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1、(10)授权公告号 CN 102876710 B (45)授权公告日 2014.03.19 CN 102876710 B (21)申请号 201210414315.1 (22)申请日 2012.10.25 C12N 15/82(2006.01) C12N 15/113(2010.01) (73)专利权人 北京未名凯拓作物设计中心有限 公司 地址 100085 北京市海淀区上地西路 39 号 北大生物城 (72)发明人 周君莉 吴洁芳 李早霞 赵静 卫静 夏勉 (54) 发明名称 一个地上组织特异性表达启动子的鉴定和应 用 (57) 摘要 本发明公开了一个植物地上部组织特异表达 启动子的鉴定与应。
2、用， 提供了该启动子的核酸、 表 达盒、 载体、 细胞及用于在植物中表达核苷酸序列 的方法。本说明书所公开的启动子在植物的地上 部分特异表达， 在植物转基因领域具有很好的应 用前景。 (51)Int.Cl. 审查员 刘新蕾 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图1页 (10)授权公告号 CN 102876710 B CN 102876710 B 1/1 页 2 1. 一种在水稻中表达异源核苷酸序列的方法， 所述方法包括向水稻中导入 DNA 构建 体， 所述 DNA 构。
3、建体含有启动子及操作性连接于所述启动子的目的异源核苷酸序列， 其中 所述启动子的核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。 2. 权利要求 1 所述的方法， 其中所述的异源核苷酸序列是指天然状态下没有与所述启 动子序列操作性连接的序列。 3. 权利要求 1 所述的方法， 其中所述的异源核苷酸序列编码的基因产物可赋予水稻对 除草剂、 盐、 低温、 干旱、 病原体或昆虫的抗性， 或是调控水稻的生长发育。 4. 一种启动子， 其特征在于， 该启动子的核苷酸序列如 SEQ ID NO ： 1 所示。 5. 一种表达盒， 其特征在于含有权利要求 4 所述的启动子。 6. 一种载体， 其特征在于含有。
4、权利要求 5 所述的表达盒。 权 利 要 求 书 CN 102876710 B 2 1/5 页 3 一个地上组织特异性表达启动子的鉴定和应用 技术领域 0001 本发明属于植物生物工程和植物改良基因工程技术领域。 具体涉及一个植物地上 组织特异性表达启动子的分离鉴定和应用。 背景技术 0002 外源 DNA 序列通过连接到特定的启动子从而启动在植物宿主中的表达， 启动子类 型的选择决定基因的表达时间和部位。 目前在农业生物技术领域广泛应用的主要是一些组 成型的强启动子， 比如 CaMV 35S 启动子和玉米 Ubiquitin-1 启动子 (Battraw and Hall， 1990 ； C。
5、hristensen et al.1992)， 然而在利用这些启动子诱导目的基因转化水稻等作物以 期改良作物的品质时， 往往会由于目的基因表达的时间 ( 发育阶段特异性 ) 或空间 ( 组织 器官特异性 ) 不能很好地控制而导致改良效果不明显， 或者由于这些组成型启动子诱导基 因表达量太高而对植物的生长发育造成影响， 这些都是目前利用组成型强启动子结合功能 基因来改良作物品质时遇到的障碍。 0003 此外， 在研究某些代谢过程或调节途径时， 常常需要将同一途径上的两个以上的 基因转化到同一个株系中去， 采用转化其中一个基因得到转基因植株后再转化另外一个 基因， 或者两个基因分别转化完成后再进行。
6、杂交， 都需要等待较长的时间， 为了提高效率缩 短多个基因转化的时间， 最近有报道可以利用新的载体同时进行多个基因的转化 (Lin et al.2003 ； Chen et al.2006)， 但是在多基因转化时如果重复使用同一个启动子， 也会由于 启动子序列的高同源性可能导致基因沉默。 因此， 克服以上转化技术上的困难， 就很有必要 克隆更多的组织器官特异性或者特定条件诱导型表达的启动子， 这样可以根据需要选择不 同的启动子诱导目的基因在适合的时间或空间表达。 0004 外源基因在转基因植物中的定位表达， 可以降低植物负担， 减轻对其他性状的不 利影响， 而且还可以提高目标产物在特定部分的表。
