一种重楼珠心细胞的悬浮培养方法.pdf

本发明公开了一种重楼珠心细胞的悬浮培养方法，该方法包括如下步骤：重楼种子的预处理→重楼珠心细胞的预培养→重楼珠心细胞的悬浮培养→细胞的继代培养，可实现大规模快速生产出有效成分含量高的重楼细胞培养物。

1.  一种重楼珠心细胞的悬浮培养方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)重楼种子的预处理：选取尚未完全成熟的重楼果实，去掉果皮后 先进行浸泡，然后将浸泡后的重楼种子搓去外种皮后，再用升汞溶液进行 消毒，将消毒后的重楼种子用无菌水冲洗后，用滤纸吸干内种皮表面的水 分，再用小刀划伤重楼种子的内种皮，并将划伤内种皮的重楼种子放置一 段时间，使重楼种子内种皮产生爆裂，露出大量重楼珠心细胞；
(2)重楼珠心细胞的预培养：取内种皮产生爆裂的重楼种子，放在超 净工作台上用0.1％的升汞溶液消毒2～4分钟，用无菌水冲洗后，用解剖刀 切取重楼种子的珠心细胞接入液体培养基B5+赤霉素200-600mg/L+KT 1.0-3.0mg/L+IAA 0.5-1.5mg/L中进行25～35天的预培养；
(3)重楼珠心细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部或/ 和下部的重楼珠心细胞和细胞团块，以40～80g·L^-1的接种量转接到 B5+6-BA0.5～2.0mg/L+NAA 0.5～2.0mg/L+2,4-D 1.0～3.0mg/L液体培养基 中进行细胞悬浮培养；
(4)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了40～60天进行第一次继代培 养，以后每隔35～45天继代一次，每次的接种量为30～60g·L^-1；
上述(2)、(3)、(4)步骤中重楼珠心细胞的液体培养条件均为温度20～ 25℃，pH值5.0～7.0，无光照，摇床转速为120～180r·min^-1。

2.  根据权利要求1所述的重楼珠心细胞的悬浮培养方法，其特征在 于：步骤(1)中所述浸泡是指用浓度为1/10⁴的高锰酸钾溶液浸泡24～72 小时。

3.  根据权利要求1或2所述的重楼珠心细胞的悬浮培养方法，其特 征在于：步骤(1)中所述用升汞溶液进行消毒是指放入浓度为0.01％的升 汞溶液中消毒4～7分钟。

4.  根据权利要求1所述的重楼珠心细胞的悬浮培养方法，其特征在于： 步骤(1)中所述将划伤内种皮的重楼种子放置一段时间是指将划伤内种皮 的重楼种子在温度为25～30℃、光照强度为1500～2000lx的条件下放置 3～5小时。

一种重楼珠心细胞的悬浮培养方法
技术领域
本发明涉及一种重楼的组织培养方法，特别是涉及一种重楼珠心细胞 的悬浮培养方法。
背景技术
重楼是名贵中药材之一，其主要有效成分是甾体皂苷。现代药理研究 表明，重楼具有抗肿瘤、止血、止咳平喘、抗菌、抗病毒等作用，其良好 的疗效已被众多的制药工业用于药剂的使用，是云南白药、宫血宁、热毒 清等重要中成药的主要成分。
随着中医药产业的快速发展，重楼药材的需求正以每年20％的幅度递 增，而其野生资源却逐年减少，导致重楼价格迅速上涨，严重制约了制药 企业的产量和质量。当前，重楼主要靠采挖野生资源，由于长期过度采挖, 并缺乏对其生态环境的保护，致使野生重楼资源遭到了毁灭性的破坏,现 己濒临灭绝。
目前重楼主要是靠种子和根茎进行繁殖，由于重楼种子存在种胚发育 不完全，胚乳坚硬，胚轴后熟等明显“双重休眠”特性，因此重楼种子在 播种后通常需要经历两个冬天才能萌发成苗，是典型的“二年生种子”，而 且在自然状态下重楼种子出苗率很低、生长周期长，从出苗到成材需要8-10 年的时间；而使用重楼根茎进行营养繁殖,由于重楼根茎本身就是其药用 有效部位，因此利用根茎切块生产重楼种苗存在用种量大、生产成本高等 问题。
