制备Α半乳糖基神经酰胺化合物的方法.pdf

本发明涉及制备式(I)的α-半乳糖基神经酰胺化合物的方法，包括用式(III)化合物糖基化式(II)化合物的步骤a)。

1.  制备式(I)化合物的方法：

包括步骤a)：优选在路易斯酸存在下，用式(III)化合物糖基化式(II)化合物：

所述步骤a)提供式(IV)化合物：

其中：
-R₁代表线性或支化的、饱和或不饱和的C₁-C₂₀烷基，其是任选经取代的；
-R₂代表线性或支化的、饱和或不饱和的C₁-C₃₀烷基，其是任选经取代的；
-R₃代表C₁-C₆烷基，C₃-C₆环烷基，C₁-C₆酰基或苯甲酰基基团；和R₄代表H或C₁-C₆烷基；或
-R₃和R₄与它们连接的氮原子一起形成C₂-C₆杂环烷基基团或C₁-C₅杂芳基基团；
-PG₁代表羟基官能保护基团；
-PG₂代表伯胺官能保护基团；
-PG₃代表羟基官能保护基团；
-PG’₃代表羟基官能保护基团，任选与PG₃和它们连接的氧和碳原子一起形成C₃-C₆杂环烷基，其是任选经取代的；和
-LG代表离去基团。

2.  根据权利要求1的方法，其中式(I)化合物经由保护基团PG₁、PG₂、PG₃和PG’₃的脱保护和与式R₂COCl(VII)化合物偶联得自式(IV)化合物，其中R₂如权利要求1中所定义。

3.  根据权利要求1的方法，在步骤a)之后包括步骤b)：脱保护式(IV)化合物的保护基团PG₁和PG₂，优选通过在金属催化剂存在下氢解进行，
所述步骤b)提供式(V)化合物：

其中R₁，R₃，R₄，PG₃和PG’₃如权利要求1中所定义。

4.  根据权利要求3的方法，在步骤b)之后包括：
-步骤c)：在碱存在下将式(V)化合物与式R₂COCl(VII)化合物偶联，和
-步骤d)：脱保护在步骤c)中获得的产物的保护基团PG₃和PG’₃，
所述步骤提供式(I)化合物。

5.  根据权利要求1的方法，在步骤a)之后包括步骤b’)：脱保护式(IV)化合物的保护基团PG₁、PG₂、PG₃和PG’₃，优选通过在金属催化剂存在下氢解进行，
所述步骤b’)提供式(VI)化合物：

其中R₁，R₃和R₄如前文权利要求1所定义。

6.  根据权利要求5的方法，在步骤b’)之后包括步骤c’)：在碱存在下，将式(VI)化合物与式R₂COCl(VII)化合物偶联,
所述步骤c’)提供式(I)化合物。

7.  根据权利要求1的方法，其中LG是三氯乙酰亚氨酸酯基团。

8.  根据权利要求1的方法，其中R₁是线性的饱和C₁-C₂₀烷基，优选式-C₁₄H₂₉。

9.  根据权利要求1的方法，其中R₂是线性的饱和C₁-C₂₀烷基，优选式-C₂₃H₄₇。

10.  根据权利要求1的方法，其中：
-R₃是酰基基团，优选式-C(O)CH₃；和
-R₄是H。

11.  根据权利要求1的方法，其中保护基团PG₁是苄基基团，其是任选经取代的。

12.  根据权利要求1的方法，其中保护基团PG₂是羧基苄基基团，其是任选经取代的。

13.  根据权利要求1的方法，其中保护基团PG₃和PG’₃与它们连接的两个氧原子一起形成亚异丙基缩醛基团。

14.  式(II-1)、(II-2)、(IV-2)、(IV-3)、(V)、(VI)和(VIII)的合成中间体：

其中基团R₁，R₃，R₄，PG₁，PG₂，PG₃，PG’₃和LG如权利要求1至13中任一项中所定义。

制备α-半乳糖基神经酰胺化合物的方法
本发明涉及制备一类6"-脱氧-6-氨基α-半乳糖基神经酰胺的方法。
α-半乳糖基神经酰胺化合物(也称为α-GCs化合物)的意义在WO2007/118234中尤其充分地得到解释。α-GCs化合物已被发现在体外和体内均有效地刺激天然杀伤细胞T(NKT)细胞。NKT细胞已牵涉于自身免疫和移植排异反应的抑制、促进对病原体的抗性和促进肿瘤免疫当中。
天然糖脂分子，称为KRN7000，已知在载入CD1d四聚体的情况下刺激NKT细胞。然而，对衍生自海生海绵的KRN7000的供给受到限制并且该糖脂具有在含水或有机溶剂中相对低的溶解度。
从而，制备修饰的α-GC化合物((15Z)-N-[(1S,2S,3R)-1-[[[6-(乙酰氨基)-6-脱氧-α-D-半乳吡喃糖基]氧基]甲基]-2,3-二羟基十七烷基]-15-二十四烯酰胺)(也称为PBS-57)的方法已被开发(合成描述于WO2007/118234)。
所述方法牵涉将氟-糖衍生物(A)与包含酰基不饱和侧链的植物鞘氨醇部分(B)偶联，如下述方案所示：

