用于物品光致变色标记 和/或保护物品真实性的方法和制品 本发明涉及一种通过在物品上施加光致变色油墨来保护物品真实性的方法。
用于保护单据或物品真实性的安全措施包括使用合适的安全特征或鉴定标记。在安全措施中使用的光致变色材料在例如US 4927180中已有描述。在已知实例中，通过使用紫外光(UV)可以使光致变色辨别特征可见。但如果仅使用这种难以进行检测的辨别特征，则存在这样一种危险，即用户没有发现缺少辨别特征。由于用UV光，进行真实性检测的检测者的眼睛需要合适的保护。因此认为使用UV光辨别安全特征是不利的。US5807625中描述了类似的现有技术。在本文UV光也用来显现安全特征。
在所述文件中披露的有机光致变色材料具有一般的104-105的转换周期数(switching cycle number)。这限制了用于辨认安全特征的检测方法的可能次数。如果完全使用该材料的话，在例如自动识别机器或入口控制设备中使用所述安全特征所进行的自动测试也因此受到限制。
人们还希望能够辨认出特定批次的标记制品，例如当处于安全目的制备的制品丢失或被非法移动时，能够确定其具体来源。在所述现有技术文献中所公开的安全特征不能用于这类应用。
此外，传统光致变色材料具有以下缺点，其两种转换状态之一没有显著地固有着色。
本发明的一个目的是提供一种漂白过程和消光过程均可使用可见波长范围的光来进行的、视觉可检测的安全特征。以该方式可以使用廉价和普遍可获得的光源，如发光二极管来引发色变。即使使用简单的灯光也可能进行测试，并可用肉眼进行检测。此外，理想地将提供一种安全特征，其转换周期数大于104-105。
本发明的另一目的是提供结构上类似但在着色和/或色变方面不同的各种光致变色材料。
由于不需要过多的技术来证实，故从现有技术已知的安全特征可被定义为低级安全特征，因此本发明的另一目的是提供附加的高级安全特征，而证实这些特征是需要一定技术的，因此对非技术人员来说是不可能的。
WO 98/06084公开了使用核酸分子，尤其是DNA分子，作为不可见的高级安全特征，该分子可用合适的扩增反应，例如使用特异引物的PCR反应检测。
依据本发明，已成功发现一种材料，即细菌视紫红质(BR)，其中例如光致变色的低级安全特征可与高级安全特征，如可辨认各批次的特征组合在一起，该材料已成功用于标记物品和鉴定物品。
权利要求1陈述了依据本发明通过使用含细菌视紫红质的油墨保护物品真实性的方法，在其从属权利要求中描述了该方法的优选改进方法。
依据本发明，上述目的是通过将光致变色油墨施加到物品上，以保护物品真实性的方法实现的，该方法包括使用一种含有作为光致变色部分的至少一种细菌视紫红质变体的光致变色油墨，在用可见波长的光照射时，其中的变体发生视觉上可检测的并可逆转的状态变化，尤其是色变，这可在真实性检测中作为低级安全特征，且在该油墨中除了该低级安全特征，还具有一种或多种不能用视觉检测，只能用仪器分析检测的高级安全特征。
因此本发明涉及光致变色油墨在保护物品真实性方法中的用途。依据本发明所用的油墨含有至少一种细菌视紫红质作为光致变色部分。这种BR变体提供在真实性检测中视觉可检测的低级安全特征，和其固有的仅能用仪器分析方法检测的附加高级安全特征。
光致变色现象指的是物质的一种光引发的可逆状态变化(尤其是颜色变化)，在该过程中起始物质的颜色(吸收光谱)改变。因此可用例如不同波长的光或用热引发反转反应。依据本发明使用细菌视紫红质变体作为光致变色部分，当用可见光范围的光照射时其发生状态变化，因此本发明不需要用UV光照射。其结果是可以免除使用UV光带来的不利因素，尤其是免除了与其相关的设备需求和保护措施。
本发明所用的细菌视紫红质变体优选是那些两种变换状态，特别优选所有变换状态，均带色的变体。