7、达量， 增强转基因的效果。鉴于此， 研究 者们更加重视对组织特异性启动子的开发和应用。 0005 绿色组织特异性启动子诱导基因只在茎叶等绿色组织表达， 因而可以用于以茎叶 为主要收获产物的作物， 使蛋白质产物富集于茎叶中， 减少宿主植物无谓的物质能量消耗， 改善光合作用特性 ； 也可以用于以种子、 果实为主要收获产物的作物， 让抗除草剂、 抗虫等 外源基因只在茎叶部分而不在种子果实等器官中表达， 以提高转基因作物的生物安全性， 在植物基因工程研究中具有广泛的应用前景。目前， 已成功利用的叶片特异表达启动子有 Rbcs (1， 5- 二磷酸核酮糖梭化加氧酶小亚基基因 ) 启动子和 Cab( 捕光。
8、叶绿素 a/b 结合蛋 白基因 ) 启动子等。 发明内容 0006 本发明内容给出了本发明的一些实施方式， 以及在多种情况中给出了这些实施方 式的变动和变更。本发明内容只是很多的和不同的实施方式的示例。所提及的给定实施方 式示例也是一个或多个代表性的特点。 这样一个实施方式通常可以具有或不具有所提及的 说 明 书 CN 102876710 B 3 2/5 页 4 特点 ； 同样， 这些特点也可以被施用于本发明的其他实施方式中。为了避免过多的重复， 本 发明内容没有罗列或提及这些特点的所有可能的组合。 0007 本发明提供了一种能在植物地上组织特异表达的启动子 KT598P 的核苷酸序列， 具体。
9、核苷酸序列如SEQ ID No ： 1所示， 及修饰、 克隆并应用该启动子的方法。 本发明还提供 了用于在植物中表达核苷酸序列的方法。在一些实施方式中， 方法包括 (a) 将核苷酸序列 可操作地连接于包括SEQ ID No ： 1的启动子， 以产生表达盒 ； 和(b)生成包括表达盒的转基 因植物， 由此在植物中， 更具体地说， 是在植物地上组织中表达所述核苷酸。在一些实施方 式中， 所述生成包括用表达盒转化植物细胞并从所转化的植物细胞中再生出植物。 0008 本发明所提供的植物地上组织特异性表达启动子 KT598P， 包含序列表中 SEQ ID No ： 1 所示的核苷酸序列 ； 还包含与 S。
10、EQ ID No ： 1 中所列核苷酸序列至少具有 95相似性 的核苷酸序列， 可以驱动操作性连接的核苷酸序列在植物中特异性表达。与 SEQ ID No ： 1 所示的核苷酸序列具有 90以上同源性， 且具有驱动操作性连接的核苷酸序列特异性地在 植物地上组织中表达的功能的序列， 是将所述 SEQ ID No ： 1 序列用已知的方法进行分离和 / 或修饰和 / 或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是， 特定核苷酸序列中核苷酸 相似性的微小改变不一定会导致该核苷酸序列的功能变化， 核苷酸序列的变化或缩短的方 法， 以及测试这些发生变化的核苷酸序列有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。 000。
11、9 本发明所提供的核苷酸序列 SEQ ID No ： 1， 可用于从其它生物物种中分离相应 序列， 如其它植物 ( 单子叶或双子叶植物 )。根据这些相应序列与本文所列序列间的序列 同源性， 使用如 PCR、 杂交等技术来鉴别这些相应序列。因此， 根据它们与本文所列的完整 KT598P 启动子序列 ( 或其片段 ) 间的序列相似性而分离的相应片段， 也包括在实施方案 中。实施方案的启动子区域可从任何植物中分离， 包括 ( 但不限于 ) 水稻、 芸苔属、 玉米、 小 麦、 高粱、 两节荠属、 白芥、 蓖麻子、 芝麻、 棉籽、 亚麻子、 大豆、 拟南芥属、 菜豆属、 花生、 苜蓿、 燕麦、 油菜籽、。
12、 大麦、 燕麦、 黑麦 (Rye)、 粟、 蜀黍、 小黑麦、 单粒小麦、 斯佩尔特小麦 (Spelt)、 双粒小麦、 Teff、 Milo、 亚麻、 格兰马草 (Gramma grass)、 摩擦禾、 假蜀黍、 羊茅、 多年生麦 草、 甘蔗、 红莓苔子、 番木瓜、 香蕉、 红花、 油棕、 香瓜、 苹果、 黄瓜、 石斛、 剑兰、 菊花、 百合科、 棉花、 桉、 向日葵、 芸苔、 甜菜、 咖啡、 薯蓣、 观赏植物和松类等。 0010 本文中 “启动子” 一词指 DNA 调控序列， 其中通常含有一个 TATA 盒， 该序列能够指 导 RNA 聚合酶 II 在合适的转录起始位点上起始特定编码序列的转录。
13、。启动子也可另外含 有其他识别序列， 它们通常位于 TATA 盒的上游或 5 端， 被称作上游启动子元件， 这些元件 能够影响转录速率。应认识到当鉴别了本文所公开的启动子区域的核苷酸序列后， 分离并 鉴别位于本文所鉴别的特定启动子区域上游的 5 非翻译区内的其它调控元件就属于现有 技术范围了。 因此， 本文公开的启动子区域可另外包含上游调控元件， 如负责组织特异性和 时间特异性表达的元件、 增强子等。 0011 本发明的实施案例中也包括 DNA 构建体， 该构建体含有操作性连接于异源核苷酸 序列上的启动子， 该启动子含有本发明公开的序列， 并可在植物细胞中驱动上述核苷酸序 列进行表达。本发明的。
