产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株及其构建方法.pdf

产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，涉及一种基因工程菌株及其构建方法。本发明的目的在于提供一种产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，该菌株可以生产CGRP-AcAPc2融合蛋白，该融合蛋白具有治疗高血压和抗血栓双重作用。该基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/AcAPc2基因。方法：一、融合蛋白CGRP/AcAPc2基因的合成；二、重组表达载体构建；三、将重组表达载体转化到大肠杆菌中，提取转化菌质粒DNA，用KpnⅠ单酶切，基因测序，测序结果正确的为阳性重组菌。本发明用于生产具有抗血栓和治疗高血压双重作用的融合蛋白。

1.产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株，其特征在于该基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/AcAPc2基因；其中所述融合蛋白CGRP/AcAPc2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。 2.如权利要求1所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：一、在CGRP和AcAPc2融合基因内设计一个KpnⅠ酶切位点，合成核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的融合蛋白CGRP/AcAPc2基因，并在融合蛋白CGRP/AcAPc2基因两端分别添加BamHI和EcoRⅠ酶切位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC（CGRP/AcAPc2）载体；二、将步骤一获得的pUC（CGRP/AcAPc2）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切，再与同样经BamHI和EcoRⅠ双酶切的表达载体pGEX-6P-1连接，获得融合蛋白CGRP/AcAPc2基因重组表达载体pGEX-CGRP/AcAPc2；三、然后将载体pGEX-CGRP/AcAPc2转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，随机挑取转化菌37℃过夜培养，采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，用KpnⅠ单酶切，并用空白质粒pGEX-6P-1作为对照，将含有KpnⅠ酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌。 3.根据权利要求2所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中pUC（CGRP/AcAPc2）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切的体系如下：酶切反应条件：37℃水浴，10h。 4.根据权利要求2所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中表达载体pGEX-6P-1双酶切的体系如下：酶切反应条件：37℃水浴，10h。 5.根据权利要求2所述的产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的构建方法，其特征在于步骤二中连接反应体系如下：连接反应条件：16℃水浴，8～12h。

技术领域

本发明涉及一种基因工程菌株及其构建方法。

背景技术

Rosenfeld等于1983年发现降钙素基因相关肽（CGRP）是一种生物活性 肽，它与降钙素（CT）均来源于位于11号染色体的CT/CGRP基因，但是 由于CT/CGRP基因不同的RNA编码而翻译成CGRP和CT，CGRP是应DNA基因 重组和分子生物技术研究发现的一种由37个氨基酸组成的生物活性多 肽，是目前发现的最强的内源性扩血管肽类物质，对神经、心血管、 呼吸、消化、骨骼肌、泌尿、生殖以及免疫等系统具有重要作用。CG RP的舒张冠状血管的作用远强于P物质，心钠素和去甲肾上腺素（NE） ，比乙酰胆碱（Ach）、5-羟色胺（5-HT）等强10000倍左右，比异丙 肾上腺素强10-100倍。

犬钩虫吸血时，其头腺能分泌一种抗凝血活性物质，被称作犬钩虫抗 凝血肽（anticoagulant peptide，AcAPs）。该物质本质是一种蛋白 水解酶，具有延长血浆凝血酶原时间(pt)、抑制血液凝固以及促进纤 维蛋白溶解的作用。目前发现的AcAPs有AcAP5，AcAP6，AcAPc2三种重 组蛋白，其中AcAPc2(10KD)是Xa因子的高效特异抑制剂，其抗血栓效 果明显优于凝血酶抑制剂，AcAPc2作为Xa因子的高效特异抑制剂对血 小板聚集功能影响甚小，用于抗血栓治疗时引发出血的危险性小。19 98年，Donnelly等报道AcAPc2在体内还具有抗肿瘤细胞转移的作用。 AcAPc2的抗凝血、抗血栓作用，使之具有成为临床上一种新的抗凝剂 和抗血栓治疗药物。

然而目前这两种蛋白单独作用，效果单一。

发明内容

本发明的目的在于提供一种产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAP c2融合蛋白基因工程菌株及其构建方法，该菌株可以生产CGRP-AcAPc 2融合蛋白，CGRP-AcAPc2融合蛋白具有抗血栓和治疗高血压双重作用 。

本发明产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程 菌株含有融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因。