因而本发明的一方面包括一种保护物品真实性的方法，在该方法中将含有作为光致变色部分的细菌视紫红质和/或细菌视紫红质变体的油墨形式的光致变色制品施加到物品上，用可见光波长范围内的光对该光致变色制品照射时可导致在检测真实性时可检测的状态变化，尤其是色变。可检测的状态变化，尤其是色变，优选是可反转的，本发明所用的细菌视紫红质特别具有＞105的转换周期数(即用于检测目的的颜色变化)，更优选＞106，尤其优选＞107。其结果是，在常用手段框架内，可基于低级安全特征重复进行已作真实性保护的物品的安全验证。如果使状态变化不可反转，例如破坏细菌视紫红质的光致变色活性部分，低级安全特征将被取消或使之无效。
真实性检测优选用可见光照射光致变色油墨来实施，其目的是将细菌视紫红质漂白，然后用第二波长范围内的光照射该光致变色油墨，其目的是使细菌视紫红质发生光化学反应，使其反转回到初始状态，或发生热松弛，回复到未漂白状态。可以用肉眼或使用光学仪器观察在漂白和/或消光过程中的光学特性的变化。
术语“低级安全特征”指的是这样一种特征，非专业技术人员不用技术性辅助设备，而可以以简单方式或用技术复杂性低的方法检验其存在或不存在。
另一方面术语“高级安全特征”指的是这样的特征，非专业技术人员不可能检测出其存在或不存在，通常只能由专家用技术复杂性高的方法检验其存在或不存在。
因此低级安全特征是这样一种特征，用小的便宜装置(几个芬尼)对其进行分析，并且任何人都能实施，而高级安全特征是那样一种特征，其分析费用可达几十万德国马克，并且是由专家在实验室中实施的。由于不能用已知技术复制光致变色现象，低级安全特征提供对“普通人”伪造技术的保护。高级安全特征包括针对应用或用户的特殊安全颜色的差别，直到批次编码级别。
例如，细菌视紫红质变体的光致变色现象，即，用可见光照射时发生的色变，是容易被观察者检测到的，其代表一种低安全特征。视觉可检测的低级安全特征的其它例子有含细菌视紫红质的光致变色油墨的各种初始着色，各种光循环或/和变更的动力学行为。
与任何人都能以简单方式发觉的可视的低级安全特征相反，高级安全特征仅在技术复杂的分析仪器的帮助下，即通过仪器分析才能验证。因此验证高级安全特征需要技术辅助设备。因此，例如由于细菌视紫红质序列中的氨基酸替代所产生的变体，其质量与其野生型的偏离可用质谱分析方法进行检测。但也可以通过连上原子或/和分子形成细菌视紫红质的变体，例如由于其不同的质量、碎裂方式或其它不同特性，例如可以用ESR或NMR检测。
氨基酸取代可以提供以下高级安全特征。在利用液相色谱质谱/质谱(例如ESI)的检测中，质谱可测量分子质量的变化或/和碎裂方式中的特征性变化。利用HPLC的检测和吸收或荧光的检测可检测出肽切割的特征性变化，例如使片段数目增加或减少的切割位点的缺失或增加。使用这些方法还可以检测芳香氨基酸数目的变化。可用ELISA或类似方法检测特异单克隆抗体与细菌视紫红质序列或其部分的结合。
通过连接得到的高级安全特征的例子有可用ESR方法检测的自旋标记(spinlabel)，以及通过用稳定同位素(例如13C，15N)标记的蛋白质修饰试剂引入的修饰。
本发明使用的光致变色油墨给物品提供例如光致变色等的低级安全特性和诸如所用细菌视紫红质的序列信息等的高级安全特征保护，例如细菌视紫红质的序列信息可分辨各个批次。
因此本发明的方法给被标记物品提供双重安全保护。低级安全保护容易辨认，因此可容易和快速地进行验证，而高级安全特性是隐藏的安全特征，仅能用复杂的分析方法对其进行检测，且潜在的仿造者和伪造者根本不可能对其进行辨认。由于有极多的高级安全特征可与细菌视紫红质组合，因此潜在的仿造者一开始就不知道是否必须包括或不包括一种特定特征。
该附加安全性能有助于提供针对仿造者的高级保护，同时有利于对物品进行编码，例如具体到制造者或批次的编码。由于是由相同分子提供的，使用细菌视紫红质变体还将低级安全特征和高级安全特征互相不可分地联系在一起。