然而，根据WO 2007/118234的方法具有数种缺点，从而可以难以在工业规模上实施。实际上，所述方法牵涉使用有毒、危险和/或昂贵的试剂比如AgClO₄、SnCl₂、PPh₃、DIAD(二异丙基偶氮二羧酸酯)、DAST(二乙基氨基硫三氟化物)、氢氟酸、DCC(N,N'-二环己基碳二亚胺)、和 钠。另外，需要通过二氧化硅-凝胶柱色谱法进行至少11步纯化，才获得最终产物PBS-57。
这些问题是放大根据WO 2007/118234的方法的主要障碍。
从而，需要开发有效、高适应性、成本更低和安全的制备α-GCs化合物的方法。
本发明的目的之一是，提供制备α-GC化合物的避免使用有毒、危险和/或昂贵的试剂的方法。
本发明的又一目的是，提供制备α-GC化合物的方法，其中步骤数量是受限的。
本发明的又一目的是，提供制备α-GC化合物的方法，其中纯化步骤的数量、特别是二氧化硅-凝胶柱色谱法纯化步骤的数量是受限的。
本发明涉及制备式(I)化合物的方法：

包括步骤a)：优选在路易斯酸存在下，用式(III)化合物糖基化式(II)化合物

所述步骤a)提供式(IV)化合物：

其中：
-R₁代表线性或支化的、饱和或不饱和的C₁-C₂₀烷基，其是任选经取代的；
-R₂代表线性或支化的、饱和或不饱和的C₁-C₃₀烷基，其是任选经取代的；
-R₃代表C₁-C₆烷基，C₃-C₆环烷基，C₁-C₆酰基或苯甲酰基基团；和R₄代表H或C₁-C₆烷基；或
-R₃和R₄与它们连接的氮原子一起形成C₂-C₆杂环烷基基团或C₁-C₅杂芳基基团；
-PG₁代表羟基官能保护基团；
-PG₂代表伯胺官能保护基团；
-PG₃代表羟基官能保护基团；
-PG’₃代表羟基官能保护基团，任选与PG₃和它们连接的氧和碳原子一起形成C₃-C₆杂环烷基，其是任选经取代的；和
-LG代表离去基团。
根据式(I)的化合物是α-半乳糖基神经酰胺衍生物，包含糖部分和脂质部分。
糖部分是半乳糖-类型片段。
脂质部分是神经酰胺-类型片段。
根据本发明的化合物的半乳糖-类型糖部分和神经酰胺-类型脂质部分通过糖基化步骤a)经由在半乳糖部分的C-1位置形成糖苷键连接在一起。
步骤a)的机理可以描述如下。
步骤a)的糖基化反应牵涉经由形成式(II)化合物代表的糖基供体与式(III)化合物代表的糖基受体的糖苷键进行偶联。
糖基供体是糖衍生物，其在C-1位置、也称为异头物的位置具有适宜的离去基团-LG。该离去基团可以在步骤a)的反应条件下被活化和消除，因此余留氧代碳正离子形式的亲电异头碳。
术语"离去基团"是指键异裂时随电子对离去的分子片段。优选，离去基团-LG从式(II)化合物离去形成阴离子或中性分子。离去基团是例如磺酸酯比如三氟甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和甲磺酸酯，卤化物比如碘化物、溴化物、氯化物和氟化物，硝酸酯，磷酸酯和亚氨酸酯，比如任选由卤素原子取代的乙酰亚氨酸酯。
术语"乙酰亚氨酸酯(acetimidate)"是指下式基团：

其中R_i、R_ii和R_iii相同或不同地选自氢原子，氯原子，氟原子和甲基基团。根据一种实施方式，R_i、R_ii和R_iii是相同的并且代表氯原子。
根据一种实施方式，步骤a)在促进碳-LG键裂解和离去基团–LG离去的活化剂存在下进行，这导致形成下述的氧代碳正离子。

根据一种实施方式，步骤a)的糖基化反应的活化剂选自路易斯酸，例如TMSOTf(三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯)和BF₃.Et₂O。
根据一种实施方式，活化剂是TMSOTf。
根据一种实施方式，步骤a)在无水溶剂或溶剂的混合物中进行，例如在四氢呋喃和二乙醚的混合物中。
根据一种实施方式，步骤a)在低温例如0℃至-78℃、优选0℃至-20℃进行。低温有利地限制副产物的形成。
根据一种实施方式，步骤a)在活化的分子筛存在下进行。分子筛有利地促进水的捕集。
根据一种实施方式，在低温例如0℃至-40℃、优选在-20℃将活化剂加至式(II)化合物和式(III)化合物的混合物。然后在大约相同温度搅拌所得混合物至少1小时。
根据一种实施方式，式(II)的离去基团-LG是乙酰亚氨酸酯基团。乙酰亚氨酸酯的使用提供包括易于形成和反应性的许多优势。
根据一种实施方式，式(II)的离去基团-LG是三氯乙酰亚氨酸酯基团。
如式(II)化合物，可以引用具有下式(II-1)的化合物：

