“协同刺激信号”的概念是1970年Bretscher和Cohn在T细胞活化双信号模型的基础上提出来的，即T细胞的活化不仅需要通过APC递呈MHC-抗原肽复合物给抗原特异性T细胞来提供第一信号外，还需要多种协同刺激分子参与提供辅助的第二信号(协同刺激信号)；随着研究的深入，协同刺激信号逐渐成为免疫学的热点领域；这些协同信号分子主要包括CD28/B7和TNFR/TNF两大超家族。PD-1/PD-L1作为CD28/B7超家族的成员，能介导负性协同刺激信号。PD-1/PD-L1信号通路能有效抑制T、B细胞功能，使T细胞增殖受抑，同时减少细胞因子IL-2、IL-10和IFN-γ的分泌，在免疫调节中发挥着重要的作用，并在肿瘤免疫、自身免疫、移植免疫、哮喘、病毒感染等疾病的研究中有着重要的意义。
PD-1属于免疫球蛋白超家族I型跨膜蛋白，分子量约为50-55KD。最初是在凋亡的T细胞杂交瘤中通过消减杂交技术得到的，因其与细胞凋亡有关故命名为程序性细胞死亡因子1(ProgrammedCellDeath1)。PD-1的编码基因是PD-CD1，定位于人染色体2q37.3，和CTLA4基因具有23％的同源性。PD-1由胞内区、跨膜区和胞外区构成，其胞外区包含一个免疫球蛋白可变区IgV样结构域；其胞内区N端的两个酪氨酸残基与其他氨基酸残基共同组成了一个免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)，ITIM通过酪氨酸的磷酸化发挥拮抗抗原受体刺激信号的功能，从而在免疫应答过程中发挥负性调控功能；PD-1分子可在活化的T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和树突状细胞表面诱导性地表达，并与其配体PD-L1、PD-L2相结合而对淋巴细胞的活化产生抑制作用，从而抑制免疫细胞的免疫应答反应。
PD-L1(CD274或B7H1)和PD-L2(CD273或B7DC)是PD1的两个配体，这两个配体基因均定位于人染色体9p24.2，并起始于同一方向，间隔42kb左右；它们同属B7家族，因而同其他成员一样，在蛋白结构上PD-L1和PD-L2均由IgV样结构域、IgC样结构域、跨膜区和短而保守的胞质区尾巴组成；与PD-L2相比，PD-L1的胞质尾巴在不同种属间更为保守。PD-L1在活化的T细胞、B细胞、树突状细胞、单核细胞和多种类型的肿瘤细胞(如肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、头颈癌、食道癌、皮肤癌、鳞状细胞癌等)上诱导性表达；PD-L2主要表达于活化的巨噬细胞、树突细胞和个别肿瘤细胞(如霍奇金淋巴瘤)上。肿瘤表面的PD-L1与PD-1相互作用，可导致肿瘤抗原特异性T细胞凋亡，使肿瘤细胞逃脱机体免疫监控。抗PD-1的单抗通过阻断PD-1/PD-L1信号通路促进肿瘤抗原特异性T细胞增殖，发挥杀伤肿瘤细胞的作用，能有效提高免疫治疗效果，具有治疗多种类型肿瘤的潜力。
目前多家大型国际制药公司都在进行针对PD-1或PD-L1的单抗药物(如表1所示)，其中百事美施贵宝的PD-1抑制剂Opdvio(Nivolumab)于2014年7月获日本批准上市；默沙东的PD-1抑制剂于2014年9月获FDA批准上市；这两个药物的首个适应症均为黑色素瘤。随着各公司临床项目的推进，适应症已扩展到肺癌、乳腺癌、血液癌症等领域。
表1、当前正在开展临床实验的抗PD-1抗体
目前全人源性抗体是治疗性抗体发展的主要方向，抗体库技术的出现为人源抗体的制备筛选提供了良好的技术平台。抗体库技术绕过了以往单抗研制过程中必须的杂交瘤过程，甚至不需要经过免疫过程即可获得各种抗体基因及抗体分子片段。噬菌体抗体库是最早出现也是目前应用最广泛的抗体库。
噬菌体展示技术是由Smith首先建立的一种将编码外源蛋白或多肽的基因插入噬菌体衣壳蛋白基因，使外源蛋白或多肽与噬菌体衣壳蛋白融合表达于噬菌体表面的技术。噬菌体抗体库就是利用了上述原理将不同特异性的抗体或其功能性片段(Fab、Fv、ScFv)表达在噬菌体表面，再用抗原进行筛选。噬菌体抗体库根据抗体基因的来源分为免疫库和非免疫库，非免疫库又包括天然库、半合成库和全合成库。噬菌体抗体库的筛选模拟了抗体亲和力成熟的过程，通常将抗原包被在固相介质上，加入待筛选的噬菌体抗体库，通过数轮“吸附-洗涤-洗脱-扩增”的过程(即淘选)直至筛选到高亲和力特异的抗体。
