技术领域
本发明属于分子育种技术领域，涉及罗非鱼性别特异分子标记、基于该分子标记的罗非 鱼遗传性别鉴定方法、以及基于该分子标记生产超雄鱼的方法。
背景技术
罗非鱼又称非洲鲫鱼，原产于非洲大陆及中东大西洋沿岸咸淡水水域中，属硬骨鱼纲鲈 形目丽鱼科，是热带鱼类，具有繁殖力强、生长快、食性广、饲料要求低、耐低氧、适应性 和抗病力强等优点。近几十年来，随着世界各国相继引入罗非鱼，其已成为世界性的主要养 殖鱼类品种之一。目前，我国的罗非鱼养殖品种有莫桑比克罗非鱼、尼罗罗非鱼、奥利亚罗 非鱼等，其中主要是尼罗罗非鱼。中国是罗非鱼第一大生产国和出口国。
由于罗非鱼性周期短，繁殖快，雌性比雄性生长慢，为了避免养殖中罗非鱼过度繁殖， 获得生长快、个体大、规格整齐、产量高的商品鱼，需要进行单雄性罗非鱼生产。目前在生 产上获得单雄性罗非鱼的方法主要有三种：一、性反转方法，即用雄性激素处理鱼苗来获得 全雄鱼，该方法简便易行，但存在激素残留之嫌，不符合无公害健康养殖的要求；二、种间 杂交方法，如尼罗罗非鱼♀×奥利亚罗非鱼♂，该方法无污染，商品鱼性能好，但需要亲本 很纯，获得雄性率一般仅为90-95%，仍有相当数量的雌鱼，还存在一定程度的杂交障碍，繁 殖周期长，繁苗量偏少；三、三系配套法，又称遗传雄性罗非鱼技术（Genetically Male Tilapia, GMT），即将性反转和杂交方法相结合，用原系（XX♀，XY♂）、转化系（XY♀，YY♀） 和雄性纯合系（YY♂）配套来生产遗传全雄罗非鱼。具体方法如下：将性别未分化的幼鱼苗 进行雌性化处理，由子代测试鉴定转化雌鱼（XY♀）；将转化雌鱼（XY♀）与原系雄鱼（XY ♂）交配，由子代测试鉴定YY超雄鱼；将YY超雄鱼与转化雌鱼（XY♀）交配并进行雌性 化处理，由子代测试鉴定YY转化雌鱼；将YY转化雌鱼与YY超雄鱼交配，获得全YY超 雄鱼；将YY超雄鱼与原系雌鱼（XX♀）交配，生产全雄鱼。上述三系制种程序比较复杂， 所需时间也较长，但一旦获得YY超雄鱼和YY转化雌鱼，就可大量获得YY超雄鱼（YY♀ ×YY♂），是一种比较科学的方法。但由于现有技术只能在测交实验后根据测交子代性别比 例来判断亲本的基因型，操作繁琐费时，劳动强度大，严重阻碍了GMT的推广应用，因此， 三系配套法的关键在于，如何快速、有效地区分正常雌鱼XX♀、正常雄鱼XY♂、转化雌鱼 XY♀、转化雌鱼YY♀与超雄鱼YY♂。
随着分子标记技术的发展和成熟，通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记来判断目标 基因是否存在的分子标记辅助选择（Marker-Assisted Selection，MAS）技术已用于罗非鱼的 遗传性别鉴定，其关键在于筛选出罗非鱼性别特异的分子标记。通过筛选罗非鱼基因组中与 性染色体（性别）连锁的雄（雌）性特异性DNA分子标记，借助MAS技术能够大大简化 GMT的生产流程，降低生产成本，提高效益。发明人所在课题组在前期研究中，筛选出了尼 罗罗非鱼Y染色体特异分子标记NtY1和NtY2以及X染色体特异分子标记NtX1，并基于上 述分子标记建立了尼罗罗非鱼的遗传性别鉴定方法（中国专利ZL201010501061.8），还在此 基础上开发了另一尼罗罗非鱼性别特异分子标记（本发明中命名为marker2）。但上述性别特 异分子标记均不够理想，与尼罗罗非鱼性别决定位点的距离略远，只适用于筛选该标记的尼 罗罗非鱼品系，而不能通用于多种品系的尼罗罗非鱼。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种尼罗罗非鱼Y染色体特异分子标记，可以通 用于多种品系的尼罗罗非鱼；目的之二在于提供一种基于上述分子标记进行尼罗罗非鱼遗传 性别鉴定的方法，可以经济、快速、准确地区分正常雌鱼XX♀、正常雄鱼XY♂、转化雌鱼 XY♀、转化雌鱼YY♀与超雄鱼YY♂；目的之三在于提供一种基于上述分子标记快速高效 生产超雄鱼的方法，以通过YY超雄鱼培育路线实现全雄鱼鱼苗的规模化生产，显著提高养 殖产量，降低养殖成本，提高经济效益。