利用生物工程的悬浮培养技术生产药用植物具有周期短、生长速度快 和工业上可利用发酵进行大规模生产等优点。目前还未见任何有关重楼珠 心细胞悬浮培养方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重楼珠心细胞的悬浮培养方法，该方法能 实现重楼珠心细胞的快速增殖，以缓解当前重楼药材资源紧缺的问题。
为达到上述目的，本发明采用的解决方案由如下步骤构成：
(1)重楼种子的预处理：选取尚未完全成熟的重楼果实，去掉果皮后 先进行浸泡，然后将浸泡后的重楼种子搓去外种皮后，再用升汞溶液进行 消毒，将消毒后的重楼种子用无菌水冲洗后，用滤纸吸干内种皮表面的水 分，再用小刀划伤重楼种子的内种皮，并将划伤内种皮的重楼种子放置一 段时间，使重楼种子内种皮产生爆裂，露出大量重楼珠心细胞；
(2)重楼珠心细胞的预培养：取内种皮产生爆裂的重楼种子，放在超 净工作台上用0.1％的升汞溶液消毒2～4分钟，用无菌水冲洗后，用解剖刀 切取重楼种子的珠心细胞接入液体培养基B5+赤霉素200-600mg/L+KT 1.0-3.0mg/L+IAA 0.5-1.5mg/L中进行25～35天的预培养；
(3)重楼珠心细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部或/ 和下部的重楼珠心细胞和细胞团块，以40～80g·L^-1的接种量转接到 B5+6-BA0.5～2.0mg/L+NAA 0.5～2.0mg/L+2,4-D 1.0～3.0mg/L液体培养基 中进行细胞悬浮培养；
(4)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了40～60天进行第一次继代培 养，以后每隔35～45天继代一次，每次的接种量为30～60g·L^-1；
上述(2)、(3)、(4)步骤中重楼珠心细胞的液体培养条件均为温度20～ 25℃，pH值5.0～7.0，无光照，摇床转速为120～180r·min^-1。
进一步地，步骤(1)中所述浸泡是指用浓度为1/10⁴的高锰酸钾溶液 浸泡24～72小时。
进一步地，步骤(1)中所述用升汞溶液进行消毒是指放入浓度为0.01％ 的升汞溶液中消毒4～7分钟。
进一步地，步骤(1)中所述将划伤内种皮的重楼种子放置一段时间是 指将划伤内种皮的重楼种子在温度为25～30℃、光照强度为1500～2000lx 的条件下放置3～5小时。
本发明通过对重楼珠心细胞进行悬浮培养，可实现大规模快速生产出 有效成分含量高的重楼细胞培养物，从而可有效解决当前重楼植物资源和 药材资源短缺的问题。
具体实施方式
实施例1
(1)重楼种子的预处理：选取八月下旬采摘的尚未完全成熟的重楼果 实，去掉果皮后将带外种皮的重楼种子用浓度为1/10⁴的高锰酸钾溶液浸泡 24小时，期间每隔12小时换高锰酸钾溶液一次，取出浸泡后的重楼种子， 搓去外种皮后，放入浓度为0.01％的升汞溶液中消毒4分钟，用无菌水冲洗 2次后，迅速用已消毒的滤纸吸干内种皮表面的水分，接着用小刀划伤重楼 种子的内种皮，并将划伤内种皮的重楼种子在温度为25℃、光照强度为1500 lx的条件下放置3小时，有89.5％的重楼种子内种皮产生爆裂，露出大量 结构较松散的重楼珠心细胞；
(2)重楼珠心细胞的预培养：取内种皮产生爆裂的重楼种子，放在超 净工作台上用0.1％的升汞溶液消毒2分钟，用无菌水冲洗后，用解剖刀切 取结构较松散的重楼珠心细胞接入液体培养基B5+赤霉素200mg/L+KT 1.0mg/L+IAA 0.5mg/L中进行25天的预培养；