依据本发明标记的物品可用各种方式进行验证。对于常规验证，如可以在银行实施的验证任何收入钞票，例如可以用简单的方法仅检测低级安全特征。还可以同时验证两种或多种低级安全特征。更详细的检验可验证细菌视紫红质变体的一种或多种高级安全特征。使用两种不同的细菌视紫红质变体或使用一种两次修饰的细菌视紫红质变体可获得至少存在两种高级安全特征。此外，还可以对低级安全特征和高级安全特征进行组合验证。
细菌视紫红质是嗜盐细菌的膜蛋白质。从盐杆菌属(Halobacterium)的微生物可获得大量细菌视紫红质蛋白质。由于其基本的光化学和物理性能，野生型细菌视紫红质是本领域技术人员共知的光致变色材料，其受光激发连续通过中间物的循环系列。在本文中用高度简化的光循环作为光致变色性能的模型，其中仅保留被称作B和M的两种状态。用568nm波长的光照射紫色的B状态，使其转变为黄色的M状态，而该M状态通过吸收412nm波长的光转变为B状态。因此可以用黄绿光漂白细菌视紫红质材料，使紫颜色消失并出现黄颜色。然后可以一直等到由于热松弛而重建紫色，或使用蓝光使细菌视紫红质发生光化学反应，使其重新转变到B状态。在以下出处可以找到所述细菌视紫红质性能的概述：N.N.Vsevolodov，Biomolecular Electronics：An Introduction via Photosensitive Proteins，Birkhuser，Boston，1998和D.Oesterhelt，C.Bruchle，N.Hampp，细菌视紫红质：用于信息处理的生物学材料(Bacteriorhodopsin：A BiologicalMaterial for Information Processing)，Quarterly Review of Biophysics，24(1991)425-478。
本领域技术人员已公知的是大量细菌视紫红质变体具有野生型相同的初始颜色，但是在其光循环的某些动力学中相差却很大。优选的实例是BR-D96N变体，其性能在各种公开出版物中有所描述，例如在A.Miller，D.Oesterhelt，Kinetic Optimization of Bacteriorhodopsin By Aspartic Acid 96 as anInternal Proton Donor，Biochim.Biophys.Acta 1020(1990)57-64。
依据本发明，优选使用可方便地被可见光漂白的细菌视紫红质。已证实波长在500-600nm的范围内是有利的。该细菌视紫红质热松弛后，或被第二波长范围的光照射后可转化到初始状态。所用第二波长范围的有利范围是400到450nm。
M状态的寿命越长，越容易在照射下检测细菌视紫红质可见的漂白。典型地，用在523nm处光输出量小于100mW/cm2的光可使约90％的细菌视紫红质材料漂白。
迄今为止，还没有文献曾描述到如下通过印刷方式应用的和/或在安全性领域中应用的制品，例如涂料，油墨或印刷油墨，其配方中含有细菌视紫红质作为光致变色组份。与所述的传统光致变色材料相比，细菌视紫红质提供以下优点：
1.可用可见波长的光进行色变，
2.两种变换状态都具有可检测的固有着色。
3.可用遗传方法，通过替换氨基酸制备细菌视紫红质的变体。用该方法获得的细菌视紫红质变体与野生型细菌视紫红质在其动力学(BR-D96N)和/或其初始吸收和其光循环(BR-D85N)方面不同。
4.可能的转换周期数大于105。
在盐杆菌属微生物中细菌视紫红质以“紫膜”形式存在。制备和分离紫膜形式细菌视紫红质是本领域公知的(参考，例如EP 0 406 850 B1)。
在野生型中发现以细胞膜二维部分存在的细菌视紫红质，该部分仅由细菌视紫红质和脂质组成。该部分被称作紫膜。在该结构中，细菌视紫红质在热力学方面尤其稳定，对于蛋白质来说，甚至超常地稳定。这对于本发明将细菌视紫红质作为颜料使用的多种技术应用和制品领域是先决条件。因此，依据本发明，特别优选的是使用紫膜形式的BR或/和BR变体。
