一个调控果实成熟和品质的基因及其编码产物与应用 [技术领域]
本发明涉及香蕉谷氨酸脱羧酶基因(glutamate decarboxylase gene，MaGAD1)序列的获得、表达分析和体外调控基因表达调节香蕉果实成熟和品质。
[背景技术]
谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase，GAD)广泛存在于原核和真核生物中，是一个胞内酶，主要存在于细胞质中，与磷酸吡哆醛辅因子结合催化谷氨酸转化为GABA和CO2。在植物中GAD的C末端具有一个特殊的与钙调蛋白(CaM)结合的区域，能够与CaM结合增加酶活力(Chen et al.1994)。植物在应对许多不同的刺激时，比如，机械损伤、冷刺激、热刺激、组织缺氧、植物激素刺激等，GAD被细胞内的H+或Ca2+水平的增加而激活，GABA会大量积累。GABA积累在PH调控、N储存、植物发育、果实成熟、植物防御等生理过程中起着重要作用(Bown et al.1997；Gallegoet al.1995)。
GAD基因已经在拟南芥、矮牵牛、水稻、番茄、烟草等植物中被克隆，结果表明该基因可能是多基因家族编码的，并且普遍存在于植物各组织中，其表达变化在植物发育、外界刺激及果实成熟等不同的生理过程中呈现出表达差异。GAD基因的表达与果实成熟及乙烯生物合成也有关系，Kathiresan等(Kathiresan 1997)研究了向日葵中GAD与乙烯产生的关系，外源GABA处理向日葵子叶12小时，导致乙烯产生率增加了14倍。其调控过程是，外源GABA促进了内源GABA的合成，从而促进了ACC合成酶mRNA和ACC含量的积累，以及ACC氧化酶mRNA和体外ACC氧化酶活力的增加，并证明了GABA并不是乙烯生物合成的前体，即GABA可能并不是通过代谢途径参与乙烯生物合成。推测外源GABA促进内源GABA合成的可能过程是：GABA首先促进了GAD基因的表达，增加了GAD酶活性，从而促进了内源GABA的合成。GABA促进乙烯生物合成主要是通过诱导ACC合成酶转录的增强。Gallego等(Gallego et al.1995)从番茄果实cDNA文库中获得一个GAD cDNA全长，组织特异性表达分析表明，该基因在根、茎、叶等组织中表达量非常低，在果实中表达量较高。果实采后成熟不同阶段表达分析表明该基因在正常成熟和rin突变体中表达量都在采后果实第一次发生颜色变化时最高；正常成熟果实中该基因在表达量达到峰值后立即下降，而rin突变体中该基因表达一直维持在较高水平。我们(Jinet al.2008)利用cDNA微阵列和RT-PCR分析研究香蕉采后乙烯生物合成启动时(采后10d)基因的差异表达，表明香蕉谷氨酸脱羧酶基因明显上调表达，是16个上调表达基因中表达量最大的一个。总结上述研究结果：在乙烯生物合成及果实成熟过程中，GAD催化谷氨酸转化为GABA，GABA可能通过代谢途径参与有机酸的降解，PH调控，N的代谢从而导致成熟相关的生理变化；GABA也可能作为信号分子调控果实成熟过程中乙烯生物合成。因此，GAD基因的开发利用，将有助于更加深入了解香蕉果实采后成熟机理，建立更加安全廉价的果实采后保鲜新方法。
[发明内容]
为了深入研究香蕉果实采后成熟机理，建立安全廉价有效果实保鲜新技术，提高果实的商品价值，分离与果实成熟相关基因并鉴定它们的功能十分必要，通过对这类基因功能研究及调控，将对提高果实采后品质，培育耐储藏新品种具有重要意义。
本发明提供的技术方案为：构建香蕉果实采后0天、2天抑制缩减文库，获得一个与GAD基因同源性较高的差异表达谷氨酸脱羧酶同源的cDNA序列，RACE技术扩增该基因全长序列(MaGAD1)。荧光定量PCR方法研究在正常成熟、乙烯诱导成熟和1-MCP(1-methyl cyclopropene)抑制成熟的条件下，MaGAD1在香蕉果实采后不同成熟阶段的表达情况。通过体外诱导、抑制MaGAD1的表达，研究果实成熟特性及品质。
1.香蕉果实采后2天抑制差减文库构建及分析：
采用热硼酸法法提取香蕉采后0天和2天果实总RNA，电泳检测RNA质量，质量检测完毕后贮于-76℃备用。按照Clontech公司的PCR-SelectTM cDNA SubstractionKit，Advantage 2 PCR Kit产品使用说明进行缩减杂交。抑制缩减杂交产物经与pGEM-T Easy Vecter连接，转化E.coli DH5α，构建抑制差减文库。获得文库独立克隆测序、分析。