(3)重楼珠心细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和 下部的重楼珠心细胞和细胞团块，以40g·L^-1的接种量转接到 B5+6-BA0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+2,4-D 1.0mg/L液体培养基中进行细胞悬浮 培养；
(4)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了40天进行第一次继代培养， 以后每隔35天继代一次，每次的接种量为30g·L^-1；
(5)细胞增殖生长倍数的计算：取继代培养3代的重楼珠心细胞在 3000r/min的离心机上离心5min后，倒掉上清液进行称重，按如下公式计 算出重楼珠心细胞的增殖倍数为2.03倍；
细胞增殖倍数＝(收获量鲜重—接种量鲜重)/接种量鲜重；
上述(2)、(3)、(4)步骤中重楼珠心细胞的液体培养条件均为温度20℃， pH值5.0，无光照，摇床转速为120r·min^-1。
实施例2
(1)重楼种子的预处理：选取八月下旬采摘的尚未完全成熟的重楼果 实，去掉果皮后将带外种皮的重楼种子用浓度为1/10⁴的高锰酸钾溶液浸泡 48小时，期间每隔12小时换高锰酸钾溶液一次，取出浸泡后的重楼种子， 搓去外种皮后，放入浓度为0.01％的升汞溶液中消毒5分钟，用无菌水冲洗 3次后，迅速用已消毒的滤纸吸干内种皮表面的水分，再用小刀划伤重楼种 子的内种皮，并将划伤内种皮的重楼种子在温度为27℃、光照强度为1800 lx的条件下放置4小时，有92％的重楼种子内种皮产生爆裂，露出大量重 楼珠心细胞；
(2)重楼珠心细胞的预培养：取内种皮产生爆裂的重楼种子，放在超 净工作台上用0.1％的升汞溶液消毒3分钟，用无菌水冲洗5次后，用解剖 刀切取结构较松散的重楼珠心细胞接入液体培养基B5+赤霉素 400mg/L+KT 2.0mg/L+IAA 1.0mg/L中进行30天的预培养；
(3)重楼珠心细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部的 重楼珠心细胞和细胞小团块，以60g·L^-1的接种量转接到 B5+6-BA1.0mg/L+NAA 1.5mg/L+2,4-D 2.0mg/L液体培养基中进行细胞悬浮 培养；
(4)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了50天进行第一次继代培养， 以后每隔40天继代一次，每次的接种量为45g·L^-1；
(5)细胞增殖生长倍数的计算：取继代培养3代的重楼珠心细胞在 3000r/min的离心机上离心5min后，倒掉上清液进行称重，按如下公式计 算出重楼珠心细胞的增殖倍数为2.48倍；
细胞增殖倍数＝(收获量鲜重—接种量鲜重)/接种量鲜重；
上述(2)、(3)、(4)步骤中重楼珠心细胞的液体培养条件均为温度22℃， pH值6.5，无光照，摇床转速为150r·min^-1。
实施例3
(1)重楼种子的预处理：选取八月下旬采摘的尚未完全成熟的重楼果 实，去掉果皮后将带外种皮的重楼种子用浓度为1/10⁴的高锰酸钾溶液浸泡 72小时，期间每隔12小时换高锰酸钾溶液一次，取出浸泡后的重楼种子， 搓去外种皮后，放入浓度为0.01％的升汞溶液中消毒7分钟，用无菌水冲洗 4次后，迅速用已消毒的滤纸吸干内种皮表面的水分，再用小刀划伤重楼种 子的内种皮，并将划伤内种皮的重楼种子在温度为30℃、光照强度为2000 lx的条件下放置5小时，有93.5％的重楼种子内种皮产生爆裂，露出大量 重楼珠心细胞；