发明内容
本发明提供了一种抗PD-1的单克隆抗体；本发明从全合成抗体库中筛选出抗PD-1的单克隆抗体，然后通过计算机辅助设计分析，构建小容量合成噬菌体抗体轻链库的方法，对初筛获得的抗PD-1单克隆抗体DFPD1-1轻链的互补决定区CDR1、2、3区突变建库；筛选后，选取亲和力较高的单克隆抗体DFPD1-3和DFPD1-7，再对其重链CDR1、2、3区突变建库进行筛选，最终筛选到了高亲和力的抗PD-1的单克隆抗体。
为实现上述目的，本发明一种抗PD-1的单克隆抗体的获得过程包括：
(1)、抗PD-1单链抗体的生物淘选，通过三轮抗体库的富集筛选，从全合成的ScFv噬菌体库中获得了一种亲和力较高的抗体序列DFPD1-1，其重链为DFPD1-H1(SEQNO.1)，轻链为DFPD1-L1(SEQNO.5)。
(2)、以DFPD1-1为基础，通过计算机三级结构模拟，构建轻链互补决定区CDR1、2、3突变库并对该抗体库进行生物淘选和阳性克隆的筛选及鉴定，获得了6种不同轻链的抗体序列DFPD1-2、DFPD1-3、DFPD1-4、DFPD1-5、DFPD1-6、DFPD1-7，他们对应的轻链序列分别为DFPD1-L2(SEQNO.6)、DFPD-L3(SEQNO.7)、DFPD1-L4(SEQNO.8)、DFPD1-L5(SEQNO.9)、DFPD1-L6(SEQNO.10)、DFPD1-L7(SEQNO.11)；将上述7种单链抗体在噬菌体水平进行亲和力比较。
(3)、选出两株亲和力较高的克隆DFPD1-3和DFPD1-7，构建重链互补决定区CDR1、2、3库并对该库进行生物淘选和阳性克隆的筛选，获得了五种不同的单链抗体序列DFPD1-9，DFPD1-10、DFPD1-11、DFPD1-12、DFPD1-13。其中DFPD1-9、DFPD1-11和DFPD1-12的轻链可变区序列是DFPD1-L3，而DFPD1-10和DFPD1-13的轻链可变区序列是DFPD1-L7；DFPD1-9和DFPD1-10的重链可变区序列是DFPD1-H2(SEQNO.2)，DFPD1-11和DFPD1-13的重链可变区是DFPD1-H3(SEQNO.3)，DFPD1-12的重链可变区是DFPD1-H4(SEQNO.4)。将上述单链抗体在噬菌体水平上进行亲和力比较。
(4)、将(3)中所述单克隆重链可变区基因和轻链可变基因及轻重链恒定区基因克隆到真核表达载体，转染宿主细胞，获得单克隆抗体的全抗再进行亲和力和其他生物学功能比较。
通过上述方法获得的抗PD-1的单克隆抗体，包括：轻链和重链；所述轻链的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3分别用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示；LCDR1包含RASQNIHSYLD、RASQNVSNWLD、RASQSIHNYLD、RASQDINNWLDRASQDVRTYLD、RASQGINSWLD或RASQSVSNYLD中的任一种；LCDR2包含EASTRAS、DASNRAT、NASTRAT、DASTLAT、GASTRAT或DASTRAT中的任一种；LCDR3包含QQALKLPIT、QQSRHIPLT、QQELHLPLT、QQNVNLPLT、QQDIDLPLT、QQSYRLPLT或QQNMQLPLT中的任一种。
其中，所述轻链可变区氨基酸序列包含SEQNO.5、SEQNO.6、SEQNO.7、SEQNO.8、SEQNO.9、SEQNO.10或SEQNO.11中的任一种。
通过上述方法获得的抗PD-1的单克隆抗体，包括：轻链和重链；所述重链的互补决定区CDR1，CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示；HCDR1包含SNNGMH或SNYGMH；HCDR2包含VIWYDGSKK、VIWYDSSRK或VIWYDSTKK中的任一种；HCDR3包含TAVYYCATNNDYW或TAVYYCATNTDYW。