2.香蕉谷氨酸脱羧酶基因全长序列克隆：
根据SSH获得的基因片段和NCBI的比对结果可知，该基因片段3’端已经含有TAA终止密码子。用Primer Premier 5设计一条5′-RACE引物，以本研究室构建的香蕉果实cDNA文库为模板，PCR扩增5’端序列。将扩增序列与已有的3’端序列拼接获得基因的全长序列。
3.荧光定量研究MaGAD1与果实采后成熟的关系：
采后香蕉果实分设乙烯处理、1-MCP处理和正常成熟3组，提取3组中不同成熟阶段的果实总RNA反转录cDNA，荧光定量研究3中不同处理条件下MaGAD1表达与成熟的关系。
4.MaGAD1诱导剂γ-氨基丁酸(GABA)和抑制剂氨氧乙酸(AOAA)处理果实，研究体外调控基因表达对果实成熟和品质的影响：
将采后的香蕉果实按照一定浓度用γ-氨基丁酸(GABA)和氨氧乙酸(AOAA)分别处理，观察处理果实成熟变化，测定果实成熟相关的生理指标，分析通过采后体外调控MaGAD1的表达对果实成熟和品质的影响。
[结果分析]
1.成功构建香蕉果实采后0天和2天的抑制缩减文库：用差减PCR产物，以T/A克隆法构建质粒载体文库，差减文库包括312个白色克隆，克隆饱满清晰。应用PCR方法对差减文库的312个克隆进行筛选，获得302个重组子，插入片段集中在300bp-500bp之间，符合抑制缩减文库的要求。
2.成功克隆香蕉谷氨酸脱羧酶基因全长序列：对获得的抑制缩减文库中302个重组测序分析，有2个与其他生物子谷氨酸脱羧酶基因具有较高同源性，进一步分析显示这两个香蕉谷氨酸脱羧酶基因片段属于同一个基因。根据获得的香蕉谷氨酸脱羧酶基因片段设计5’端PCR引物，克隆5’端序列，与原有序列拼接后利用生物信息学软件分析，具有完整的阅读框架，为一个完整基因命名为MaGAD1，包含一个1500bp的完整开放阅读框(序列1)，编码499个氨基酸残基的多肽(序列2)。与水稻(NM_001068533)、大麦(AK248209)、拟南芥(NM_121739)和玉米(AY103733)有较高的一致性，分别为82％、80％、80％、78％。GenBank查找未见报道。
3.MaGAD1在香蕉果实采后被乙烯诱导表达，并可调节成熟乙烯生物合成：在正常成熟和乙烯诱导成熟的条件下，MaGAD1在成熟乙烯生物合成启动时被显著诱导，其表达量快速达到最大值，并诱导了随后乙烯的大量增加使其达到峰值；在1-MCP抑制成熟条件下，内源乙烯地释放量和MaGAD1的相对表达量在香蕉采后储藏时期一直维持在较低的水平(图1)。所以，MaGAD1的表达既受乙烯诱导又促进乙烯的生物合成，与香蕉果实采后乙烯生物合成及果实成熟密切相关。
4.MaGAD1诱导剂和抑制剂显著促进和抑制该基因的表达，进而影响果实的成熟过程和品质：研究结果证明，GABA和AOAA分别能诱导和抑制香蕉果实成熟，通过生理学分析显示这种影响改变了果实颜色、硬度、芳香物质、可溶性总糖和淀粉含量等。证实对MaGAD1表达的调控可以调节果实品质(图2、图3)。进一步研究显示，MaGAD1调控果实成熟是通过调控MaACS1基因的表达来实现的，而MaACS1是香蕉果实采后成熟过程中启动成熟乙烯生物合成的关键酶基因。因此，我们推测香蕉MaGAD1是香蕉果实采后成熟过程中成熟乙烯生物合成的上游调节者，它通过调控MaACS1的表达控制果实的成熟过程和品质形成。
附图说明：
图1：1-MCP处理和乙烯处理条件下，利用荧光定量PCR分析MaGAD1在香蕉采后不同时期的表达。
图2：GABA和AOAA处理对香蕉果实采后成熟的影响
图3：GABA和AOAA处理对采后香蕉果实硬度、淀粉、可溶性总糖的影响。
[具体实施方式]
下面结合实施方式对本发明进行详细说明：
1、材料来源：巴西香蕉(M.AAA Group Cavendish)果实，采自中国热带农业科学院热带生物技术研究所实验基地。
2、方法：
(1)香蕉果实采后2天抑制差减文库构建及分析：参照Ching-Yi Wan和Thea A.Wilkins(1994)的热硼酸法提取香蕉果实RNA。按照PCR-SelectTM cDNA SubstractionKit，Advantage 2 PCR Kit产品使用说明进行0天和2天果实RNA抑制缩减杂交。抑制缩减杂交产物经与pGEM-T Easy Vecter连接，转化E.coli DH5α。采用PCR的方法对重组子进行鉴定，PCR鉴定采用试剂盒提供的引物：