所述融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示 。

上述产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌 株的构建方法，按以下步骤进行：

一、在CGRP和AcAPc2融合基因内设计一个KpnⅠ酶切位点，合成核苷酸 序列如SEQ ID  NO：1所示的融合蛋白CGRP/AcAPc2基因，并在融合蛋白CGRP/AcAPc2基 因两端分别添加BamHI和EcoRⅠ酶切位点，然后克隆在pUC57载体上， 获得pUC（CGRP/AcAPc2）载体；

二、将步骤一获得的pUC（CGRP/AcAPc2）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切 ，再与同样经BamHI和EcoRⅠ双酶切的表达载体pGEX-6P-1连接，获得 融合蛋白CGRP/AcAPc2基因重组表达载体pGEX-CGRP/AcAPc2；

三、然后将载体pGEX-CGRP/AcAPc2转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，随 机挑取转化菌37℃过夜培养，采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，用K pnⅠ单酶切，并用空白质粒pGEX-6P-1作为对照，将含有KpnⅠ酶切位 点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌。

本发明的有益效果：本发明基因工程菌株可以生产CGRP-AcAPc2融合蛋 白，降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽AcAPc2之间作用互补且协同增 效，CGRP-AcAPc2融合蛋白具有抗血栓和治疗高血压双重作用。本发明 基因工程菌株生产的融合蛋白的纯度为98%，融合蛋白表达量为38.1% 。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实 施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式产降钙素基因相关肽与犬钩虫抗凝肽Ac APc2融合蛋白基因工程菌株含有融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因。

具体实施方式二：具体实施方式一所述融合蛋白CGRP/ AcAPc2基因的 核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

具体实施方式三：具体实施方式一所述产降钙素基因相关肽与犬钩虫 抗凝肽AcAPc2融合蛋白基因工程菌株的构建方法，按以下步骤进行：

一、在CGRP和AcAPc2融合基因内设计一个KpnⅠ酶切位点，由上海生工 公司合成核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的融合蛋白CGRP/AcAPc2基 因，并在融合蛋白CGRP/AcAPc2基因两端分别添加BamHI和EcoRⅠ酶切 位点，然后克隆在pUC57载体上，获得pUC（CGRP/AcAPc2）载体；

二、将步骤一获得的pUC（CGRP/AcAPc2）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切 ，再与同样经BamHI和EcoRⅠ双酶切的表达载体pGEX-6P-1连接，获得 融合蛋白CGRP/AcAPc2基因重组表达载体pGEX-CGRP/AcAPc2；

三、然后将载体pGEX-CGRP/AcAPc2转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，随 机挑取转化菌37℃过夜培养，采用质粒提取试剂盒（购买自北京艾德 莱生物科技有限公司）提取质粒 DNA，用KpnⅠ单酶切，并用空白质粒pGEX-6P-1作为对照，将含有Kpn Ⅰ酶切位点的质粒进行基因测序，测序结果正确的即为阳性重组菌； 其中大肠杆菌BL21（DE3）为购买得到。

步骤二中pUC（CGRP/AcAPc2）载体用BamHI和EcoRⅠ双酶切的体系如下 ：

成分 用量 pUC（CGRP/AcAPc2）载体 20μL 10×M buffer 6μL BamHI 3μL EcoRⅠ 3μL ddH2O 28μL  

酶切反应条件：37℃水浴，10h。

步骤二中表达载体pGEX-6P-1双酶切的体系如下：

成分 用量 pGEX-6P-1 20μL 10×M buffer 6μL BamHI 3μL EcoRⅠ 3μL ddH2O 28μL  

酶切反应条件：37℃水浴，10h。

步骤二中连接反应体系如下：

成分 用量 目的基因CGRP/AcAPc2 13μL 酶切后pGEX-6P-1载体 3μL T4 DNA连接酶 2μL 10×T4 DNA连接酶buffer 2μL

连接反应条件：16℃水浴，8～12h。所述T4 DNA连接酶，购买自TaK aRa公司。

将本实施方式获得的阳性重组菌置于LB培养基28℃培养15h，然后采用 GST标签融合蛋白方法进行蛋白的分离纯化，获得降钙素基因相关肽与 犬钩虫抗凝肽AcAPc2融合蛋白。本实施方式获得的融合蛋白的纯度为 98%，融合蛋白表达量为38.1%。