其中，所述重链可变区氨基酸序列包含SEQNO.1、SEQNO.2、SEQNO.3或SEQNO.4中的任一种。
其中，本发明还提供了一种包含上述轻链或上述重链的抗体、多肽或蛋白质。
其中，本发明还提供了一种包含上述轻链或上述重链的抗体，所述抗体能够阻断PD-1与其配体PD-L1的结合，抑制PD-1的生物学活性。
其中，本发明还提供了一种包含上述轻链或上述重链的多核苷酸序列或组合。
其中，本发明还提供了一种包含上述多核苷酸序列或组合的重组DNA表达载体；所述载体的DNA序列中包含编码抗PD1抗体的重链可变区及恒定区或轻链可变区及恒定区序列的氨基酸序列。
其中，本发明还提供了一种转染上述重组DNA表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包含大肠杆菌等原核细胞、酵母或哺乳动物细胞。
优选地，所述宿主细胞包含HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。
其中，本发明还提供了一种含有上述轻链或上述重链的抗体，用于全抗、单链抗体、单域抗体、双特异抗体、抗体药物偶联物或嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。
其中，本发明还提供了一种含有上述轻链或上述重链的单克隆抗体、人工载体、药物或药物组合物
其中，本发明还提供了一种含有上述轻链或上述重链的检测试剂或试剂盒。
其中，所述抗PD-1的单克隆抗体包含全长抗体和抗PD-1单克隆抗体的片段，所述片段包含但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或ScFv。
其中，所述全长抗体是全人源的。
其中，所述抗PD-1的单克隆抗体的重链恒定区包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；所述轻链恒定区包含Cκ或Cλ。
优选地：所述恒定区为IgG4。
优选地，所述轻链恒定区为Cκ。
其中，所述CDR为互补决定区(complementarity-determiningregion)；所述ScFv为单链抗体(single-chainfragmentvariable)；所述ADCs为抗体药物偶联物(antibody-drugconjugates)；所述CAR-T为嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy)；所述HEK293E细胞为人胚肾293E细胞(humanembryonickidney293Ecell)；CHO细胞为中国仓鼠卵巢细胞(chinesehamsterovarycell)；NS0细胞为小鼠NS0胸腺瘤细胞。
本发明相对于现有技术而言，具备的有益效果是：
本发明提供的单克隆抗体可以通过消除、抑制PD-1活性来预防或治疗疾病，其中所述疾病选自癌症、感染性疾病或免疫系统疾病。所述癌症包括但不限于肺癌、肾癌、黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、头颈癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、卵巢癌、骨癌、结直肠癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、霍奇金淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性或急性白血病、实体瘤。所述感染性疾病包括不限于HIV病毒感染、肝炎病毒(A型、B型和C型)感染、疱疹病毒感染、流感病毒感染。所述免疫系统疾病包括不限于红斑狼疮、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、重症肌无力、多发性硬化症、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、硬皮病、结节性多动脉炎、Wegener肉芽肿病。
说明书附图
