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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410690486.6 (22)申请日 2014.11.25 CGMCC No. 3.15413 2014.10.23 C12N 1/14(2006.01) C12P 1/02(2006.01) A61K 36/062(2006.01) A61P 31/04(2006.01) C12R 1/67(2006.01) (71)申请人 甘孜藏族自治州畜牧业科学研究所 地址 626099 四川省甘孜藏族自治州康定县 炉城南路 71 号 (72)发明人 蒋忠荣 胡延春 罗彪 刘曦 洛绒志玛 龙兴发 叶忠明 (74)专利代理机构 成都高远知识产。
2、权代理事务 所 ( 普通合伙 ) 51222 代理人 李高峡 张娟 (54) 发明名称 一种新的黄曲霉及其用途 (57) 摘要 本发明公开了一种新的黄曲霉及其用途。本 发明黄曲霉， 它是由中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心保藏的保藏号为 CGMCC No.3.15413 的黄曲霉 LB-Y4。本发明黄曲霉的代 谢产物具有抑制金黄色葡萄球菌等细菌的活性， 可以制备抗细菌药物或消毒剂， 临床应用前景良 好。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 附图2页 CN 105695335 。
3、A 2016.06.22 CN 105695335 A 1/1 页 2 1.一种黄曲霉， 其特征在于 ： 它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏的保藏号为 CGMCC No.3.15413 的黄曲霉 LB-Y4。 2.制备权利要求 1 所述黄曲霉的抑菌代谢产物的方法， 其特征在于 ： 包括如下步骤 ： (1)发酵 ： 取保藏号为CGMCC No.3.15413的黄曲霉LB-Y4， 接种于添加有终浓度为20g/ L 可溶性淀粉和 8g/L 蛋白胨的 PD 培养基中， 在 28 1、 180 转 / 分的条件下摇床培养， 培养 7 10 天， 过滤， 得发酵上清液和菌丝体 ； (2。
4、) 提取 ： 取步骤 (1) 的发酵上清液， 减压浓缩， 得浓缩液， 醇沉， 用乙酸乙酯萃取 3 次， 合并乙酸 乙酯相， 即为发酵上清液的乙酸乙酯萃取物 ； 取步骤(1)的菌丝体， 烘干， 研碎， 加入50倍(v/w)的无水乙醇超声提取60min， 后用乙 酸乙酯萃取， 得乙酸乙酯相， 即为菌丝体的乙酸乙酯萃取物 ； 合并收集发酵上清液的乙酸乙酯萃取物及菌丝体的乙酸乙酯萃取物， 减压浓缩至浸 膏， 即得。 3.根据权利要求 2 所述的方法， 其特征在于 ： 步骤 (2) 中， 醇沉方法是 ： 加入浓缩液三 倍体积的无水乙醇， 静置 12h。 4.权利要求 2 或 3 所述方法制备得到的抑菌代。
5、谢产物。 5.权利要求 4 所述抑菌代谢产物在制备抗细菌药物或消毒剂中的用途。 6.根据权利要求 5 所述的用途， 其特征在于 ： 所述抗细菌药物或消毒剂是抗金黄色葡 萄球菌的药物或消毒剂。 7.一种抗菌药物或消毒剂， 其特征在于 ： 它是以权利要求 4 所述抑菌代谢产物为活性 成分， 加上药品上或消毒剂上可接受的辅料制备而成的制剂。 8.根据权利要求 7 所述的用途， 其特征在于 ： 所述抗细菌药物或消毒剂是液体制剂、 固 体制剂或半固体制剂。 权 利 要 求 书 CN 105695335 A 2 1/4 页 3 一种新的黄曲霉及其用途 技术领域 0001 本发明涉及一种新的黄曲霉及其用途。。