可以使用野生型的细菌视紫红质，但依据本发明优选的是：光致变色油墨含有至少一种作为光致变色部分的细菌视紫红质变体。细菌视紫红质变体与野生型细菌视紫红质的区别在于至少有一个修饰。优选从以下变体中选择细菌视紫红质变体：功能性变体，序列变体，衍生变体，发色变体，同位素变体或/和自旋标记变体。
细菌视紫红质序列变体还可是细菌视紫红质功能性变体，其可在盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarum)中表达。就此而言，将细菌视紫红质掺入到可被分离的细胞膜中。在某些情况下，所得材料不是二维晶状的，而是细菌视紫红质与膜结合。
通过将各氨基酸进行特定变换来产生细菌视紫红质变体时，可通过在光致变色功能不重要的区域变换氨基酸来制备序列变体。可通过细菌视紫红质编码基因的定位诱变来变换氨基酸。
但现在这就使高级安全特征得以发展，原因在于细菌视紫红质分子中的特定氨基酸变换可用于辨认的目的，因此可成为安全特征。例如通过用20个生物来源氨基酸替换仅4个氨基酸位置，可制备420≈1012可区分的细菌视紫红质材料。
结果是可以不用复杂性高的技术就可制备大量如下的细菌视紫红质分子，其包括具有相同光致变色功能的细菌视紫红质材料，但是互相之间有明显不同，也即是说其氨基酸序列不同。
不用复杂的分析不能检测该附加的高级安全特征。现有技术描述的各种方法仍然能够可靠地检测具有所述修饰的细菌视紫红质材料的组成。在此首先和最主要的可提到质谱分析(参考K.L.Schey，D.I.Papac，D.R.Knapp和R.K.Crouch，Matrix-Assisted Laser Desorption Mass Spectrometry of Rhodopsinand Bacteriorhodopsin，Biophys.，J.63(1992)，1240-1243，P.Hufnagel，U.Schweiger，C.Eckerskorn和D.Oesterhelt，Electrospray Ionization MassSpectrometry of Genetically and Chemically modified Bacteriorhodopsins，Anal.Biochem.243(1996)No.1，46-54，L.E.Ball，J.E.Jr.Oatis，K.Dharmasiri，M.Busman，J.Wang，L.B.Cowde，A.Galijatovic，N.Chen，R.K.Crouch和D.R.Knapp，Mass Spectrometric Analysis of Integral MembraneProteins：Application to Complete mapping of Bacteriorhodopsins andRhodopsin，Protein Sic.7(1998)No.3，758-764)。优选的细菌视紫红质材料组合了低级安全特征，即用视力容易检测的光致变色，和高级安全特征，例如细菌视紫红质本身氨基酸序列的序列变化。
本发明包括的低级安全特征包括：
1.细菌视紫红质材料的各种初始颜色，
2.各种光循环，
3.改变的动力学行为。
本发明的低级安全特征可优选通过使用细菌视紫红质的功能性变体得到，但是也可以用其它的细菌视紫红质变体，例如，细菌视紫红质衍生变体和/或细菌视紫红质发色变体来获得。
术语“细菌视紫红质功能性变体”的含义应当理解为尤其是如下变体，其与野生型细菌视紫红质的区别在于其吸收光谱和/或其光循环。