图1、pScFvDisb-s质粒图谱；
图2、轻链突变库构建中以DFPD1-1为模板扩增的重链及linker区电泳图；
图3、轻链突变库构建中以合成的轻链突变库为模板扩增的轻链库基因电泳图；
图4、轻链突变库构建中通过扩增获得的VLCDR123M-DFPD1-1突变库的电泳图；
图5、轻链突变库构建中通过NcoI-HF和NotI对质粒pScFvDisb-s进行双酶切的酶切产物的电泳图；
图6、单克隆phageELISA鉴定phage-Abs的相对亲和力；
图7、梯度稀释phageELISA鉴定phage-Abs的相对亲和力；
图8、重链突变库构建中以合成的重链突变库为模板扩增的重链库基因的电泳图；
图9、重链突变库构建中以DFPD1-3和DFPD1-7质粒为模板扩增的轻链及linker区的电泳图；
图10、重链突变库构建中通过扩增获得的VHCDR123M-DFPD1-3突变库的电泳图；
图11、重链突变库构建中通过扩增获得的VHCDR123M-DFPD1-7突变库的电泳图；
图12、单克隆phageELISA鉴定phage-Abs的相对亲和力；
图13、梯度稀释phageELISA鉴定phage-Abs的相对亲和力；
图14、pTSE质粒载体图；
图15、全抗体与PD-1在分子水平上结合试验；
图16、全抗体与PD-L1的竞争抑制试验；
图17、全抗体与细胞表面的PD-1结合试验；
具体实施方式
本发明详细的实施方法参见实施例，实施例中所述的实验方法和试剂，若无特殊说明均为常规实验方法和试剂。以下实施例仅用于说明和解释本发明，而不是以任何方式限制本发明。
本发明提供了一种特异性结合PD-1的单克隆抗体，所述重链可变区序列包含SEQNO.1、2、3、4,所述轻链可变区序列包含SEQNO.5、6、7、8、9、10、11。
优选地，所述特异性结合PD-1的单克隆抗体的重链可变区序列包含SEQNO.2、3、4，所述轻链可变区序列选自SEQNO.7、11。
通过轻链噬菌体库筛选，所述抗体轻链或其功能性片段的轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列选自以下各氨基酸序列中的一组(如表1所示)。
表1、轻链各个CDR区的氨基酸序列
NO LCDR1 LCDR2 LCDR3 A RASQNIHSYLD EASTRAS QQALKLPIT B RASQNVSNWLD DASNRAT QQSRHIPLT C RASQSIHNYLD NASTRAT QQELHLPLT D RASQDINNWLD DASTLAT QQNVNLPLT E RASQDVRTYLD GASTRAT QQDIDLPLT F RASQGINSWLD DASTRAT QQSYRLPLT G RASQSVSNYLD DASTRAT QQNMQLPLT
通过重链噬菌体库筛选，所述抗体重链或其功能性片段重链的互补决定区CDR1，CDR2和CDR3分别用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示：HCDR1为SNNGMH或SNYGMH；HCDR2为VIWYDGSKK、VIWYDSSRK或VIWYDSTKK中的任一种；HCDR3为TAVYYCATNNDYW或TAVYYCATNTDYW。
优选地，通过重链噬菌体库筛选，所述特异性结合PD-1的单克隆抗体包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区及含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区。其中,所述重链可变区HCDR1序列为选自SNNGMH、SNYGMH的氨基酸；所述轻链可变区LCDR1序列为选自RASQSIHNYLD、RASQSVSNYLD的氨基酸；所述重链可变区HCDR2序列为选自VIWYDGSKK、VIWYDSSRK的氨基酸；所述轻链可变区LCDR2序列为选自NASTRAT、DASTRAT的氨基酸；所述重链可变区HCDR3序列为选自TAVYYCATNNDYW、TAVYYCATNTDYW的氨基酸；所述轻链可变区LCDR3序列为选自QQELHLPLT、QQNMQLPLT的氨基酸。