14、实施方案还提供了表达盒和表达载体， 以及在基因组中稳定包含上 述 DNA 构建体的植物或植物细胞。 “操作性连接” 指使异源核苷酸序列处于启动子作用下的 连接方式， 也指将两个核苷酸序列连接起来从而使每个 DNA 片段的编码序列都保持在适当 的阅读框内。 “异源核苷酸序列” 指天然状态下没有与所述启动子序列操作性连接的序列。 说 明 书 CN 102876710 B 4 3/5 页 5 与所述启动子序列来源不同的核苷酸序列， 对于植物宿主来说可能是同源的， 或是异源的。 0012 本文所公开的 KT598P 地上组织特异表达启动子及其变异体和片段可用于植物基 因工程， 例如制备转化或转基因植物。
15、， 以产生目的表型。 “转化植物” 或 “转基因植物” 指在 基因组内含有外源多核苷酸的植物。 通常转化植物或转基因植物基因组稳定含有这些外源 多核苷酸， 可将该外源多核苷酸稳定地遗传给下一代。这些外源多核苷酸序列可单独或与 重组 DNA 构建体一起存在于基因组中。这里所用的 “转基因物质” 包括任何细胞、 细胞系、 愈伤组织、 组织、 植物体部分或完整植物体， 只要它们的基因型被外源核酸的存在而改变， 包括通过转基因操作而改变的起始宿主， 以及通过这些起始宿主进行有性或无性繁殖所得 的后代。这里所用的 “转基因物质” 并不包括通过传统植物种植方法或天然事件 ( 例如随 机杂交、 非重组病毒感。
16、染、 非重组细菌转化、 非重组转座或自发突变 ) 改变了基因组 ( 染色 体或染色体外 ) 的植物。 0013 “转基因事件” 通过以下步骤获得， 使用外源 DNA 构建体 ( 含有核酸表达盒， 其中 又含有目的转基因 ) 转化植物细胞， 用基因组插入了外源 DNA 构建体的植物细胞再培养获 得大量植物体， 根据插入的外源基因进行筛选。转基因事件的典型表型特征是转基因的表 达。在遗传水平上，“转基因事件 “是植物基因组组成的一部分。 “转基因事件” 也指转化植 物体与其它植物体进行杂交所得的含有外源 DNA 的后代。 0014 本文的 “植物” 包括整株植物、 植物组织器官 ( 如叶、 根、 。
17、茎等 )、 种子、 植物细胞， 以 及它们的后代。 实施方案中转基因植物的部分植株应理解为包括如转基因植物或其后代的 植物细胞、 原生质体、 组织、 愈伤组织、 胚， 及从转基因植物或其后代长出的花、 茎、 果实、 胚 珠、 叶或根。 0015 这里所用的 “植物细胞” 包括但不限于种子悬浮培养物、 胚芽、 分生组织区域、 愈伤 组织、 叶、 根、 芽、 配子、 花粉、 孢子体和小孢子。 可用于本文所公开方法的植物种类包括所有 可进行转化的高等植物， 包括单子叶植物和双子叶植物。 0016 本文所公开的启动子序列可在宿主植物中调控任何异源核苷酸序列的表达。因 此， 所述的异源核苷酸序列可以是操。
18、作性连接于本文所公开的启动子之上的结构基因 ( 编 码目的蛋白 )。实施方案中的目的基因包括参与信号传导调控的基因如转录因子、 激酶等， 持家基因如热休克蛋白基因。 更具体地说， 转基因的种类包括如， 所编码蛋白赋予植物耐受 非生物逆境的抗性基因， 所述非生物逆境包括干旱、 温度、 盐和毒素(杀虫剂和除草剂)等。 或是所编码蛋白赋予植物耐受生物逆境的抗性基因， 如真菌、 病毒、 细菌、 昆虫和线虫的侵 害， 以及由这些胁迫引起的疾病。 表型的编码包括改变植物中某个基因的表达， 从而改变植 物对病原体或昆虫等的防御机制， 或是提高植物对除草剂的抗性， 根据环境改变植物的生 长发育过程等。 这些改。
19、变可通过在植物体内表达外源基因或提高内源特定基因的表达来获 得。 或者是通过降低植物体内一个或多个内源基因的表达产物， 如酶、 转运蛋白、 辅因子等， 通过影响植物的代谢机制来获得相应的表型。 0017 由上可见， 可将任何目的基因操作性连接到实施方案中的启动子序列上， 并在植 物体中进行表达， 优选在植物地上组织中表达。 0018 根据 RNA 干扰技术 (RNA interference， RNAi)， 操作性连接于本文所公开的 KT598P 地上组织特异性表达启动子上的异源核苷酸序列， 可以是某些靶基因的反义序列。 “反义核苷酸序列” 指一段与靶基因核苷酸序列互补的双链 RNA 分子。当。