已知的一种功能性变体的例子有变体D96N，其中位于第96位的天冬氨酸被天冬酰胺替代。这种功能性细菌视紫红质变体和一些其它的变体在H.Otto，T.Marti，M.Holz，T.Mogi，M.Lindau，H.G.Khorana和M.P.Heyn，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86(1989)第9228-9232页和T.E.Thorgeirsson，S.J.Milder，L.J.W.Miercke，M.C.Betlach，R.F.Sband，R.M.Stroud和D.S.Kliger，Biochemistry 30(1991)，第9133-9142页有描述。
术语“细菌视紫红质衍生变体”的含义应当理解为尤其是如下变体，其与野生型细菌视紫红质的区别在于其与分子的共价连接。这种分子具有例如增加细菌视紫红质分子量的任务，目的是在质谱分析中能够鉴定该类的分子，或者这种分子可以是一种有色分子，从而用该方式改变细菌视紫红质的吸收光谱，或者这种分子可以是发荧光的分子，目的是能用该方式观察与细菌视紫红质偶联的荧光。类似地，细菌视紫红质材料还可以共价偶联到聚合物上。这种偶联反应可以依据例如Chignell & Chignell，Biophys.Biochem.Res.Commun.62(1975)，第136-143页和Renthal等，Biochemistry 22(1983)，第5-12页实施。
将合适的染料共价偶联到细菌视紫红质分子上或/和简单地混合被动式染料或颜料(passive dyes or pigments)可以大大影响细菌视紫红质材料或光致变色油墨的初始颜色印象(color impression)，以及漂白状态的颜色印象。在CIE图中可清楚地看见显色混合物的视觉印象。用这种已知方法，技术人员可以确定颜色效果。
可以将连接分子偶联到细菌视紫红质上，反过来又允许进一步将化合物偶联到所述连接分子上。为实现本发明的目的，可连接的分子要达到的目的是增加细菌视紫红质的分子量，由此在质谱分析中能够鉴定该种类的分子。
术语“细菌视紫红质发色变体”的含义应当理解为尤其是细菌视紫红质的如下变体，其与野生型细菌视紫红质的区别在于：其中发色亚视黄基(retinylidene)被除去或替换为另一分子，尤其是“视黄醛类似物”。该视黄醛类似物可通过第216位赖氨酸共价键合到细菌视紫红质上。
因此可通过替换发色亚视黄基进一步制备细菌视紫红质变体。这样获得光物理性能的改变，并可优选使用二氢视黄醛或4-酮视黄醛。
术语“细菌视紫红质同位素变体”的含义应当理解为尤其是如下细菌视紫红质变体，这些细菌视紫红质变体中的一些或全部氨基酸部分或完全被13C或15N标记。这些变体可通过向生长培养基中加入一些标记了的氨基酸得到，或使用整个分子被标记的胨获得。用这种方式标记的化合物可用高分辨率的NMR鉴定。
术语“细菌视紫红质自旋标记变体”的含义应当理解为尤其是如下细菌视紫红质变体，其含有共价键合到细菌视紫红质分子上的自旋标记。这些变体可这样获得，例如将TEMPO(2，2，6，6-四甲基哌啶-N-氧基)或DOXYL(4，4-二甲基噁唑烷-N-氧基)或PROXYL(2，2，5，5-四甲基吡咯烷-N-氧基)的衍生物共价连接到细菌视紫红质材料上。用ESR可检测自旋标记的存在和类型。
术语“细菌视紫红质序列变体”的含义应当理解为尤其是如下细菌视紫红质变体，其与野生型细菌视紫红质的区别在于：其中失去或变换或添加一个或多个氨基酸，但基本上不影响光循环。细菌视紫红质序列变体的例子有D36C或氨基酸附在N端或C端的变体。
将以上所述变体的修饰组合可产生新的优选变体，其结果是可得到大量不同的细菌视紫红质制品。结果获得高级安全特征，因为分析变得非常复杂，同时，基于大量变化可清楚地鉴别各独立批次。
细菌视紫红质变体优选从D36X，D96X和D85X中选取，其中X代表自然界中存在的一种氨基酸。尤其优选的是从D36C，D96N和D85N中选取的BR变体。