其中PG₁、R₃和R₄如前文式(II)中所定义。
糖基受体是包含未保护的亲核羟基基团–OH的化合物，其可以进攻在-LG离去之后形成的氧代碳正离子的碳，允许形成糖苷键，因此产生式(IV)化合物。
步骤a)的反应条件使得保护基团PG₁，PG₂，PG₃和PG’₃保持不变。
虑及PG₁，术语"羟基官能保护基团"是指在至少一个合成步骤期间能够保护游离羟基官能-OH避免反应的基团。羟基官能保护基团是例如乙酰基(Ac)，苄基(Bn)，苯甲酰基(Bz)，甲氧基乙氧基甲基醚(MEM)，二甲氧基三苯甲基，甲氧基甲基醚(MOM)，甲氧基三苯甲基，对-甲氧基苄基醚(PMB)，甲硫基甲基醚，新戊酰基(Piv)，四氢吡喃基(THP)，三苯甲基(Tr)和甲硅烷基醚，比如三甲基甲硅烷基(TMS)，叔丁基二甲 基甲硅烷基(TBDMS)，三异丙基甲硅烷基氧基甲基(TOM)和三异丙基甲硅烷基(TIPS)。
PG₁保护基团旨在在步骤a)期间，和任选地在制备式(II)化合物的步骤期间保护半乳糖部分的羟基基团。
保护基团PG₁是例如苄基基团，其是任选经取代的。
根据一种实施方式，PG₁是式-CH₂-Ph基团。
一般地，上述保护基团的脱保护通过在金属催化剂、例如钯催化剂存在下氢解进行。
如式(II)化合物，可以引用下式(II-2)化合物：

其中LG，R₃和R₄如前文式(II)中所定义。
如式(II-2)化合物，可以引用下式(II-3)化合物：

其中R₃和R₄如前文式(II)中所定义。
虑及PG₂，术语"伯胺官能保护基团"是指在至少一个合成步骤期间能够保护游离氨基官能-NH₂避免反应的基团。伯胺官能保护基团是例如羧基苄基(Cbz)，对-甲氧基苄基羰基(Moz或MeOZ)，叔丁基氧基羰基(BOC)，9-芴基甲氧基羰基(FMOC)，乙酰基(Ac)，苯甲酰基(Bz)，苄基(Bn)，氨基甲酸根基团，对-甲氧基苄基(PMB)，3,4-二甲氧基苄基(DMPM)，对-甲氧基苯基(PMP)，甲苯磺酰基(Ts)和其它磺酰胺类(硝基苯磺酰基&Nps)基团。
PG₂保护基团旨在在步骤a)期间和任选地在制备式(III)化合物的步骤期间保护脂质部分的氨基基团。
保护基团PG₂是例如羧基苄基基团，其是任选经取代的。
一般地，上述保护基团的脱保护在酸性条件下，在酸比如HCl存在下，在选自低级醇溶剂的溶剂中进行。
根据一种实施方式，PG₂是式-C(O)OCH₂-Ph基团。
如式(III)化合物，可以引用下式(III-1)化合物：

其中R₁，PG₃和PG’₃如前文式(III)中所定义。
虑及PG₃和PG’₃，术语"羟基官能保护基团"是指在至少一个合成步骤期间能够保护游离羟基官能-OH避免反应的基团。上述基团的实例如上文所示。
PG₃和PG’₃保护基团旨在在步骤a)期间和任选地在制备式(III)化合物的步骤期间和任选地在基团R₂的引入步骤期间保护脂质部分的羟基基团。
保护基团PG₃和PG’₃旨在保护形成1,2-二元醇部分的两个连位的羟基官能团。这类二元醇基团一般经由形成缩醛基团例如杂环缩醛基团得以保护。1,2-二元醇保护基团的实例是例如丙酮化合物(也称为亚异丙基缩醛)和亚苄基缩醛。
一般地，上述保护基团的脱保护在酸性条件下，在酸比如HCl存在下，在选自低级醇溶剂的溶剂中进行。
根据一种实施方式，保护基团PG₃和PG’₃与它们连接的两个氧原子一起形成亚异丙基缩醛基团。
如式(III)化合物，可以引用下式(III-2)化合物：

其中R₁和PG₂如前文式(III)中所定义。
如式(III-1)和式(III-2)化合物，可以引用下式(III-3)化合物：

其中R₁如前文式(III)中所定义。
根据一种实施方式，PG₁是-CH₂-Ph，也称为-Bn或苄基基团。
如式(IV)化合物，可以引用下式(IV-1)化合物：

其中R₁，R₃，R₄，PG₂，PG₃和PG’₃如前文式(IV)中所定义。
根据一种实施方式，PG₂是-C(O)OCH₂Ph，也称为羧基苄基基团。如式(IV)化合物，可以引用下式(IV-2)化合物：

其中R₁，R₃，R₄，PG₁，PG₃和PG’₃如前文式(IV)中所定义。
根据一种实施方式，保护基团PG₃和PG’₃与它们连接的两个氧原子一起形成亚异丙基缩醛基团。
如式(IV)化合物，可以引用下式(IV-3)化合物：