(2)重楼珠心细胞的预培养：取内种皮产生爆裂的重楼种子，放在超 净工作台上用0.1％的升汞溶液消毒4分钟，用无菌水冲洗6次后，用解剖 刀切取重楼种子的珠心细胞接入液体培养基B5+赤霉素600mg/L+KT  3.0mg/L+IAA 1.5mg/L中进行35天的预培养；
(3)重楼珠心细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和 下部的重楼珠心细胞和细胞团块，以80g·L^-1的接种量转接到 B5+6-BA2.0mg/L+NAA 2.0mg/L+2,4-D 3.0mg/L液体培养基中进行细胞悬浮 培养；
(4)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了60天进行第一次继代培养， 以后每隔45天继代一次，每次的接种量为60g·L^-1；
(5)细胞增殖生长倍数的计算：取继代培养3代的重楼珠心细胞在 3000r/min的离心机上离心5min后，倒掉上清液进行称重，按如下公式计 算出重楼珠心细胞的增殖倍数为1.48倍；
细胞增殖倍数＝(收获量鲜重—接种量鲜重)/接种量鲜重；
上述(2)、(3)、(4)步骤中重楼珠心细胞的液体培养条件均为温度25℃， pH值7.0，无光照，摇床转速为180r·min^-1。
实施例4
将实施例2步骤(1)中重楼种子在高锰酸钾溶液中的浸泡时间改为24 小时，其它步骤同实施例2，重楼珠心细胞的增殖倍数为1.92倍。
实施例5
将实施例2步骤(1)中重楼种子在高锰酸钾溶液中的浸泡时间改为72 小时，其它步骤同实施例2，重楼珠心细胞的增殖倍数为2.06倍。
实施例6
在实施例2步骤(1)中，将划伤内种皮的重楼种子改为放置在30℃的 温度条件下5小时，其它步骤同实施例2，重楼珠心细胞的增殖倍数为1.67 倍。
实施例7
将实施例2步骤(2)中重楼珠心细胞的预培养改为在B5+赤霉素 200mg/L+KT 1.0mg/L+IAA 0.5mg/L的液体培养基中培养25天，其它步骤 同实施例2，重楼珠心细胞的增殖倍数为1.80倍。
实施例8
将实施例2步骤(2)中重楼珠心细胞的预培养基改为B5+赤霉素 600mg/L+KT 3.0mg/L+IAA 1.5mg/L，其它步骤同实施例2，重楼珠心细胞 的增殖倍数为1.59倍。
比较实施例1
在实施例2步骤(1)中，改选完全成熟的重楼果实，其它步骤同实施 例2，重楼种子内种皮产生爆裂情况为0％。
比较实施例2
在实施例2步骤(2)中，取消搓去重楼种子外种皮的环节，其它步骤 同实施例2，重楼种子内种皮产生爆裂情况为0％。
比较实施例3
在实施例2步骤(1)中，将划伤内种皮的重楼种子的放置条件改为在 40℃的温度、光照强度为3000lx的条件下放置7小时，其它步骤同实施例 2，重楼种子内种皮产生爆裂率为94％，但露出的大量结构较松散的重楼珠 心细胞很快出现了死亡。
比较实施例4
将实施例2步骤(2)(重楼珠心细胞的预培养)取消，其它步骤同实 施例2，重楼珠心细胞的增殖倍数为1.03倍。
比较实施例5
将实施例2步骤(2)中的预培养基的基本培养基由B5改为MS，其它 步骤同实施例2，重楼珠心细胞的增殖倍数为1.01倍。
比较实施例6
在实施例2步骤(3)中，改选预培养后处于悬浮培养液下部的重楼珠 心细胞和细胞团块进行悬浮培养，其它步骤同实施例2，重楼珠心细胞的增 殖倍数为1.38倍。
比较实施例7
在实施例2步骤(3)中，改选预培养后处于悬浮培养液上部的重楼珠 心细胞和细胞团块进行悬浮培养，其它步骤同实施例2，重楼珠心细胞的增 殖倍数为1.13倍。
比较实施例8
将实施例2步骤(3)中重楼珠心细胞和细胞小团块的接种量改为10 g·L^-1，其它步骤同实施例2，重楼珠心细胞的增殖倍数为1.04倍。