经研究，本发明提供如下技术方案：
1．尼罗罗非鱼Y染色体特异分子标记，其核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。
2．尼罗罗非鱼遗传性别鉴定的分子标记方法，包括以下步骤：
A．PCR扩增：取待测尼罗罗非鱼的鳍条，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模 板，采用SEQ ID No.1所示的上游引物和SEQ ID No.2所示的下游引物，PCR扩增尼罗罗非 鱼性别特异分子标记：X染色体特异分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，Y染色体 特异分子标记的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
B．结果判断：从待测尼罗罗非鱼的基因组DNA中仅扩增出X染色体特异分子标记，判 断该待测尼罗罗非鱼为遗传上的雌鱼，性染色体基因型为XX；从待测尼罗罗非鱼的基因组 DNA中仅扩增出Y染色体特异分子标记，判断该待测尼罗罗非鱼为遗传上的超雄鱼，性染色 体基因型为YY；从待测尼罗罗非鱼的基因组DNA中同时扩增出X染色体特异分子标记和Y 染色体特异分子标记，判断该待测尼罗罗非鱼为遗传上的雄鱼，性染色体基因型为XY。
3．采用尼罗罗非鱼遗传性别鉴定的分子标记方法生产超雄鱼的方法，包括以下步骤：
A．将尼罗罗非鱼雌鱼XX与雄鱼XY的交配后代进行雌性化处理，采用尼罗罗非鱼遗传 性别鉴定的分子标记方法，筛选出性染色体基因型为XY的转化雌鱼；
B．将XY转化雌鱼与尼罗罗非鱼XY雄鱼交配，采用尼罗罗非鱼遗传性别鉴定的分子标 记方法，从后代中筛选出性染色体基因型为YY的超雄鱼；另取XY转化雌鱼与尼罗罗非鱼 XY雄鱼交配后代进行雌性化处理，采用尼罗罗非鱼遗传性别鉴定的分子标记方法，筛选出 性染色体基因型为YY的转化雌鱼；
C．将YY超雄鱼与YY转化雌鱼交配，获得全YY超雄鱼；
D．将YY超雄鱼后代进行雌性化处理，获得YY转化雌鱼；
E．重复步骤C和D，通过YY超雄鱼与YY转化雌鱼交配生产YY超雄鱼。
在采用上述方法保证持续获得YY超雄鱼后，将YY超雄鱼与尼罗罗非鱼XX雌鱼交配， 可大量生产全雄商品鱼。
本发明的有益效果在于：遗传连锁分析显示，在排除天然性逆转干扰的情况下，本发明 所述尼罗罗非鱼X和Y染色体特异分子标记（本发明中分别命名为sdX和sdY）与尼罗罗非 鱼性别决定位点的遗传距离为0cM，明显优于中国专利ZL201010501061.8所述尼罗罗非鱼X 和Y染色体特异分子标记NtX1和NtY2，以及本课题组筛选出的另一尼罗罗非鱼性别特异分 子标记marker2，可通用于多种品系的尼罗罗非鱼，如对来自海南、广西和广东四个罗非鱼苗 种场的4个不同品系的98尾尼罗罗非鱼进行双盲检验，遗传性别和表型性别的鉴定吻合率为 90%～100%；基于本发明所述X和Y染色体特异分子标记sdX/sdY构建的尼罗罗非鱼遗传性 别鉴定方法，可以经济、快速、准确地区分正常雌鱼XX♀、正常雄鱼XY♂、转化雌鱼XY ♀、转化雌鱼YY♀与超雄鱼YY♂；基于上述尼罗罗非鱼遗传性别鉴定方法建立的YY♀与 YY♂交配生产YY超雄鱼的方法，可以快速高效生产YY超雄鱼，进而通过YY超雄鱼与正 常雌鱼XX♀交配实现全雄鱼鱼苗的规模化生产，显著提高养殖产量，降低养殖成本，提高 经济效益。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为本发明所述X和Y染色体特异分子标记的序列比对图。