其中R₁，R₃，R₄，PG₂，PG₃和PG’₃如前文式(IV)中所定义。
如式(IV)化合物，可以引用下式(IV-4)化合物：

其中R₁，R₃，R₄和PG₁如前文式(IV)中所定义。
如式(IV)化合物，可以引用下式(IV-5)化合物：

其中R₁，R₃和R₄如前文式(IV)中所定义。
根据一种实施方式，式(I)化合物经由保护基团PG₁、PG₂、PG₃和PG’₃的脱保护和与式R₂COCl(VII)化合物偶联得自通过步骤a)获得的式(IV)化合物，R₂如式(I)中所定义。
保护基团PG₁，PG₂，PG₃和PG’₃可以按顺序地或同时地脱保护。
根据一种实施方式，PG₁和PG₂被同时脱保护，即在相同步骤中、优选在相同罐中。
根据本发明方法的一种变型，保护基团PG₁和PG₂同时从式(IV)化合物脱保护，而保护基团PG₃和PG’₃保持不变。
根据该变型，本发明方法在步骤a)之后包括步骤b)：脱保护式(IV)化合物的保护基团PG₁和PG₂，优选通过在金属催化剂存在下氢解进行，
所述步骤b)提供式(V)化合物：

其中R₁，R₃，R₄，PG₃和PG’₃如前文式(IV)中所定义。
如式(V)化合物，可以引用下式(V-1)化合物：

其中R₁，R₃和R₄如前文式(V)中所定义。
根据一种实施方式，步骤b)在H₂和钯催化剂例如Pd(OH)₂/炭存在下进行。
根据一种实施方式，步骤b)在二氯甲烷和甲醇的混合物中进行。
根据一种实施方式，步骤b)在室温下进行。
根据该变型，本发明方法在步骤b)之后包括：
-步骤c)：在碱存在下，将通过步骤b)获得的式(V)化合物与式R₂COCl(VII)化合物偶联，和
-步骤d)：脱保护在步骤c)中获得的产物的保护基团PG₃和PG’₃，
所述步骤提供式(I)化合物。
根据一种实施方式，步骤c)在有机碱例如叔胺比如三乙胺存在下进行。
根据一种实施方式，步骤c)在极性溶剂比如四氢呋喃存在下进行。
根据一种实施方式，步骤c)在室温下进行至少一小时。
根据一种实施方式，步骤c)在酸比如HCl存在下，例如在异丙醇中进行。
步骤d)优选在二氯甲烷和甲醇的混合物存在下进行。
根据一种实施方式，步骤c)在20℃至60℃、优选约40℃的温度进行优选至多一小时。
根据本发明方法的又一变型，保护基团PG₁、PG₂、PG₃和PG’₃被同时脱保护，即在相同步骤中但不一定在相同罐中。
根据该又一变型，本发明方法在步骤a)之后包括步骤b’)：脱保护式(IV)化合物的保护基团PG₁、PG₂、PG₃和PG’₃，优选在金属催化剂存在下通过氢解进行，任选随后在酸性条件下处理，
所述步骤b’)提供式(VI)化合物：

其中R₁，R₃和R₄如前文式(IV)中所定义。
根据一种实施方式，步骤b’)在H₂和钯催化剂例如Pd(OH)₂/炭存在下进行。
根据一种实施方式，步骤b’)在二氯甲烷和甲醇的混合物中进行。
根据一种实施方式，步骤b’)在室温下进行至少一小时。
根据一种实施方式，除氢解外，步骤b’)任选包括在酸性条件下，在酸比如HCl存在下，例如在异丙醇中处理的又一步骤。
根据一种实施方式，所述在酸性条件下的处理在二氯甲烷和甲醇的混合物存在下进行。
根据一种实施方式，所述在酸性条件下的处理在20℃至60℃、优选约40℃的温度进行至多一小时。
根据该又一变型，本发明方法在步骤b’)之后包括步骤c’)：在碱存在下，将式(VI)化合物与式R₂COCl(VII)化合物偶联，所述步骤c’)提供式(I)化合物。
根据一种实施方式，步骤c’)在有机碱例如叔胺比如三乙胺存在下进行。
根据一种实施方式，步骤c’)在极性溶剂比如四氢呋喃存在下进行。
根据一种实施方式，步骤c’)在室温下进行至少一小时。
根据一种实施方式，R₁和R₂代表饱和或不饱和的包含至少10个碳原子的长链脂族基团，其是任选经取代的。
在根据本发明的式(I)中，R₁代表线性或支化的、饱和或不饱和的C₁-C₂₀烷基，其是任选经取代的。
根据一种实施方式，R₁是线性基团。
根据一种实施方式，R₁是饱和的基团。
根据一种实施方式，R₁是未取代的基团。
根据一种实施方式，R₁是包含1至20个碳原子的线性的饱和烷基。
根据一种实施方式，R₁包含6至20个碳原子。
根据一种实施方式，R₁包含12至20个碳原子。
根据一种实施方式，R₁包含14个碳原子。
R₁是例如线性的饱和-C₁₄H₂₉基团。
如式(I)化合物，可以引用下式(I-1)化合物：