本发明利用全合成ScFv单链噬菌抗体库获得特异性抗体的方法，所述全人源的特异性结合PD-1的单克隆抗体是利用噬菌体抗体库技术筛选而得，其步骤在于：
(1)、抗PD-1单链抗体的生物淘选，通过三轮抗体库的富集筛选，获得了一种亲和力较高的抗体序列DFPD1-1。
(2)、以DFPD1-1为基础，通过计算机辅助设计，构建轻链CDR1、2、3突变库并对该抗体库进行生物淘选和阳性克隆的筛选及鉴定，获得了6种不同轻链的抗体序列DFPD1-2、DFPD1-3、DFPD1-4、DFPD1-5、DFPD1-6、DFPD1-7。将上述7种单链抗体在噬菌体水平进行亲和力比较。
(3)、选出两株亲和力较高的克隆DFPD1-3和DFPD1-7，构建重链CDR1、2、3库并对该库进行生物淘选和阳性克隆的筛选，获得了五种不同序列的单链抗体DFPD1-9，DFPD1-10，DFPD1-11，DFPD1-12，DFPD1-13。将上述单链抗体在噬菌体水平上进行亲和力比较。
(4)、将(3)中所述单克隆重链可变区基因和轻链可变基因及轻重链恒定区基因克隆到真核表达载体，转染宿主细胞，获得单克隆抗体的全抗，再进行亲和力和其他生物学功能比较。
具体实施例：
以下结合附图和实施例详述本发明。
实施例1、抗PD-1单链抗体的生物淘选
采用一系列基因克隆的方法对载体pCom3载体(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心)进行改造，使之用于噬菌体单链抗体库的构建和表达。改造后的载体命名为pScFvDisb-s，其质粒图谱如图1所示，并以此载体为基础，构建全合成噬菌体抗体库。
以PD-1-His为抗原包被免疫管，抗原包被量为5ug/500ul/管，4℃包被过夜。再用4％脱脂奶粉/PBST分别封闭免疫管和全合成噬菌体抗体库，室温封闭1h。封闭后的噬菌体抗体库加入免疫管中进行抗原抗体结合，噬菌体投入量约为109-1012个，室温反应1h。PBST-PBS洗去未结合的噬菌体，0.1MPH2.2的Glycine-HCl洗脱，用1.5MPH8.8的Tris-HCl中和洗脱下来的噬菌体抗体溶液至PH7.0左右。
将上述中和后的噬菌体感染10ml生长至对数期的TG1菌液，37℃培养箱中静置30min，取出部分菌液进行梯度稀释，涂布于2YTAG平板上，用于计算噬菌体产出量。剩余的菌液离心弃上清，将菌体沉淀重悬于少量培养基，吸出后涂布于2YTAG大平板，为下一轮筛选做准备。
将上述感染后涂板的菌体从大平板上刮下，接菌至2YTAG液体培养基，摇至对数期后加入M13辅助噬菌体超感染，28℃培养过夜扩增噬菌体，PEG/NaCl沉降纯化噬菌体用于下一轮筛选。共进行三轮噬菌体库富集筛选。
实施例2、抗PD-1噬菌体单链抗体阳性克隆的筛选
经过三轮筛选后，挑取分隔良好的单克隆菌落，接种于加有2YTAG液体培养基的96孔深孔板，37℃，220rpm培养至其对数生长期，每孔加入约1010的辅助噬菌体M13KO7，37℃静止感染30min。4000rpm，离心15min，弃去上清，菌体用2YTAK重悬沉淀，28℃，220rpm培养过夜。4000rpm，4℃离心15min，吸取扩增后的噬菌体上清进行ELISA鉴定。筛选得到亲和力较高的单链抗体DFPD1-1，其重链可变区命名为DFPD1-H1,其氨基酸序列见SEQNO.1；其轻链可变区命名为DFPD1-L1,氨基酸序列见SEQNO.5。
实施例3、对筛选出的抗PD-1单链抗体DFPD1-1进行体外亲和力成熟
3.1.DFPD1-1轻链CDR1、2、3突变库的构建
设计引物PVLF1和PVLR1以合成的轻链突变库(SEQNO.12)为模板，PCR扩增轻链库基因(图3)；设计引物PVHF1和PVHR1以DFPD1-1质粒为模板扩增其重链及linker区(图2)。反应条件：95℃30s，1cycle；95℃15s，60℃10s，72℃30s,3cycles；95℃15s，72℃40s,25cycles,72℃5min，4℃保存。天根通用回收试剂盒回收PCR目的片段。
引物如下所示：
PVLF1：5’-GATATCCAGATGACCCAGAGC-3’