尤其优选的是光敏性增加的突变体，尤其是在全息照相中也使用的材料。
除了细菌视紫红质，细菌视紫红质制品还可进一步含有传统的非光致变色颜料或/和荧光染料或/和共价键合到细菌视紫红质上的颜料或/和其它光致变色颜料。通过混合非光致变色颜料或荧光染料与细菌视紫红质，所述颜料或荧光染料可隐藏在安全性标记中。在这样的实施方案中，除了可见光还可进一步有利地使用UV光。
此外，还可以将荧光或磷光分子偶联到细菌视紫红质分子上，由此导致作为附加特征的发射。合适地选择发射位置可在细菌视紫红质材料处于未漂白状态时抑制荧光。如果初始细菌视紫红质吸收位置和荧光或磷光材料的发射位置有很强的重叠，则可以获得以上效果。在该情况下，细菌视紫红质材料吸收发射出的光子，因此不可能用肉眼感受到任何荧光。仅在细菌视紫红质材料被光化学漂白之后才能见到该荧光。
通过例如用微量分析测序完全或部分地确定细菌视紫红质材料的氨基酸序列，或用免疫学方法测定与特定抗体的反应，可以检测所用细菌视紫红质材料的组成。
包括高级安全特征的细菌视紫红质材料优选含有具有如下性质的细菌视紫红质变体：
1、具有特定修饰的氨基酸序列，该序列变化不影响光物理性能，
2、具有共价偶联分子，以及
3、具有标记有13C和/或15N和/或其它同位素的氨基酸
尤其优选的是两种或多种上述细菌视紫红质变体类型的组合。
在本发明的方法中，尤其优选的是使用至少一种具有以下特征的细菌视紫红质变体；
a)与野生型细菌视紫红质相比，形成紫膜形式的蛋白质所需的区域不变，和
b)与野生型细菌视紫红质相比，多肽链的环或/和C端或/和N端包含至少一个氨基酸变换，其中变换包括缺失，添加，插入或/和替代，这种氨基酸变换不改变细菌视紫红质的光致变色性能，该性能是由光致变色区域决定的。
与野生型细菌视紫红质相比，在形成紫膜形式蛋白质所需要的区域中这些细菌视紫红质不变。为了本发明的目的，如果细菌视紫红质仍然能够形成紫膜，尽管在该区域中有小的变化也同样是足够的。
在氨基酸序列中本发明的变化包括在整个多肽链中任何位置处的氨基酸变换，例如缺失，插入，替代和/或添加。尤其优选的是将氨基酸添加到N端或/和C端或/和尤其是位于膜外的多肽链环上。依据本发明所实施的变化用于对高级安全特征进行编码，因此优选不在影响光致变色性能的细菌视紫红质区域实施。当用合适方式实施时，在多肽链的环和/或C端或/和N端处进行的氨基酸变换不改变起始细菌视紫红质的光致变色性能。在此应当注意的是可以使用野生型细菌视紫红质和已经经过修饰的细菌视紫红质作为起始细菌视紫红质，尤其是BR-D96N。
可用于分析的氨基酸变换优选使细菌视紫红质分子的质量改变至少1道尔顿，更优选的是至少10道尔顿，最优选的是多于100道尔顿。为进行分析，可以使用现有技术中的仪器和离子化方法，例如FTMS(傅里叶变换质谱仪)和/或T0F(飞行时间质谱仪)和/或MALDI(基体辅助的激光解吸离子化)和/或ESI(电子喷雾离子化)。
氨基酸的添加/插入尤其包含不超过1000个附加氨基酸，优选不超过100个氨基酸，特别优选的是不超过50个氨基酸，并且至少是一个氨基酸，最优选的是3到20个氨基酸。可以在C端添加至少6个组氨酸，以便用XRF或TXRF通过金属结合检测细菌视紫红质变体的存在。
缺失或替代影响尤其是1到10个氨基酸，尤其优选的是1到4个氨基酸。
优选使用的替代变体是这样的细菌视紫红质变体，其36位上的天冬氨酸残基已被半胱氨酸残基替代(BR变体D36C)。
可用ESI或MALDI-TOF用质谱法确定细菌视紫红质分子的氨基酸序列变体的分子量。在重新计算质谱之后，所研究的物质的摩尔质量可由小到一个质量数的分辨率得到。这种氨基酸序列的变化，例如缺失或插入产生的变化，导致质量数有相当大的改变，可较容易地分析检测到。即使仅有少量的氨基酸被其它的氨基酸替代，所得质量变化也是足以用来分析的。