6、 背景技术 0002 黄曲霉 (Aspergillus flavus)， 半知菌类， 一种常见腐生真菌。多见于发霉的粮 食、 粮制品及其它霉腐的有机物上。 菌落生长较快， 结构疏松， 表面灰绿色， 背面无色或略呈 褐色。菌体有许多复杂的分枝菌丝构成。营养菌丝具有分隔 ； 气生菌丝的一部分形成长而 粗糙的分生孢子梗， 顶端产生烧瓶形或近球形顶囊， 表面产生许多小梗 ( 一般为双层 )， 小 梗上着生成串的表面粗糙的球形分生孢子。分生孢子梗、 顶囊、 小梗和分生孢子合成孢子 头， 可用于产生淀粉酶、 蛋白酶和磷酸二酯酶等， 也是酿造工业中的常见菌种。 0003 目前， 未见黄曲霉及其代谢产物具有抑。
7、制细菌的活性的报道。 发明内容 0004 本发明提供了一种新的黄曲霉， 其抑菌代谢产物的制备方法及其用于制备抗细菌 药物或消毒剂的用途。 0005 本发明黄曲霉， 其特征在于 ： 它是由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物 中心保藏的保藏号为 CGMCC No.3.15413 的黄曲霉 LB-Y4。 0006 前述黄曲霉LB-Y4(Aspergillus flavus LB-Y4)保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心， 其地址为 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 中国科学院微生物 研究所， 保藏日期 2014 年 10 月 23 日， 保藏编号为 ： CGMCC N。
8、o.3.15413。 0007 本发明还提供了制备前述黄曲霉的抑菌代谢产物的方法， 包括如下步骤 ： 0008 (1)发酵 ： 取保藏号为CGMCC No.3.15413的黄曲霉LB-Y4， 接种于添加有终浓度为 20g/L 可溶性淀粉和 8g/L 蛋白胨的 PD 培养基中， 在 28 1、 180 转 / 分的条件下摇床 培养， 培养 7 10 天， 过滤， 得发酵上清液和菌丝体 ； 0009 (2) 提取 ： 0010 取步骤 (1) 的发酵上清液， 减压浓缩， 得浓缩液， 醇沉， 用乙酸乙酯萃取 3 次， 合并 乙酸乙酯相， 即为发酵上清液的乙酸乙酯萃取物 ； 0011 取步骤(1)的菌。
9、丝体， 烘干， 研碎， 加入50倍(v/w)的无水乙醇超声提取60min， 后 用乙酸乙酯萃取， 得乙酸乙酯相， 即为菌丝体的乙酸乙酯萃取物 ； 0012 合并收集发酵上清液的乙酸乙酯萃取物及菌丝体的乙酸乙酯萃取物， 减压浓缩至 浸膏， 即得。 0013 步骤 (2) 中， 醇沉方法是 ： 加入浓缩液三倍体积的无水乙醇， 静置 12h。 0014 本发明还提供了前述方法制备得到的抑菌代谢产物及其在制备抗细菌药物或消 毒剂中的用途。 0015 所述抗细菌药物或消毒剂是抗金黄色葡萄球菌的药物或消毒剂。 0016 本发明还提供了一种抗菌药物或消毒剂， 它是以前述抑菌代谢产物为活性成分， 说 明 书 。
10、CN 105695335 A 3 2/4 页 4 加上药品上或消毒剂上可接受的辅料制备而成的制剂。 0017 所述抗细菌药物或消毒剂是液体制剂、 气体制剂、 固体制剂或半固体制剂。 0018 本发明提供的新的黄曲霉的代谢产物具有抑制金黄色葡萄球菌等细菌的活性， 可 以制备抗细菌药物或消毒剂， 也是寻找新型抗生素的重要微生物资源， 临床应用前景良好。 0019 以下通过实施例形式的具体实施方式， 对本发明的上述内容作进一步的细说明。 但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。 凡基于本发明上述内容所 实现的技术均属于本发明的范围。 附图说明 0020 图 1 为本发明所述黄帚橐吾内。
11、生真菌黄曲霉 LB-Y4 在 PDA 平板上的形态。 0021 图 2 为黄曲霉 LB-Y4 在发酵培养基种的形态。 0022 图 3 为黄曲霉 LB-Y4 孢子形态特征。 0023 图 4 为代谢产物的抑菌效果图。 具体实施方式 0024 实验材料和试剂 ： 0025 实施例 1 本发明黄曲霉的分离鉴定 0026 1、 分离 0027 1.1 常规内生真菌分离法 0028 将健康黄帚橐吾叶片中间部分剪成2mm小片， 镊子将小片浸于75酒精30S， 无菌 水漂洗 2 3 次， 3 NaClO2 3min， 再浸入 75酒精 30S， 无菌水漂洗 2 3 次， 用最后一 次无菌水作对照， 无菌镊。