其中R₂，R₃和R₄如前文式(I)中所定义。
在根据本发明的式(I)中，R₂代表线性或支化的、饱和或不饱和的C₁-C₃₀烷基，其是任选经取代的。
根据一种实施方式，R₂是线性基团。
根据一种实施方式，R₂是饱和基团。
根据一种实施方式，R₂是未取代的基团。
根据一种实施方式，R₂是包含1至30个碳原子的线性的饱和烷基。
根据一种实施方式，R₂包含6至30个碳原子。
根据一种实施方式，R₂包含12至30个碳原子。
根据一种实施方式，R₂包含23个碳原子。
R₂是例如线性的饱和-C₂₃H₄₇基团。
如式(I)化合物，可以引用下式(I-2)化合物：

其中R₁，R₃和R₄如前文式(I)中所定义。
如式(I)化合物，可以引用下式(I-3)化合物：

其中R₃和R₄如前文式(I)中所定义。
术语"烷基"意指饱和或不饱和的脂族烃基团，其可以是直链或支化的、链中具有1至30个碳原子。"支化的"意指一个或低级烷基比如甲基、乙基或丙基连接至线性烷基链。烷基可以用一个或多个"烷基的取代基"取代，上述取代基可以是相同或不同的和包括例如卤代，环烷基，羟基(OH)，烷氧基，氨基(NH₂)，羧基(COOH)。
术语"烷氧基"是指-O-烷基残基。
术语"环烷基"如本文所用包括具有3至6个碳原子的饱和的单环烃基团，其中能够取代的任意环原子可以被取代基取代。环烷基部分的实例包括但不限于环己基和环戊基。
术语"卤代"是指元素周期表17族的原子(卤素)和尤其包括氟，氯，溴，和碘原子。
术语"芳基"是指芳族单环，双环或三环烃环系，其中能够取代的任意环原子可以被取代基取代。芳基部分的实例包括但不限于苯基，萘基和蒽基。
术语"杂环烷基"是指具有1-3个杂原子和2-6个碳原子的非芳族5-7元单环环系，所述杂原子选自O、N或S(例如碳原子和1-3个N、O或S杂原子)，其中能够取代的任意环原子可以被取代基取代。
术语"取代基"是指在烷基、杂环烷基或芳基基团上的任何原子处"取代的"基团。适宜的取代基包括但不限于烷基，烯基，烷氧基，卤代，羟基，氰基，硝基，氨基，SO₃H，酯，酰胺，未经取代的芳基，未经取代的杂芳基，未经取代的杂环烷基和未经取代的环烷基。
术语"杂芳基"是指具有1-4个杂原子和1-5个碳原子的芳族5-6元单环环系，所述杂原子选自O、N或S(例如碳原子和N、O或S的1-3个杂原子)，其中能够取代的任意环原子可以被取代基取代。作为杂芳基，可以引用吡啶基，吡咯基，吡唑基，咪唑基，噁唑基，异噁唑基，噻唑基，异噻唑基，三唑基，呋咱基，四唑基，二嗪基，三嗪基，四嗪基。
在下文描述的反应中，可能需要保护在终产物中希望的反应性官能团例如羟基、氨基、亚氨基、硫基或羧基基团，避免它们不希望地参与反应。常规的保护基团可以按照标准实践使用，例如参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts in Protective Groups in Organic Chemistry,John Wiley and Sons,1991；J.F.W.McOmie in Protective Groups in Organic Chemistry,Plenum Press,1973。
一些反应可以在碱存在下进行。对该反应中所用碱的性质并无特别限制，并且常规用于该类型反应中的任何碱同样可以用于此处，条件是其对分子的其它部分没有不良作用。适宜碱的实例包括：氢氧化钠，碳酸钾，三乙胺，碱金属氢化物比如氢化钠和氢化钾；烷基锂化合物比如甲基锂和丁基锂；和碱金属醇盐比如甲醇钠和乙醇钠。
通常，反应在适宜溶剂中进行。各种溶剂可以使用，条件是对反应或所用的试剂没有不良作用。适宜溶剂的实例包括：烃，其可以是芳族、脂族或环脂族烃，比如己烷、环己烷、苯、甲苯和二甲苯；酰胺，比如N,N-二甲基甲酰胺；醇比如乙醇和甲醇和醚比如二乙醚、甲基叔丁基醚和四氢呋喃。
反应能够在宽范围的温度发生。通常方便的是在0℃至150℃(更优选约室温至100℃)的温度进行反应。反应需要的时间还可以宽范围地变化，取决于许多因素、显著地取决于反应温度和试剂的性质。然而，如果反应是在上述优选条件下进行，那么3小时至20小时的时间段通常已足够。
如此制备的化合物可以通过常规手段从反应混合物回收。例如，化合物可以回收如下：从反应混合物蒸除溶剂，或者如果必需，则从反应 混合物蒸除溶剂之后，将残余物倾入水中，随后用水不可混溶的有机溶剂萃取，从萃取物蒸除溶剂。额外地，如果希望，产物可以通过各种熟知技术比如重结晶、再沉淀或各种色谱技术，尤其是柱色谱法或制备型薄层色谱法进一步纯化。
根据一种实施方式，在根据本发明的化合物中，R₃是酰基基团，有利地为式-C(O)CH₃，也称为乙酰基基团。
根据一种实施方式，在根据本发明的化合物中，R₄是H。
根据一种实施方式，在根据本发明的化合物中，R₃和R₄与它们连接的氮原子一起形成C₁-C₅杂芳基基团，例如吡啶基基团。
术语"酰基"是指烷基羰基，环烷基羰基，芳基羰基，杂环烷基羰基或杂芳基羰基基团，其中任一可以被例如选自烷基和卤素原子的基团进一步取代。
制备式(II)化合物
根据一种实施方式，从式(VIII)化合物经由引入离去基团-LG获得式(II)化合物：