图2为应用本发明所述X和Y染色体特异分子标记对5尾尼罗罗非鱼雌鱼XX、5尾尼 罗罗非鱼雄鱼XY和5尾尼罗罗非鱼超雄鱼YY进行遗传性别鉴定的结果，M表示DNA分 子量标准DL2000。
图3为应用本发明所述X和Y染色体特异分子标记对19尾XX♀×XX♂尼罗罗非鱼杂 交后代进行遗传性别鉴定的结果，其中1-19为XX♀×XX♂杂交后代，XX、XY、YY为对 照，M表示DNA分子量标准DL2000。
图4为应用本发明所述X和Y染色体特异分子标记对19尾XX♀×YY♂尼罗罗非鱼杂 交后代进行遗传性别鉴定的结果，其中1-19为XX♀×YY♂杂交后代，XX、XY、YY为对 照，M表示DNA分子量标准DL2000。
图5为应用本发明所述X和Y染色体特异分子标记对19尾YY♀×YY♂尼罗罗非鱼杂交 后代进行遗传性别鉴定的结果，其中1-19为YY♀×YY♂杂交后代，XX、XY、YY为对照， M表示DNA分子量标准DL2000。
图6为本发明所述X和Y染色体特异分子标记与性别决定位点在性染色体上的连锁图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条 件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等著，黄 培堂等译，科学出版社，2002年）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
一、尼罗罗非鱼性别特异分子标记的获得
1、基因组DNA的提取
剪取尼罗罗非鱼（为本实验室引进的日本品系尼罗罗非鱼，其母本引自埃及，父本引自马 来西亚）鳍条10mg，置裂解液[10mM Tris-HCl(pH8.0)+100mM EDTA(pH8.0)+100mM NaCl+ 5mg/ml SDS]600μl中匀浆，加入终浓度为20mg/ml的蛋白酶K和终浓度为100μg/ml的核糖核 酸酶A（RnaseA），55℃水浴消化至澄清，再加入苯酚-氯仿-异戊醇（体积比为25:24:1）混 合液600μl，充分混匀后于12000rpm离心10分钟，吸取上清液，再次加入苯酚-氯仿-异戊醇（体 积比为25:24:1）混合液抽提DNA，离心，吸取上清液，加入冰乙醇1000μl沉淀DNA，离心， 弃上清液，DNA沉淀经体积分数为70%的乙醇洗涤、自然干燥后，用TE缓冲液溶解制成浓度 为20ng/μl的溶液（OD260/OD280=1.76～1.80），-20℃保存备用。
2、PCR随机扩增性别决定区间筛选性别特异分子标记
对不同品系尼罗罗非鱼的研究表明，遗传连锁群LG1（Cnaani and Kocher,2008;Lee et al., 2011;Lee et al.,2003）、LG3（Campos-Ramos et al.,2001;Carrasco et al.,1999;Foresti et al.,1993; Harvey et al.,2003;Harvey et al.,2002;Ocalewicz et al.,2009）和LG23（Eshel et al.,2011;2012） 所对应的染色体均有可能是性染色体，但到底哪一个LG对应性染色体，目前还没有定论。基 于前期研究成果及尼罗罗非鱼基因组DNA序列，发明人选择在LG23中3条相邻的Scaffold7、 101和29上随机设计32对引物（分别是Scaffold716对、Scaffold1016对、Scaffold2910对）， 分别对XX、XY、YY尼罗罗非鱼基因组池进行PCR扩增，筛选性别特异分子标记。结果发现， Scaffold101上的1对引物（上游引物F1序列如SEQ ID No.1所示，下游引物R1序列如SEQ ID No.2所示）具有明显的性别特异性，能在XX和XY个体中扩增出一条长1422bp的X染色体特 异条带，同时在XY和YY个体中扩增出一条长982bp的Y染色体特异条带，而其余31对引物没 有性别特异性。