Nested PCR引物1：5’-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’
Nested PCR引物2R：5’-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3’
以待测质粒为模板，在Biometra型PCR仪上进行PCR反应。反应条件为94℃变性5.0分钟；94℃45秒，68℃1.0分钟，72℃1.0分钟，扩增35个循环；72℃延伸7.0分钟。然后取5.0μl PCR反应液进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，5v/cm恒压条件下电泳30分钟后，于紫外灯下观察重组子插入片段大小。将插入有目的片段的重组子测序、分析。
(2)香蕉谷氨酸脱羧酶基因全长序列克隆：根据SSH获得的基因片段和NCBI的比对结果可知，该基因片段3’端已经已含有TAA终止密码子。用Primer Premier 5设计一条5′-RACE引物：
5’-TATGCGAACCCGAAACTCCCAAAG-3’，交由上海生物工程有限公司合成。以我研究室构建的香蕉果实cDNA文库为模板，PCR另一个引物为cDNA文库的接头引物：ptr5’：5’-CTCCGAGATCTGGACGAGC-3’；。在0.2mL离心管中依次加入：
cDNA文库库液 1.0μL
10×Buffer(含2.5mM Mg2+) 2.5μL
dNTP(dA/G/C/TTP：10mMeach) 0.5μL
ptr5’(10pM) 1.0μL
BR1695’-RACE(10pM) 1.0μL
Taq聚合酶(5u/μL) 0.3μL
ddH2O 18.7μL
总体积 25.0μL
以下列PCR反应条件进行PCR反应：
结果扩增到一段1042bp，含有ATG起始密码子。根据抑制缩减文库中序列及5′-RACE所获得的序列序列拼接后设计2条引物从香蕉果实cDNA文库中克隆该基因cDNA全长。PCR及测序结果显示，该基因cDNA ORF为1500bp。
(3)荧光定量研究MaGAD1与果实采后成熟的关系：
提取乙烯处理、1-MCP处理和采后正常成熟香蕉不同成熟期的果实总RNA反转录cDNA用作荧光定量PCR的模板。
用NCBI的保守结构域分析软件分析MaGAD1、Ma-actin12个基因的保守结构，确保所设计引物的扩增片段位于非保守区；然后根据荧光定量PCR的引物设计原则，用primer premier 5设计引物。
MaGAD1上游引物：5’-GTCGTCCCCAAGAAGAGCGTCAA-3’；
MaGAD1下游引物：5’ATCGCCAAACCATAACTAAACCACA-3’。
Ma-actin1上游引物：5′-CGAGGCTCAATCAAAGA-3′
Ma-actin1下游引物：5′-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3′
在Stratagene的Mx3000P仪器上进行荧光定量PCR。在0.2mL的PCR反应管中加入SYBR Premix Ex Taq(2×)(TAKARA)12.5μL、Rox reference Dye II(50×)(TAKARA)0.5μL、5μM的一对引物各0.75μL，cDNA样品1μL，然后用水补足至25μL。每个样品既要用于扩增目的基因又要扩增内参基因Ma-actin1，各个基因的扩增都做三个重复。按照94℃预变性3min，94℃变性7s，55℃退火15s，72℃延伸20s，共40个循环的反应程序进行扩增(四个基因的反应程序是一致的)，并于每个循环的延伸阶段采集荧光信号。反应结束后做94℃-55℃的融解曲线分析。
荧光定量PCR结果证明，MaGAD1表达受乙烯诱导、1-MCP抑制，在香蕉果实采后成熟过程中起着调控乙烯生物合成、果实成熟的作用。
(4)MaGAD1诱导剂GABA和抑制剂AOAA处理果实对成熟期和品质的影响：将采收的果实切割成单蕉指，用0.1％次氯酸钠进行表面消毒10min，同时把果实顶部的干花抹掉，放置一个晚上晾干，随机选取成熟度较为一致的香蕉果实分成3个处理：正常成熟、GABA处理、AOAA处理。每个处理选取30-40个果实，每3个果实装进一个保鲜盒中。正常成熟的果实置于22℃恒温条件下成熟。
观察不同处理对香蕉果实采后成熟时期的影响，测定不同处理条件下香蕉果实硬度、可溶性总糖。果实淀粉含量。结果显示GABA处理明显能缩短达到每个成熟度的时间，促进成熟；AOAA处理明显能延长达到每个成熟度的时间，延缓成熟。并通过调控采后香蕉果实成熟度、硬度、可溶性总糖和淀粉含量等生理变化调控果实成熟过程。