PVLR1：5’-CTAAGCGGCCGCTTTGATCTCCACTTTGGTGC-3’
PVHF1：5’-CATACCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTG-3’
PVHR1：5’-GCTCTGGGTCATCTGGATATCGGATCCACCACC-3’
将上述两部分PCR反应产物进行OverlapPCR扩增获得DFPD1-1的轻链突变库基因。反应条件：95℃30s，1cycle；95℃15s，72℃30s,4cycle；(加入引物PVHF1和PVLR2),95℃15s，72℃40s,25cycles；72℃5min，4℃保存。天根通用回收试剂盒回收PCR目的片段，对应的PCR产物命名为VLCDR123M-DFPD1-1(图4)。
用NcoI-HF和NotI对质粒pScFvDisb-s进行双酶切，酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳(图5)，切胶回收；用NcoI-HF和NotI分别对VLCDR123M-DFPD1-1PCR产物进行双酶切。PCR酶切产物采用通用回收试剂盒进行回收。回收后的PCR片段与pScFvDisb-s按摩尔比4：1比例经T4DNA连接酶16℃连接4h。将连接产物电击法转化至TG1感受态中。使用SOC培养基37℃培养1h复苏。按比例取菌液，涂平板，计算库容量。其余菌液4000rpm，室温下离心15min。弃上清，沉淀涂布于2YTAG大平板上，37℃倒置培养过夜。
构建抗体库库容大约为108，从上述抗体库中分别随机挑取20个克隆进行序列分析正确率95％，抗体库库容远远超过抗体库的多样性。
3.2.噬菌体抗体库的生物淘选和阳性克隆的筛选
在按照实施例1的方法进行筛选，得到亲和力较高的克隆测序，共得到6种不同的单链抗体序列，分别命名为DFPD1-2、DFPD1-3、DFPD1-4、DFPD1-5、DFPD1-6、DFPD1-7，对应的轻链可变区命名为DFPD1-L2、DFPD1-L3、DFPD1-L4、DFPD1-L5、DFPD1-L6、DFPD1-L7，它们对应的氨基酸序列分别见SEQNO.6、SEQNO.7、SEQNO.8、SEQNO.9、SEQNO.10和SEQNO.11。单克隆phageELISA鉴定phage-Abs的相对亲和力如图3所示。
3.3.梯度稀释phageELISA鉴定抗PD1单链抗体的亲和力
将本实施例2中获得的克隆进行单克隆phage的展示和纯化，进行phage梯度稀释ELISA实验鉴定phage-Abs的亲和力。
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被PD1-His，4℃包被过夜。PBST洗涤三次，4％milk-PBST37℃封闭1h。将纯化后的phage用4％milk-PBST三倍稀释，每孔加入100ul稀释后的样品，室温静置1h。用PBST洗涤ELISA板，将4％脱脂奶粉稀释后的anti-M13-HRP单克隆抗体加入ELISA板中，室温放置1h。TMB显色试剂盒显色，室温显色5min。用2MH2SO4终止显色，50μl/孔。酶标仪450nm单波长测定光密度值。结果显示筛选出的几株不同的噬菌体抗体均能与PD-1进行结合，而且DFPD1-3，DFPD1-7的亲和力明显高于其它克隆(图4)，选取DFPD1-3和DFPD1-7进行下一步试验。
实施例4、对筛选出的抗PD-1的单链抗体DFPD1-3，DFPD1-7再次进行体外亲和力成熟
4.1DFPD1-3和DFPD1-7重链CDR1、2、3突变库的构建
设计引物PVHF2和PVHR2以合成的重链突变库(SEQNO.13)为模板，PCR扩增重链库基因(图8)；设计引物PVLF2和PVLR2以DFPD1-3和DFPD1-7质粒为模板分别扩增其轻链及linker区(图9)，其中，左侧为DFPD1-3，右侧为DFPD1-7。反应条件：95℃30s，1cycle；95℃15s，60℃10s，72℃30s,3cycles；95℃15s，72℃40s,25cycles；72℃5min，4℃保存。天根通用回收试剂盒回收PCR目的片段。
引物如下所示：