其中R₃，R₄和PG₁如式(II)中所定义。
根据一种实施方式，式(II-1)化合物，其中LG是三氯乙酰亚氨酸酯，在CCl₃CN和碱例如K₂CO₃存在下，在溶剂比如二氯甲烷中，得自式(VIII)化合物。该步骤优选在室温下进行至少一小时、优选至少12小时。
根据一种实施方式，式(VIII)化合物如下得自式(IX)化合物：

经由在包含例如HCl和乙酸的酸性水溶液存在下，优选在50℃至100℃的温度加热处理的步骤，
其中R₃，R₄和PG₁如式(VIII)中所定义。
根据一种实施方式，式(IX)化合物如下得自式(X)化合物：

经由通过保护基团PG₁保护游离羟基基团的步骤，
其中R₃，R₄和PG₁如式(VIII)中所定义。
根据一种实施方式，式(X)化合物如下得自式(XI)化合物：

经由通过R₃和R₄基团官能化游离氨基基团的步骤，
其中R₃和R₄如式(VIII)中所定义。
根据一种实施方式，式(XI)化合物如下得自式(XII)化合物：

根据描述于R.S.Tipson,Methods Carbohydr.Chem.,1963,2,246-250的程序。
化合物(XII)称为1,2,3,4-二-O-亚异丙基-α-D-半乳吡喃糖并且是可商购的，尤其购自Indofine Chemical Company。
化合物(XI)能够根据下述程序得自化合物(XII)。化合物(XII)在含三乙胺和二甲基氨基吡啶的二氯甲烷中用甲苯磺酰氯处理，提供相应的 甲苯磺酸酯，91％收率。甲苯磺酸酯在含四丁基铵碘化物的DMSO中用邻苯二甲酰亚胺基钾处理，提供相应的邻苯二甲酰亚胺，大约100％收率。邻苯二甲酰亚胺在甲醇中用乙酰氯处理，导致醇脱保护和甲基糖苷形成，87％收率。然后，胺(XI)通过在乙醇中用肼处理邻苯二甲酰亚胺而释放。
从式(XII)化合物制备式(IX)化合物还能够从描述于Zhou,X.T.；Forestier,C.；Goff,R.D.；Li,C.；Teyton,L.；Bendelac,A.；Savage,P.B.Org.Lett.2002,4,1267-1270的方法进行调整。
制备式(III)化合物
根据一种实施方式，式(III)化合物如下得自式(XIII)化合物：

经由通过保护基团PG₃和PG’₃保护两个连位羟基基团的步骤，
其中R₁，PG₂，PG₃和PG’₃如式(III)中所定义。
根据一种实施方式，式(XIII)化合物如下得自式(XIV)化合物：

经由通过保护基团PG₂保护游离氨基基团的步骤，
其中R₁和PG₂如式(XIII)中所定义。
根据一种实施方式，式(XIV)化合物具有式(XIVa)：

化合物(XIVa)称为植物鞘氨醇，并且是可商购的，尤其是购自Tokyo Chemical Industry Co.。
从式(XIV)化合物制备式(III)化合物能够从Zhou,X.T.；Forestier,C.；Goff,R.D.；Li,C.；Teyton,L.；Bendelac,A.；Savage,P.B.Org.Lett.2002,4,1267-1270引用的方法进行调整。
根据一种实施方式，化合物R₂COCl(VII)经由将-COOH基团转化为-COCl基团得自式R₂COOH(VIIa)化合物，其中R₂如式(I)所述。
根据一种实施方式，该步骤在亚硫酰氯存在下进行。
根据一种实施方式，该步骤在溶剂比如甲苯中进行。
根据一种实施方式，该步骤在50℃至100℃优选在95℃的温度进行。
本发明也涉及制备式(I)化合物的方法：

包括：
-步骤a)：优选在路易斯酸存在下，用式(III)化合物糖基化式(II)化合物：

提供式(IV)化合物：

-步骤b)：脱保护所述式(IV)化合物的保护基团PG₁和PG₂，优选在金属催化剂存在下通过氢解进行，提供式(V)化合物：

-步骤c)：在碱存在下，将所述式(V)化合物与式R₂COCl(VII)化合物偶联，和
-步骤d)：脱保护在步骤c)中获得的产物的保护基团PG₃和PG’₃，提供式(I)化合物,
其中PG₁，PG₂，PG₃，PG’₃，R₁，R₂，R₃和R₄如前文式(I)中所定义。
本发明也涉及制备式(I)化合物的方法：