由生物工程公司将融合蛋白CGRP/AcAP5基因克隆到pUC57载体上。

为验证本实施方式基因工程菌株所产融合蛋白的效果，进行以下实验 ：

CGRP-AcAPc2融合蛋白抗血栓实验：

取SD大鼠，随机分为11组，每组8只，每组给药剂量如下：阴性对照组 给予同体积的 生理盐水；阳性对照组选用肝素钠注射液，给药剂量为1650 U/kg； CGRP低剂量组给药40μg/kg；CGRP中剂量组给药200μg/kg；CGRP高剂 量组给药1mg/kg；AcAPc2低剂量组给药40μg/kg；AcAPc2中剂量组给 药200μg/kg；AcAPc2高剂量组给药1mg/kg；CGRP-AcAPc2融合蛋白低 剂量组给药40μg/kg；CGRP-AcAPc2融合蛋白中剂量组给药200μg/kg ；CGRP-AcAPc2融合蛋白高剂量组给药1mg/kg。全部由静脉注射给药。 经静脉注射给药后，立即将分离好的颈动脉置于YLS-14B小动物血栓生 成仪的探测接头内，启动血栓生成仪，用恒流直流电刺激(1 mA)。记 录探头通过红外扫描测量血液的流通量并换算出血管堵塞程度（测量 的时间间隔为4 s，以百分数表示数据，全部过程持续5 min）。结 果如表1所示：

表1 CGRP-AcAPc2融合蛋白抗大鼠颈总动脉血栓的效果[n, ]

组别 n 给药剂量 颈总动脉的堵塞程度(%) 阴性对照组 8 0μg/kg 100.00±0.00 阳性对照组 8 1650U/kg 48.46±42.78 CGRP低剂量组 8 40μg/kg 51.10±33.98* CGRP中剂量组 8 200μg/kg 36.03±24.75* CGRP高剂量组 8 1mg/kg 26.39±22.47* AcAPc2低剂量组 8 40μg/kg 46.27±40.54* AcAPc2中剂量组 8 200μg/kg 33.75±39.58* AcAPc2高剂量组 8 1mg/kg 21.49±13.77** CGRP-AcAPc2融合蛋白低剂量组 8 40μg/kg 39.28±42.11* CGRP-AcAPc2融合蛋白中剂量组 8 200μg/kg 25.38±40.73* CGRP-AcAPc2融合蛋白高剂量组 8 1mg/kg 11.89±12.56**

与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01

结果表明：注射AcAPc2蛋白溶液和CGRP-AcAPc2融合蛋白溶液虽然都有 抗血栓的作用，但CGRP-AcAPc2融合蛋白的抗血栓效果最佳，且比单独 注射AcAPc2蛋白溶液的效果有显著提高，说明CGRP和AcAPc2融合可以 增强犬钩虫抗凝肽AcAPc2的作用。

由高血压实验和抗血栓实验结果可知，降钙素基因相关肽（CGRP）和 犬钩虫抗凝肽（AcAPc2）融合可以互相促进，协同增效。

CGRP-AcAPc2融合蛋白治疗大鼠心肌缺血的实验：

取SD大鼠30只，造成心肌缺血模型；大鼠随机分成三组（对照组、实 验A组和实验B组），实验A组按2.5mg/kg·b.w剂量注射CGRP蛋白；实 验B组按2.5mg/kg·b.w剂量注射CGRP-AcAPc2融合蛋白；对照组注射同 等剂量的生理盐水。

实验进行4次，对大鼠心肌进行危险区域、坏死区及坏死区与危险区域 的比值检测，检测结果如表2所示，其中AAR（Area at risk）为危 险区域，IS（Infarct size）为坏死区。

表2 梗死区大小（）

*P<0.05，**P<0.01

结果表明：实验A组和实验B组与对照组相比虽然都有治疗心肌缺血的 作用，但是CGRP-AcAPc2融合蛋白的治疗效果最佳，且比单独注射CGR P蛋白的效果有显著提高，说明AcAPc2和CGRP融合可以增强降钙素基因 相关肽（CGRP）的作用。