20、导入到植物细胞中 说 明 书 CN 102876710 B 5 4/5 页 6 后， 反义 DNA 序列的表达能阻止靶基因 DNA 序列的正常表达。反义核苷酸序列编码的 RNA 转录产物可与靶基因转录生成的内源 mRNA 互补， 并可与其杂交。这样， 由靶基因编码的天 然蛋白的合成就受到限制， 从而获得相应的表型。 0019 下面通过具体实施方式， 结合附图对本发明做进一步详细描述， 但不以任何方式 限制本发明的范围。 附图说明 0020 图1是表达载体pHPG的T-DNA区图谱。 LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边界 ； hpt 表示潮霉素抗性基因 ； Pnos 表示 nos 基因的启。
21、动子 ； Tnos 表示 nos 基因的终止子 ； GUS 表示gus蛋白基因 ； T35s表示35s基因的终止子 ； BamHI和EcoRI分别表示内切BamHI和 EcoRI 的酶切位点 ； 启动子即为本发明通过 PCR 克隆出的地上组织特异表达启动子。 0021 图 2 是启动子 KT598P 转基因水稻的组织器官染色。其中 A 为叶片 ； B 为茎 ； C 为 根 ； D 为颖壳 ； E 为花器官。 具体实施方式 0022 下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法， 所用引物均由上海英俊生物 技术公司合成， 测序由北京华大基因完成， PCR 试剂盒、 载体构建过程中的核酸内切酶购自。
22、 宝生物工程有限公司， pEASY-T1 连接试剂盒购自北京全式金生物技术公司， T4 DNA 连接酶 购自 Promega 公司， 方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体 pHPG 由本实验 改造所得， 基本骨架来自于 CAMBIA 公司的 pCAMBIA1303。 0023 1. 启动子 KT598P 的分离和鉴定 0024 设计克隆启动子 KT598P 所需引物 ： 0025 引物 1 ： 5 -CGggatccTTTAAAACATCTTACTTCTATAG-3 0026 引物 2 ： 5 -GgaattcGGTAAGGTAACAACGAGAGCT-3 0027 引物 1 中序。
23、列 ggatcc 为 BamHI 的酶切位点， 引物 2 中序列 gaattc 为 EcoRI 的酶 切位点， 扩增片段长度为 1000bp。引物 1 的序列如 SEQ ID No ： 2 所示， 引物 2 的序列如 SEQ ID No ： 3 所示。 0028 利用启动子的正反向引物 ( 其中带下划线部分的序列为启动子序列 )， 以植物基 因组 DNA 提取试剂盒 ( 天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司 ) 提取的水稻 ( 中花 11) 基因组 DNA 作为模板， 进行扩增， 反应条件是 ： 95预变性 5 分钟 ； 94变性 30 秒 ； 55退火 30 秒 ； 72延伸 1 分钟 ； 。
24、32 个循环 ； 72延伸 10 分钟。反应结束后， PCR 产物经 1琼脂糖凝 胶电泳检测回收， 产物连入 pEASY-T1， 筛选阳性克隆并进行测序验证， 结果表明 ： 所扩增序 列为预期的 KT598P 启动子序列。 0029 2. 构建表达载体 0030 将测序验证已经插入 KT598P 启动子序列的质粒用 BamHI 和 EcoRI 双酶切， 连入同 样用BamHI和EcoRI双酶切的载体pHPG， 挑取菌落PCR结果为阳性的菌落进行测序， 测序验 证正确后， 提取相应阳性克隆质粒， 命名为 pHPG-KT598P。 0031 菌落 PCR 检测所需引物 ： 0032 引物 3 ： 。
25、5 -TCTCCGCTCATGACGATAAT-3 说 明 书 CN 102876710 B 6 5/5 页 7 0033 引物 4 ： 5 -GACGTAACATGGTGAAGGGG-3 0034 引物 3 和引物 4 为 pHPG 载体上引物， 位于所克隆的启动子片段两侧， 扩增片段约 为启动子的长度， 以阳性克隆菌液为模板， 扩增检测， PCR 反应条件为 ： 95预变性 5 分钟 ； 94变性 30 秒 ； 55退火 30 秒 ； 72延伸 1 分钟 ； 34 个循环 ； 72延伸 10 分钟。 0035 所构建的表达载体的 T-DNA 区的图谱如图 1 所示， 其中 ： LB 和 R。