SEQUENCE LISTING
<110>中国热带农业科学院热带生物技术研究所农业部热带作物生物技术重点开放实验室中国热带农业科学院海口实验站
金，志强
徐，碧玉
胡，伟
刘，菊华
张，建斌
贾，彩红
谭，光兰
<120>一个调控果实成熟和品质的基因及其编码产物与应用
<160>2
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>1500
<212>DNA
<213>香蕉(Musa acuminata)
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atgactctct cggcggtagc atcggatgcc gatgattcgg tcgcttatac attcgcttcg 60
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gcggcgtacc agatcatcaa cgacgagctg atgctcgacg ggaacccgcg gttgaatctg 180
gcgtcgttcg tgacgacgtg gatggagccg gagtgcgatc gcctcatcat ggcggccgtc 240
aacaagaact acgtcgacat ggacgagtac cccgtcacca ccgagctcca gaatcgctgc 300
gtaaatatga tagcccacct tttcaatgcc ccaattgggg aagacgaaac ggctgttgga 360
gttggaaotg tgggttcctc agaagcaatc atgcttgcag gacttgcatt caagaggaaa 420
tggcagaaca aaagaaaggc agaggagaag ccttacgaca aacccaacat tgttaccggt 480
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<212>PRT
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<220>
<221>PRT
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Met Thr Leu Ser Ala Val Ala Ser Asp Ala Asp Asp Ser Val Ala Tyr
1 5 10 15
Thr Phe Ala Ser Arg Tyr Val Arg Glu Ala Leu Pro Arg Phe Arg Ile
20 25 30
Pro Glu Gln Ser Ile Pro Lys Asp Ala Ala Tyr Gln Ile Ile Asn Asp
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100 105 110
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145 150 155 160
Ala Asn Val Gln Val Cys Trp Glu Lys Phe Ala Arg Tyr phe Glu Val
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180 185 190
Ala Lys Ala Val Glu Met Val Asp Glu Asn Thr Ile Cys Val Ala Ala
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Ile Leu Gly Ser Thr Leu Thr Gly Glu Phe Glu Asp Val Lys Leu Leu
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Asn Asp Leu Leu Thr Glu Lys Asn Gln Glu Thr Gly Trp Asp Thr Pro
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