3、性别特异分子标记的克隆与序列分析
分别取含有上述X染色体特异条带、Y染色体特异条带的琼脂糖凝胶，回收目的片段，将 其克隆入pMD-19T载体，再转化大肠杆菌感受态细胞，用蓝白斑筛选法筛选阳性克隆，挑取 白斑单菌落，用PCR法鉴定阳性克隆，再进行测序。
对测序获得的X染色体特异分子标记（序列如SEQ ID No.3所示，命名为sdX）和Y染色体 特异分子标记（序列如SEQ ID No.4所示，命名为sdY）进行序列比对分析。结果如图2所示， X和Y染色体特异分子标记的序列差异主要有3处：与X染色体特异分子标记相比，Y染色体特 异分子标记①在514bp处插入了36bp序列；②在738bp处缺失了4bp序列；③在838bp处缺失 了472bp序列。
二、尼罗罗非鱼遗传性别鉴定的分子标记方法
尼罗罗非鱼遗传性别鉴定的分子标记方法，包括以下步骤：
A．PCR克隆：剪取待测尼罗罗非鱼的鳍条，提取基因组DNA；以所得基因组DNA为模 板，采用SEQ ID No.1所示的上游引物F1和SEQ ID No.2所示的下游引物R1进行PCR扩增；PCR 扩增参数为：94℃预变性3分钟，然后94℃变性30秒、58℃退火30秒、72℃延伸30秒，共38 个循环，最后72℃延伸10分钟；所得PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳；
B．结果判断：当从待测尼罗罗非鱼的基因组DNA中仅扩增出长1422bp的X染色体特异 条带（即本发明所述X染色体特异分子标记sdX），则判断该待测尼罗罗非鱼为遗传上的雌鱼， 性染色体基因型为XX；当从待测尼罗罗非鱼的基因组DNA中仅扩增出长982bp的Y染色体特 异条带（即本发明所述Y染色体特异分子标记sdY），则判断该待测尼罗罗非鱼为遗传上的超 雄鱼，性染色体基因型为YY；当从待测尼罗罗非鱼的基因组DNA中同时扩增出长1422bp的X 染色体特异条带和长982bp的Y染色体特异条带，则判断该待测尼罗罗非鱼为遗传上的雄鱼， 性染色体基因型为XY。
应用上述方法对5尾尼罗罗非鱼雌鱼XX、5尾尼罗罗非鱼雄鱼XY和5尾尼罗罗非鱼超 雄鱼YY进行遗传性别鉴定，结果见图2，在所有XX个体中都仅扩增出了长1422bp的X染 色体特异条带，在所有YY个体中都仅扩增出了长982bp的Y染色体特异条带，而在XY个 体中同时扩增出了长1422bp的X染色体特异条带和长982bp的Y染色体特异条带，与理论 结果一致。
应用上述方法对19尾尼罗罗非鱼XX♀×XX♂杂交后代进行遗传性别鉴定，结果见图3， 在所有待测尼罗罗非鱼和对照XX个体中都仅扩增出了长1422bp的X染色体特异条带，而 在对照XY个体中同时扩增出了长1422bp的X染色体特异条带和长982bp的Y染色体特异 条带，在对照YY个体中仅扩增出了长1422bp的Y染色体特异条带，说明这19尾待测尼罗 罗非鱼均为遗传上的XX雌鱼，与理论结果一致。
应用上述方法对19尾尼罗罗非鱼XX♀×YY♂杂交后代进行遗传性别鉴定，结果见图4， 在所有待测尼罗罗非鱼和对照XY个体中都同时扩增出了长1422bp的X染色体特异条带和 长1070bp的Y染色体特异条带，而在对照XX个体中仅扩增出了长1422bp的X染色体特 异条带，在对照YY个体中仅扩增出了长982bp的Y染色体特异条带，说明这19尾待测尼 罗罗非鱼均为遗传上的XY雄鱼，与理论结果一致。
应用上述方法对19尾尼罗罗非鱼YY♀×YY♂杂交后代进行遗传性别鉴定，结果见图5， 在所有待测尼罗罗非鱼和对照YY个体中都仅扩增出了长1422bp的Y染色体特异条带，而 在对照XX个体中仅扩增出了长1422bp的X染色体特异条带，在对照XY个体中同时扩增 出了长1422bp的X染色体特异条带和长982bp的Y染色体特异条带，说明这19尾待测尼 罗罗非鱼均为遗传上的YY超雄鱼，与理论结果一致。