26、B 分别为 T-DNA 的 左边界和右边界 ； hpt表示潮霉素抗性基因 ； Pnos表示nos基因的启动子 ； Tnos表示nos基 因的终止子 ； GUS 表示 gus 蛋白基因 ； T35s 表示 35s 基因的终止子 ； BamHI 和 EcoRI 分别 表示内切 BamHI 和 EcoRI 的酶切位点 ； 地上组织特异启动子即为本发明通过 PCR 克隆出的 地上组织特异表达启动子。 0036 3. 农杆菌共转化 0037 利用热激法将质粒pHPG-KT598P转入农杆菌AGL0菌株， 利用农杆菌介导法对水稻 进行共转化。 0038 4. 功能鉴定 0039 从转基因植株中分离各组织器。
27、官， 进行 GUS 活性检测， 将各组织器官置于含有 GUS 染色缓冲液的 EP 管中， 放于 37温箱温育过夜， 然后室温条件下在无水乙醇中脱色保存。 0040 4.1 转基因水稻苗的组织器官染色 0041 将水稻 KT598P 转基因苗的组织器官， 如叶片、 茎、 根、 颖壳和花分别进行组织化学 染色， 如图 2 所示， GUS 基因基本上只在植株的地上组织叶片、 茎、 颖壳和花中表达， 其它组 织器官中没有检测出明显的表达活性， 表现出很强的地上组织表达特异性。 说 明 书 CN 102876710 B 7 1/2 页 8 序列表 北京未名凯拓作物设计中心有限公司 一个地上组织特异性表达。
28、启动子的鉴定和应用 2012 3 PatentIn version 3.3 1 1000 DNA 水稻 (Oryza sativa L.ssp.japonica) 1 tttaaaacat cttacttcta tagatattgc tagtcaaaat ggtatctcga aaactgtgtc 60 gaatttcaaa aatactaata atttttaacg gagggagtat agccaactac tacctccaaa 120 tcatatataa tcaatttaat agccaattca tatattagtt acctataaat atatactacc 180 tattaat。
29、atc cggtcccaca acttgtgttg cagctggcta taaatttata gaccgttgtt 240 catctctctt ctttcatatt ctcgatatat gtttatagct ggcttatagt ctgctactgt 300 acatactctt accttaaata aagctataaa tgtgtagcct actgtttatc tctatctttt 360 tttcatcttc tctctatata tatttatagc tggtttaaag tatgctattg tacgtactct 420 taccaagtaa acatcaactc ggcgt。
30、gattg ttctagggtg acctatcttc atgagcggcc 480 gggcatgcag aaccaagcct atccatccat ccagatttga agcgagcatt gcccctgcct 540 gcaatgcaac tttgcttcca aggcggtcaa ggataccgcc ggcgccgacc gcaccctgcc 600 序 列 表 CN 102876710 B 8 2/2 页 9 ctccacctgt aaaacgccac ctcttcaccg ctgccaccac acctctcctc tcctctcctc 660 tcctactagc ggcca。
31、agctt tcaaagccat ggaatagtag tactagtaaa aagcatctct 720 ctctctctct ctacatacat ggcgcctcct cgaaaccctc atataaatat accgcgcctc 780 gttgcctgtg cggcgcccct ctctctctct ctctacagac tacagtgcgt cgtcgtgtct 840 tctctttcct ctattttatc accatccacc gccccattcc tgctctcttc atcttcacct 900 tcacctagct gctgctgctg cttcttcttc ttctatctgc tactagtagc tcgcagaaaa 960 atactcgcct cgatcgacaa gctctcgttg ttaccttacc 1000 2 31 DNA 人工序列 2 cgggatcctt taaaacatct tacttctata g 31 3 28 DNA 人工序列 3 ggaattcggt aaggtaacaa cgagagct 28 序 列 表 CN 102876710 B 9 1/1 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102876710 B 10 。