PVHF2：‘5CATACCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTG3’
PVHR2：‘5TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCCCTG3’
PVLF2：‘5CTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTAGC3’
PVLR2：‘5CTAAGCGGCCGCTTTGATCTCCACTTTGGTGC3’
将上述两部分PCR反应产物进行OverlapPCR扩增获得DFPD1-3和DFPD1-7的重链突变库基因。反应条件：95℃30s，1cycle；95℃15s，72℃30s,4cycles；(加入引物PVHF2和PVLR2)，95℃15s，72℃40s,25cycles；72℃5min，4℃保存。天根通用回收试剂盒回收PCR目的片段，将对应的产物命名为VHCDR123M-DFPD1-3(图10)和VHCDR123M-DFPD1-7(图11)。
用NcoI-HF和NotI对质粒pScFvDisb-s进行双酶切，酶切产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳(图5)，切胶回收；用NcoI-HF和NotI分别对VHCDR123M-DFPD1-3和VHCDR123M-DFPD1-7PCR产物进行双酶切。PCR酶切产物采用天根通用回收试剂盒进行回收。回收后的PCR片段与pScFvDisb-s按摩尔比4：1比例经T4DNA连接酶16℃连接4h。将连接产物电击法转化至TG1感受态中。使用SOC培养基37℃培养1h复苏。按比例取菌液，涂平板，计算库容量。其余菌液4000rpm，室温下离心15min。弃上清，沉淀涂布于2YTAG大平板上，37℃倒置培养过夜。
构建了2个不同的抗体库。每个抗体库库容大约为107，抗体库库容远远超过抗体库的多样性。从上述抗体库中分别随机挑取20个克隆进行序列分析，正确率为90％。
4.2噬菌体抗体库的生物淘选和阳性克隆的筛选
将上述构建的两种抗体库，进行phage展示，纯化和沉淀。然后从该库中淘选抗PD1的单链抗体。噬菌体抗体库的生物淘选方法同实施案例1。抗PD-1的单链抗体阳性克隆的筛选的方法同实施案例2。结果发现共筛选到5种不同的抗PD-1抗体序列，分别命名为DFPD1-9，DFPD1-10，DFPD1-11，DFPD1-12，DFPD1-13。其中DFPD1-9，DFPD1-11和DFPD1-12的轻链可变区序列是DFPD1-L3，而DFPD1-10和DFPD1-13的轻链可变区序列是DFPD1-L7；DFPD1-9和DFPD1-10的重链可变区序列是DFPD1-H2，DFPD1-11和DFPD1-13的重链可变区是DFPD1-H3，DFPD1-12的重链可变区是DFPD1-H4。单克隆phageELISA鉴定phage-Abs的相对亲和力如图12所示。
4.3.梯度稀释phageELISA鉴定抗PD1单链抗体的亲和力
将本实施例4.2中获得的克隆进行单克隆phage的展示和纯化，进行phage梯度稀释ELISA实验鉴定phage-abs的亲和力，方法同实施例3中3.1。结果显示筛选出的几株不同的噬菌体抗体均能与PD1进行结合，亲和力相差不是很大(图13)，其中DFPD1-9，DFPD1-10，DFPD1-11，DFPD1-12，DFPD1-13略好，选择这几种单链抗体进行后面试验。
实施例5、抗PD-1全抗体DFPD1-9、DFPD1-10、DFPD1-11、DFPD1-12、DFPD1-13亲和力鉴定
5.1抗PD-1全抗体的制备
将上述抗体的重链VH和轻链VK基因分别克隆至装有重链和轻链恒定区基因的载体pTSE(图14)，编码人恒定区γ4(见SEQNO.14)和κ链(见SEQNO.15)的pTSE载体中(pTSE载体结构如图14所示，制备过程参见CN103525868A说明书第3页第[0019]段)。瞬时转染HEK293E细胞，进行全抗体表达。使用AKTA仪器proteinA亲和柱纯化获得全抗体蛋白。
5.2BIAcoreX100测定全抗体的亲和力