12、子取出小叶片将其平贴于 PDA 平板上， 每皿内放置 6 小片， 用封口 膜封口后室温下放置 5 天后连续观察统计出现的菌落形态和数量， 若对照组没有长出任何 菌， 则说明表面消毒完全。 0029 1.2 内生真菌菌种纯化 0030 挑取典型菌株三点点植于双抗 PDA 平板 (100 PDA 平板中含有氨苄青霉素 40ppm， 硫酸链霉素 80ppm 来抑制细菌生长 ) 上， 20培养 5 天后， 挑取菌落边沿生长区菌丝 尖端纯化， 单菌落斜面保存， 将分离纯化的真菌编号。 0031 1.3 内生真菌保种 0032 挑取尖端菌丝接种于无菌斜面 PDA 培养基， 28恒温培养箱中培养 5-7 天。
13、待孢子 布满整个斜面并无杂菌生长， 加入无菌石蜡油 4封藏， 加入量以直立试管时高出斜面顶端 约 1cm 为宜。 0033 2、 鉴定 0034 取前述方法分离得到的菌株， 采用如下方法鉴定 ： 0035 (1) 菌落形态特征 0036 利用显微镜及肉眼观察细胞及固体平板上的菌落形态。 0037 (2) 分子生物学鉴定 0038 利用 PCR 技术， 测定前述菌株的 18S rDNA/ITS 序列， 利用 BLAST 软件将该序列与 GenBank 中收录的 DNA 序列进行比对， 并与相关菌种构建进化树， 鉴定菌株的种属。 说 明 书 CN 105695335 A 4 3/4 页 5 003。
14、9 2.2 鉴定结果 0040 (1) 菌落形态 0041 如图 1 3 所示， 菌落生长迅速， 25培养 7 天直径 35-40mm ； 菌落致密丝绒状或 絮状， 平坦或辐射状不规则沟纹 ； 分生孢子颜色为黄绿色至草绿色 ； 通常无渗出液 ； 菌落反 面无色至淡褐色。分生孢子头初为球形， 后呈辐射形 ； 分生孢子梗大多生自基质 ； 顶囊近球 形或烧瓶形， 发酵培养 7-9 天形成直径为 1-2mm 的棕色菌丝球， 培养液透明清澈。 0042 (2)18S rDNA/ITS 序列为 ： 0043 ACGAGGGGTACGGTTCTAGCGAGCCCAACCTCCCACCCGTGTTTACTGT。
15、ACCTTAGTTGCTTCGGCGGG CCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTCTCAGCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCT AGTGAAGTCTGAGTTGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAG AACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCC CCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCC。
16、ATCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTC CCCTCTCCGGGGGGGACGGGCCCCAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACC CGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATAC CCGCTGAACTTAAGCATATCAAAA 0044 结合前述菌落形态特征和 18S rDNA/ITS 序列， 将分离得到的菌株鉴定为黄曲霉 (Aspergillus flavus)， 定名为黄曲霉 LB-Y4(As。