由骨质疏松实验和心肌缺血实验结果可知，犬钩虫抗凝血肽（AcAPc2 ）和降钙素基因相关肽（CGRP）融合可以互相促进，协同增效。

CGRP-AcAPc2融合蛋白毒性实验：

哈尔滨医科大学实验动物中心提供 SPF 级昆明小鼠。取60只6周龄 、雌雄各半、体质量为18±2g的小鼠作为实验对象。将小鼠随机分为 2组：实验组和对照组，采用最大耐药量给药（根据临床干扰素用量5 0μg/kg）。实验组注射CGRP-AcAPc2融合蛋白，总剂量 1mg/kg，一 次性给药0.02mL。对照组小鼠注射同等剂量生理盐水。

给药过程中小鼠表现正常，进食、饮水正常、尿粪正常、毛色顺白而 有光泽、活动自如、反应性好、小鼠之间无相互撕咬现象。连续饲养 14天和30天，小鼠均未出现死亡。

CGRP-AcAPc2融合蛋白给药14天、30天后，处死小鼠，摘眼球取血，3 000r/min离心 5 min，吸取血清，用 Beckman 全自动生化分析仪 检测主要生化指标：天冬氨酸转氨酶( AST) 、丙氨酸转氨酶( AL T) 、肌酐( CREA) 、尿素氮( BUN) 、尿酸 ( URCA) 、总胆 红素( TBIL) 、总胆汁酸( TBA) 。血生化指标如表3所示。

表3 血生化指标

CGRP-AcAPc2融合蛋白给药14天、30天后处死小鼠，取心、肝、脾、肺 、肾，观察脏器颜色、形态，计算各脏器系数。根据统计学样本估计 ，在每组中随机抽取7只小鼠，取心、肝、脾、肺、肾 HE 染色做病 理组织学检查；取骨髓组织瑞氏染色观察细胞有无水肿、变性、 坏死等。主要脏器的病理观察结果如表4所示。

表4 脏器病理观察结果

组别 天数 心 肝 脾 肺 肾 对照组 14 3.69±0.84 31.73±3.14 4.68±0.82 2.90±0.81 7.97±0.86 实验组 14 3.68±0.90 30.68±2.86 4.76±0.80 2.90±0.73 7.88±0.92 对照组 30 3.55±0.86 30.54±2.95 4.76±0.79 2.91±0.79 7.94±0.85 实验组 30 3.56±0.88 31.49±3.11 4.59±0.77 2.90±0.85 7.93±0.83

实验组与对照组主要脏器心、肝、脾、肺、肾的 HE 染色及骨髓  Wright 染色对比观察发现：各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾和骨髓 均无水肿、变性、坏死等异常改变。

本实验对心、脾、肺、肾的病理切片和骨髓涂片进行了观察，均未见 明显的损伤性改变。对5种脏器的脏器系数统计学分析得出各组间差异 无显著性。均说明CGRP-AcAPc2融合蛋白及其代谢产物未对脏器产生器 质性损害。血生化指标检测各组间差异性无显著说明CGRP-AcAPc2融合 蛋白对肝脏、肾脏无功能性损害。表明CGRP-AcAPc2融合蛋白具有较好 的生物相容性，对小鼠无急性毒性、长期毒性。

本实施方式获得的CGRP-AcAPc2融合蛋白在降钙素基因相关肽（CGRP） 和犬钩虫抗凝血肽之间插入GlyThr，改变了多肽的二级结构，但不仅 没有使AcAPc2和CGRP丧失生物活性，反而提高了其生物活性。本实施 方式大肠杆菌BL21（DE3-CGRP/AcAPc2）内CGRP-AcAPc2融合蛋白的表 达量也比单一的AcAPc2或CGRP在大肠杆菌中的表达量高。

本实施方式融合蛋白可通过注射或者口服的方式进行给药，不存在首 过效应。

构建本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-CGRP/AcAPc2）时改变了CGRP和犬 钩虫抗凝血肽AcAPc2的二级结构，这种改变没有产生体内毒性，发酵 产生的融合蛋白具有安全性；而且二级结构的改变不影响层析和纯化 ，利用本实施方式大肠杆菌BL21（DE3-CGRP/AcAPc2）发酵CGRP-AcAP c2融合蛋白具有分离纯化容易的特点。

本实施方式中使用的药品、试剂、酶、感受态细胞和质粒等均购买获 得，若无特殊要求则浓度为产品标注浓度。