包括：
-步骤a)：优选在路易斯酸存在下，用式(III)化合物糖基化式(II)化合物：


提供式(IV)化合物：

-步骤b’)：脱保护所述式(IV)化合物的保护基团PG₁，PG₂，PG₃和PG’₃，优选在金属催化剂存在下通过氢解进行，任选地随后在酸性条件下处理，提供式(VI)化合物：

-步骤c’)：在碱存在下，将式(VI)化合物与式R₂COCl(VII)化合物偶联，所述步骤c’)提供式(I)化合物。
制备化合物(Ia)
本发明也涉及制备式(Ia)化合物的方法：

包括：
-步骤a)：优选在路易斯酸存在下，用式(IIIa)化合物糖基化式(IIa)化合物：


提供式(IVa)化合物：

-步骤b)：脱保护所述式(IVa)化合物的保护基团PG₁和PG₂，优选在金属催化剂存在下通过氢解进行，提供式(Va)化合物：

-步骤c)：在碱存在下，将所述式(Va)化合物与式C₂₃H₄₇COCl(VIIa)化合物偶联，和
-步骤d)：脱保护在步骤c)中获得的产物的保护基团PG₃和PG’₃，提供式(Ia)化合物,
其中LG，PG₁，PG₂，PG₃和PG’₃如前文式(I)中所定义。
本发明也涉及制备式(Ia)化合物的方法：

包括：
-步骤a)：优选在路易斯酸存在下，用式(IIIa)化合物糖基化式(IIa)化合物：

提供式(IVa)化合物：

-步骤b’)：脱保护所述式(IVa)化合物的保护基团PG₁，PG₂，PG₃和PG’₃，优选在金属催化剂存在下通过氢解进行，任选地随后在酸性条件下处理，提供式(VIa)化合物：

-步骤c’)：在碱存在下，将式(VIa)化合物与式C₂₃H₄₇COCl(VIIa)化合物偶联，所述步骤c’)提供式(Ia)化合物，
其中LG，PG₁，PG₂，PG₃和PG’₃如前文式(I)中所定义。
根据一种实施方式，路易斯酸是TMSOTf。
根据一种实施方式，金属催化剂是Pd(OH)₂。
根据一种实施方式，碱是三乙胺。
根据一种实施方式，LG是三氯乙酰亚氨酸酯基团。
根据一种实施方式，PG₁是苄基基团(-Bn)。
根据一种实施方式，PG₂是式-C(O)OCH₂-Ph基团。
根据一种实施方式，PG₃和PG’₃与它们连接的两个氧原子一起形成亚异丙基缩醛基团。
根据一种实施方式，从式(II)化合物和式(III)化合物制备式(I)化合物的方法仅包括通过二氧化硅-凝胶柱色谱法纯化的两个步骤。
根据一种实施方式，本发明方法在步骤a)之后和在步骤b)或步骤b’)之前包括提供二氧化硅-凝胶柱色谱法纯化的第一步骤。
根据一种实施方式，本发明方法在步骤c’)之后包括通过二氧化硅-凝胶柱色谱法纯化的第二步骤。
根据又一实施方式，本发明方法在步骤d)之后包括通过二氧化硅-凝胶柱色谱法纯化的第二步骤。
本发明的制备方法使得能够从式(IIa)化合物制备式(Ia)化合物：

和式(IIIa)化合物：

通过包括仅两个通过二氧化硅-凝胶柱色谱法纯化的步骤的一系列反应。
实施例
制备化合物(Ia)的方法
按照用于临床试验的良好制造规范(Good Manufacturing Practice)制备(Ia)批次。合成步骤的详细描述如下。
制备化合物1
在7个合成步骤之后，甲基6-乙酰氨基-2,3,4-三-O-苄基-α-D-半乳吡喃糖苷(1)制备自可商购的(Indofine Chemical Company)1,2,3,4-二-O-亚异丙基-α-D-半乳吡喃糖(XII)：

-从可商购的(XII)，将醇官能活化为甲苯磺酰基基团，
-通过邻苯二甲酰亚胺部分取代甲苯磺酰基基团，
-裂解保护亚异丙基基团的醇，将异头物位置甲基化和在硅胶上纯化，
-裂解邻苯二甲酰亚胺环，提供游离胺，
-将醇和氨基基团缩醛化，
-裂解乙酰基酯，和
-苄基化羟基基团和最终在硅胶上纯化，提供化合物1。
从化合物(XII)制备1的方法描述于下述方案：

化合物(XII)在含三乙胺和二甲基氨基吡啶的二氯甲烷中用甲苯磺酰氯处理，获得相应的甲苯磺酸酯，91％收率。甲苯磺酸酯在含四丁基铵碘化物的DMSO中用邻苯二甲酰亚胺基钾处理，得到相应的邻苯二甲酰亚胺，大约100％收率。邻苯二甲酰亚胺在甲醇中用乙酰氯处理，导致醇的脱保护和甲基糖苷的形成，87％收率。然后，胺通过在乙醇中用肼处理邻苯二甲酰亚胺得以释放。该胺在乙酸酐和吡啶存在下得以保护，在甲醇中用甲醇钠处理所得化合物将醇脱保护。然后，将醇部分用苄基基团保护，产生化合物1。
制备化合物2