采用捕获法测定全抗体的亲和力。将抗人IgG偶联到CM5芯片表面，分别稀释DFPD1-9，DFPD1-10，DFPD1-11，DFPD1-12和DFPD1-13保证大约300RU左右的抗体被抗人IgG捕获。将PD-1设置一系列的浓度梯度(1000nM，500nM，250nM，125nM，62.5nM，31.25nM，15.625nM，7.8125nM，3.9063nM,1.9531nM，0.9766nM)流经固定相表面，测定抗体的亲和力。结果发现筛出的抗体的亲和力相差不是太大(表3)。
表3、抗PD1全抗体亲和力常数测定数值
Sample ka(1/Ms) kd(1/s) KD DFPD1-9 1.626E+4 1.045E-4 6.429E-9 DFPD1-10 3.285E+4 1.300E-4 3.957E-9 DF-PD1-11 9.357E+3 1.015E-4 1.085E-8 DF-PD1-12 1.327E+4 2.975E-4 2.242E-8 DF-PD1-13 1.811E+4 1.079E-4 9.504E-9
5.3全抗体与PD-1的结合实验
用pH9.6的碳酸盐缓冲液包被PD-1-His，60ng/孔/100μl，4℃过夜包被。用300μl/孔PBST洗五次，再加入1％BSA-PBS在37℃封闭2h。加入不同稀释度的全抗DFPD1-9，DFPD1-10，DFPD1-11，DFPD1-12和DFPD1-13。五种全抗体最高浓度是16ug/ml，4倍稀释做11个梯度，最后一个孔作为阴性对照——即只加稀释液PBS，37℃孵育1h。用300μl/孔PBST洗五次，再加入用1％BSA-PBS1:40000稀释的Anti-HumanFc-HRP二抗37℃孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色8min，然后用2MH2SO4终止显色，50μl/孔。450nm/630nm读数。实验结果如图15所示，所有抗体均能很好的与PD-1分子结合。
5.4全抗体竞争抑制PD-L1与PD-1结合
用pH9.6的碳酸盐包被PDL1-Fc，4℃包被过夜。PBST洗涤五次，1％BSA-PBS37℃封闭2h。用4μg/ml的PD1-His分别稀释DFPD1-9，DFPD1-10，DFPD1-11，DFPD1-12和DFPD1-13这五种全抗体，全抗体与PD-1的摩尔比从10：1开始，五倍梯度稀释，每个样品做9个稀释度，37℃孵育1h。PBST洗五次，加入用1％BSA-PBS稀释的HRP标记的小鼠抗His抗体，37℃孵育1h。TMB显色试剂盒显色，100μl/孔，室温显色8min。用10％H2SO4终止显色，50μl/孔。450nm/630nm读数。结果如图16所示，DFPD1-9，DFPD1-10，DFPD1-11，DFPD1-12和DFPD1-13均能抑制PD-1与PD-L1的结合(结果见图16)。
实例6、抗PD-1抗体与细胞表面PD-1结合试验
先构建过表达的PD-1的CHO稳定细胞系，将它命名为PD1-CHO。用明胶包被96孔板后，PD1-CHO细胞胰酶消化后中止，离心重悬，稀释至2×105细胞/ml，每孔100ul铺于96孔板中，共12孔×6排，即2×104细胞/孔，5％CO2，37℃培养过夜。第二天弃去培养基，用350ul预冷的PBS洗一遍，2％新鲜配制的PFA固定5min，PBS洗2遍。
细胞板中加入倍比稀释好的抗PD-1全抗，稀释液为含0.5％BSA的PBS。样品浓度从100ug/ml起，8倍稀释，共12稀释度，室温孵育30min。然后弃去上清，350ulPBS洗3遍后，加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记羊抗人二抗,室温孵育15min。
再用350ulPBS洗3遍，每孔加入100ulTMB显色液，室温显色15-30min。每孔加入50ul2MH2SO4中止显色，酶标仪450nm读数。用Graphpadprism软件处理结果，计算结合常数(见图17)。
对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。