优选使用这样的细菌视紫红质变体，其中至少一个氨基酸被加到C端。进一步优选的是使用含有至少一个半胱氨酸的细菌视紫红质变体。在另一优选的实施方案中使用至少一种这样的细菌视紫红质变体，其所具有的光循环不同于野生型或/和其初始颜色不同于野生型。
最优选使用这样的细菌视紫红质变体，其具有降低的亮/暗适应性。最大吸收在570nm处(B状态)的细菌视紫红质在暗处缓慢松弛，其半衰期为约10到20分钟，部分成为最大吸收在548nm处的状态，“D”状态。在野生型细菌视紫红质中，在暗处建立的平衡是B状态和D状态之比为约50∶50。在B状态视黄醛具有全反构型。在D状态为13-顺式构型。在曝光时，细菌视紫红质先100％地转化成B状态，从B状态开始光循环，由此产生所需的强色变(吸收峰移动到412nm)。
如果本发明含细菌视紫红质的光致变色油墨或用此标记的物品在相当长的时间存储在暗处，则细菌视紫红质变化到其“暗处适应状态”。如果第一次用光照射将被检查的区域，以此漂白细菌视紫红质，则所述区域看起来象是具有降低的感光性或降低的漂白速率。这是由于部分所用照射光使细菌视紫红质从D状态转化到B状态造成的。如果曾经产生的漂白再次反转，例如用蓝光反转，即，如果紫色的初始状态重新建立，则在紧接此后的进一步曝光中该材料显示出理想的高光敏性。但是，理想的是即使在暗处存储后，光致变色性能在第一次循环中已经出现。为此，具有降低的或完全没有亮/暗适应性的细菌视紫红质变体是优选的用于本发明的材料。
具有降低的或完全没有亮/暗适应性的细菌视紫红质变体可通过使用视黄醛类似物或由具有修饰氨基酸序列的细菌视紫红质变体得到。尤其合适的例子有具有化学修饰发色团的细菌视紫红质，例如13-去甲基-11，14-环氧细菌视紫红质(M.Muradin-Szweykowska等，Rec.：J.R.Neth.Chem.Soc.102(1983)，42-46)。进一步优选的变体是含有13-取代视黄醛，尤其是在13位带有H原子、乙基或丙基的视黄醛的细菌视紫红质(W.Gaertner等，Biochemistry 27(1988)，3497-3502)。在此同样优选使用具有降低光适应性的Arg-82，Asp-85和Asp-212突变体，这在例如M.P.Krebs等的Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)1987-1991中有描述。进一步优选的突变体是Y185F(P.Rath等Biochemistry32(1993)，2272-2281)，和在S.P.Balashow等Biochemistry 32(1993)，10331，10343中及K.Ihara等，Biophys.J.67(1994)，1187，1191中描述的突变体，尤其是Arg-82-Ala和Met-145。一般地，优选使用这样的变体，其在暗处中仍然保持在B状态，并且不改变到D状态。
共价偶联到细菌视紫红质分子上的分子提供高级安全特征的另一种选择。这种分子偶联使得另一种分析方法可行，例如通过检测所连分子的特殊性能或通过检测其质量。所连分子可以是例如生物素和/或抗生物素蛋白或/和洋地黄毒苷。还可以连接可用质谱分别检测的分子。自旋标记分子的偶联，例如TEMPO，DOXYL或PROXYL，可用ESR分析确定，这也可通过用固体有限制地进行。标记有稳定同位素13C和15N的氨基酸可用NMR分析检测。(M.Engelhard，B.Hess，G.Metz，W.Kreutz，F.Siebert，J.Soppa和D.Oesterhelt，High resolutioncarbon-13-solid state NMR of bacteriorhodopsin：assignment of specificaspartic acids and structural implication of single site mutations，Eur.Biophys.J.18(1990)，17-24)。