17、pergillus flavus LB-Y4)， 并保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏， 保藏日期 2014 年 10 月 23 日， 保藏编号 为 ： CGMCC No.3.15413。 0045 实施例 2 采用本发明菌株发酵制备抗菌代谢产物 0046 1、 实验材料 0047 PDA 固体培养基 (1L) ： 马铃薯 200 克， 葡萄糖 20 克， 琼脂 15 20 克， 其余为水 ； 制备方法 ： 称取 200g 马铃薯切成小块， 加水煮烂 ( 煮沸 20 30 分钟， 能被玻璃棒戳破即 可 )， 用八层纱布过滤， 加入琼脂， 继续加热搅拌混匀， 待琼脂溶解完后，。
18、 加入葡萄糖， 搅拌均 匀， 稍微冷却后再补足水分至 1000 毫升， 即可。 0048 PD液体培养基(1L) ： 马铃薯200克， 葡萄糖20克， 其余为水 ； 制备方法 ： 称取200g 马铃薯切成小块， 加水煮烂 ( 煮沸 20 30 分钟， 能被玻璃棒戳破即可 )， 用八层纱布过滤， 加入葡萄糖， 搅拌均匀， 稍微冷却后再补足水分至 1000 毫升， 即可。 0049 金黄色葡萄球菌 ： 金黄色葡萄球菌金葡 ATCC 27217 菌株。 0050 2、 制备方法 0051 (1) 菌种的活化培养 ： 将实施例 1 分离保存的黄曲霉 LB-Y4 菌种移至 PDA 固体平 板上， 在 2。
19、8 1条件下培养， 至菌丝覆盖整个培养皿， 用直径为 4mm 打孔器打孔获得菌 饼， 供接种用 ； 0052 (2)发酵培养 ： 发酵培养液为每1000mL PD培养基中加入， 可溶性淀粉20g， 蛋白胨 8g， 每500mL三角瓶装发酵培养液200mL ； 配制后121灭菌20min， 待冷却至40在无菌条 件下挑取 1 直径为 4mm 菌饼， 在 28 1条件下， 摇床转速 180 转 / 分钟， 发酵培养 7-10 天。 0053 (3) 发酵物提取 ： 取发酵液， 抽滤， 分为菌丝和发酵上清液， 发酵上清液 5L 减压浓 缩至1L， 醇沉去除杂质(即用三倍体积的无水乙醇提取， 静置过夜。
20、)， 抽滤去除沉淀， 滤液用 说 明 书 CN 105695335 A 5 4/4 页 6 乙酸乙酯1:1萃取3次， 合并乙酸乙酯相 ； 菌丝体于烘箱烘干后， 取出用研钵将菌丝研碎， 用 无水乙醇(w/v1/50)超声提取60min， 后用乙酸乙酯萃取得乙酸乙酯相， 最后合并收集发 酵上清液乙酸乙酯萃取物及菌丝乙酸乙酯萃取物， 旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏， 即得黄曲 霉 LB-Y4 代谢产物， 用丙酮溶解 4冰箱保存备用。 0054 3、 抗菌活性检测 0055 3.1 取前述方法制备的黄曲霉 LB-Y4 代谢产物 0.1g， 并加入 10mL 体积的丙酮， 超 声波震荡充分溶解， 最终配置成浓。
21、度为 10g/L 的样品溶液 ； 0056 3.2 活化后的金黄色葡萄球菌用无菌水稀释至 108cfu/mL， 0057 取 0.1mL 菌悬液涂布于 LB 平板上。放上牛津杯， 加入 100ul 样品， 丙酮做对照， 重 复 3 次， 37培养 1 2d， 观察抑菌圈的大小及有无。 0058 4、 抗菌活性检测结果 0059 结果如下表 1 和图 4 所示 ： 0060 表 1 黄曲霉 LBY4 供试病原细菌的抑制效果 0061 0062 由表 1 和图 4 可以看出， 本发明前述方法制备的黄曲霉 LBY4 代谢产物对金黄色葡 萄球菌具有良好的抑制作用， 可以制备成为抗细菌的药物或消毒剂。 0063 综上， 本发明从植物黄帚橐吾茎中分离筛选出一株新的黄曲霉， 其代谢物对金黄 色葡萄球菌具有较强抑制作用， 为医药领域研发新的抗菌药物或消毒剂提供了新的来源。 说 明 书 CN 105695335 A 6 1/1 页 7 0001 序 列 表 CN 105695335 A 7 1/2 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 105695335 A 8 2/2 页 9 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 105695335 A 9 。