三、尼罗罗非鱼性别特异分子标记和性别决定位点的遗传连锁分析
对本实验室引进的日本品系尼罗罗非鱼3个XX♀×XY♂正常养殖家系进行连锁分析。 每个个体的表型性别通过组织切片进行确认，遗传性别分别采用尼罗罗非鱼性别特异分子标 记sdX/sdY、NtX1/NtY2、marker2进行鉴定。利用JoinMAP4.0进行性别决定位点 （sex-determining loci,SD）和以上性别特异分子标记的遗传连锁分析，结果见表1和图6。
表1 尼罗罗非鱼性别特异分子标记与性别决定位点的遗传连锁分析
注：重组个体排除了天然性逆转的个体；LOD临界值为3.0；遗传距离和LOD值由Joinmap4.0计算。
由表1可知，尼罗罗非鱼性别特异分子标记sdX/sdY、NtX1/NtY2和marker2距离性别决 定位点的遗传距离分别为0、1.89、1.08cM，本发明的性别特异分子标记sdX/sdY明显优于另 两组分子标记。
四、基于性别特异分子标记对不同来源的尼罗罗非鱼进行遗传性别鉴定
采用本发明的性别特异分子标记sdX/sdY，对来自海南（HN1，HN2）、广西（THS）和 广东（NG）四个罗非鱼苗种场的4个不同品系的98尾尼罗罗非鱼（62尾表型雌鱼和36尾 表型雄鱼）进行遗传性别鉴定，结果显示为59尾雌鱼和39尾雄鱼。与表型鉴定结果进行匹 配分析，发现共有5尾基因型性别和表型性别鉴定结果不吻合，其中4尾表型雌鱼被鉴定为 XY雄鱼，1尾表型雄鱼被鉴定为XX雌鱼；4个不同品系的尼罗罗非鱼，遗传性别与表型性 别的吻合率为90%～100%，吻合率最低的是HN2家系，最高的是HN1家系（表2），不吻合 的原因可能是由于罗非鱼发生性逆转所致。由上述结果可知，本发明的性别特异分子标记 sdX/sdY适用于本实验室养殖的尼罗罗非鱼和4个不同来源品系的尼罗罗非鱼，具有普适性。
表2 4个不同来源家系尼罗罗非鱼的遗传性别鉴定结果
表型性别 HN1(28) HN2(22) THS(25) NG(23) 雌鱼 (19♀:0♂) (13♀:1♂) (13♀:2♂) (13♀:1♂) 雄鱼 (0♀:9♂) (1♀:7♂) (0♀:10♂) (0♀:9♂) 雌鱼准确率 100% 93% 87% 93% 雄鱼准确率 100% 88% 100% 100% 平均准确率 100% 90% 93% 96%
五、基于性别特异分子标记生产超雄尼罗罗非鱼的方法
基于本发明的性别特异分子标记sdX/sdY进行尼罗罗非鱼遗传性别鉴定，生产超雄尼罗 罗非鱼的方法包括以下步骤：
A．将尼罗罗非鱼雌鱼XX与雄鱼XY交配后代于孵化后5天进行雌二醇浸浴，采用本发 明所述尼罗罗非鱼遗传性别鉴定的分子标记方法，从性成熟雌性个体中筛选出性染色体基因 型为XY的转化雌鱼；
B．将XY转化雌鱼与尼罗罗非鱼XY雄鱼交配，采用本发明所述尼罗罗非鱼遗传性别鉴 定的分子标记方法，从性成熟后代中筛选出性染色体基因型为YY的超雄鱼；另将XY转化 雌鱼与尼罗罗非鱼XY雄鱼交配后代于孵化后5天进行雌二醇浸浴，采用尼罗罗非鱼遗传性 别鉴定的分子标记方法，从性成熟雌性个体中筛选出性染色体基因型为YY的转化雌鱼；
C．将YY超雄鱼与YY转化雌鱼交配，获得全YY超雄鱼；
D．将YY超雄鱼后代进行雌性化处理，获得YY转化雌鱼；
E．重复步骤C和D，通过YY超雄鱼与YY转化雌鱼交配生产YY超雄鱼。
在采用上述方法保证持续获得YY超雄鱼后，将YY超雄鱼与尼罗罗非鱼XX雌鱼交配， 可大量生产全雄商品鱼。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述 优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和 细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。