在室温下，将化合物1(1.0当量)，乙酸和6N盐酸依次加至适当的烧瓶。然后在75℃加热反应混合物，通过HPLC监测。在冷却至室温后，在搅拌下加入二氯甲烷然后水。在倾析和分离有机层之后，水层再 次用二氯甲烷萃取。汇集并在40℃减压浓缩有机层，提供粗制化合物2，是褐色油状产物，其直接用于后续操作。
制备化合物3

将油状物2溶于二氯甲烷，在室温下依次加入三氯乙腈(10.0当量)和碳酸钾(5.0当量)。在室温下搅拌反应混合物至少12小时，然后在C盐上过滤。滤液在40℃减压浓缩，提供粗制化合物3，是褐色油状物，其直接用于后续操作。
制备化合物4
在4个合成步骤之后，(2S,3R,4R)-2-苄氧基羰基氨基-3,4-二-O-亚异丙基-1,3,4-十八烷三醇(4)制备自可商购的(Tokyo Chemical Industry Co.)植物鞘氨醇(XIVa)：

-从可商购的(XIVa)作为羧基苄基基团保护氨基官能，
-作为硅烷化的酯保护伯醇，
-作为亚异丙基基团保护两个仲醇，
-裂解硅烷化的酯，最终在硅胶上纯化，提供化合物4。
从化合物(XIVa)制备4的方法描述于下述方案：

在含碳酸氢钠的水和丙酮中将植物鞘氨醇(XIVa)与苄氧基氯化物反应，提供相应的苄基氨基甲酸酯，92％收率。通过在含咪唑的二氯甲烷中与TBDMSCl反应来保护伯醇，提供相应的甲硅烷基醚，94％收率。通过与含对甲苯磺酸的2,2-二甲氧基丙烷反应来保护仲醇，提供相应的丙酮化合物，92％收率。通过在THF中用四丁基铵氟化物处理以除去甲硅烷基醚保护基团，提供醇4，84％收率。
制备化合物5

在氮下，在室温下将粗制化合物3(1.3当量)，THF，化合物4(1.0当量)和二乙醚依次加入适当的烧瓶。加入活化的4A分子筛(1.5当量w/w，相对化合物3)。在氮下在室温下搅拌反应混合物至少一小时，然后冷却至-20℃。滴加三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(0.6当量)，在-20℃搅拌反应混合物至少一小时，然后通过加入三乙胺(2.0当量)猝灭。允许所得悬浮液缓慢达到室温，然后在C盐上过滤。滤液在40℃减压浓缩， 在二氯甲烷中溶剂化，用水洗涤和再次在40℃减压浓缩，提供粗制化合物5，是褐色油状物。
该化合物在二氯甲烷中溶剂化，在硅胶上获得固体沉积物。然后通过色谱法在硅胶上纯化产物，用环己烷和乙酸乙酯的混合物(9/1至6/4，v/v)洗脱。在40℃减压浓缩含有纯产物5的级分之后，获得化合物5，是淡黄色固体。
制备化合物6

将化合物5(1.0当量)，二氯甲烷，甲醇和50％润湿的氢氧化钯20％/炭(0.5当量w/w)依次加入适当的反应器。反应混合物用氮吹扫，然后在室温下置于氢气氛下(1巴)直至反应完成，其通过HPLC监测。在C盐上过滤除去催化剂之后，在25℃减压浓缩滤液，提供白色固体。
在适当烧瓶中，向该白色固体(1.0当量)加入二氯甲烷和甲醇。加入5N氯化氢/异丙醇(5.0当量)，在搅拌下在40℃加热反应混合物15分钟,然后减压浓缩。水解程度通过HPLC确定。在干燥之后，获得化合物6，是黄色固体。
制备化合物7

在室温下，将木蜡酸(1.0当量，可商购的)，甲苯和亚硫酰氯(5.0eq)依次加入适当的烧瓶。将反应混合物加热至95℃，然后在50℃减压浓缩。在与甲苯共蒸三次并干燥之后，获得化合物7，是淡褐色固体。
制备化合物(Ia)

在适当的烧瓶中，将化合物6(1.0当量)与THF混合。在室温下依次加入三乙胺(2.5当量)和化合物7(0.9当量)。在室温下搅拌反应混合物至少一小时，通过HPLC监测。加入二氯甲烷和甲醇(1:1(v/v))的混合物，在40℃减压浓缩反应混合物，提供粗制化合物(Ia)。
粗制产物在二氯甲烷：甲醇(1:1(v/v))中溶剂化，制备硅胶上的固体沉积物。然后通过色谱法在硅胶上纯化产物，用二氯甲烷和甲醇的混合物(9:1至7:3(v/v))洗脱。
在40℃浓缩含有纯化合物(Ia)的级分之后，所得固体在最小体积的甲醇：THF 9:1(v/v)中温热，在溶剂化之后，将其热过滤。产物在室温下沉淀，过滤固体，用甲醇洗涤，在35℃干燥。所得固体用ppi水洗涤，随后在35℃干燥。
然后获得化合物(Ia)，是白色固体。