令人惊讶的是，用于真实性检测的高级安全特征还可以通过使用单体序列已知的聚合分子，并适当地将其偶联至细菌视紫红质分子来获得。在此可使用的聚合分子有例如寡肽，多肽，蛋白质，核酸，肽核酸(PANs)或其它合成的，而不是自然界存在的聚合物。该多肽和蛋白质可含有非蛋白质部分，核酸可含有非核酸部分。该非蛋白质部分和非核酸部分可包括例如糖苷部分，生物素或/和洋地黄毒苷或/和抗生物素蛋白。
因此除了BR之外，还可以将一种或多种别的聚合物与油墨混合，该聚合物提供载有信息的组分，作为另外的高级安全特征，或例如其作用仅是调节标记粘度和其它机械性能。
作为高级安全特征偶联到细菌视紫红质的聚合分子，例如DNA或/和RNA或/和PNA分子或/和所述分子类型的杂合物，可以通过适当的扩增反应，例如用特异的引物进行的PCR反应进行检测。此处的检测包括凝胶电泳大小分析，以及直接的核酸碱基序列测定。可用类似的微量分析序列测定方法分析和检测多肽。由于核酸和多肽的有机合成提供的可能性，还可以使用自然界不存在的序列。
将低级安全特征和高级安全特征组合可提供引人注意的优点。这种组合可以通过例如将作为低级安全特征的细菌视紫红质的光致变色性能与以上所述的一种高级安全特征组合得到。为此目的，尤其有利的是将细菌视紫红质与聚合分子组合使用。但是，细菌视紫红质或细菌视紫红质变体本身也可以作为可分析的聚合分子。虽然存在着大量的变异性，但安全特征仍是不可分的相互连接到一起。此外，除了用细菌视紫红质作为光致变色材料之外，还可使用与其不同的聚合物，其偶联到BR上或/和是一种游离的形式。
本发明保护物品真实性的方法包括将油墨形式或印刷油墨形式的光致变色制品施加到特定的物品上。就此而言，本发明的光致变色制品除了含有作为光致变色部分的野生型细菌视紫红质或/和至少一种细菌视紫红质变体之外，在合适的情况下，还含有合适的辅助物质和/或合适的基材(matix materials)。
辅助物质用在本发明的涂覆过程中：用于避免起泡和改进使用性能，或/和用于稳定：用于使制品材料微囊化和用于保护其不受到紫外线的损害，或/和用于改进可见的光学印象：用于影响例如在细菌视紫红质材料的未漂白和漂白状态中的吸收光谱。这些辅助物质的例子有与油墨简单混合的被动式染料或颜料，目的是获得理想的初始或最终颜色。通过该方式还可以产生混色或/和移动光谱。
使用合适的基材通过物理掺杂或/和共价偶联到基材上或/和随后用化学或光化学方法交联制品材料或基材的方式固定制品材料料。在此，其中的交联包括用戊二醛、转谷氨酰胺酶、(自由基)聚合或/和光化学交联处理。
本发明的光致变色制品可用已知的印刷方法涂覆，例如胶印，丝网印刷，喷墨或打印(pad printing)，通过刷子，喷涂，浸涂或电泳方法进行机械涂覆。本发明的细菌视紫红质材料可被随后的干燥过程固化，且通过后处理可使合成的或生物学的基材不溶。可以应用该制品本身或已经施加了该制品的辅助底材。细菌视紫红质制品可以以微囊化的形式存在。微囊化的颜料制品对于印刷过程尤其适合。
在本发明方法特别优选的实施例中，为了用光致变色油墨标记物品，光致变色油墨被施加到物品上，然后干燥使其固化，并用基材将其固定，通过曝光可以使光致变色制品产生色变。产生色变所需的最小光量可优选通过光致变色制品的pH设定。
此外，优选在物品的尤其是相邻的两个区域A和B进行标记，在其第一区域A用含细菌视紫红质变体的油墨标记，在第二区域B提供一种非光致变色染料，其在未曝光状态下的光谱发射与第一区域相同，但是在曝光后，其显示出的发射与第一区域相比是不同的。此外，还可以在物品的尤其是相邻的两个区域A和B上进行如下标记，用含细菌视紫红质的第一光致变色制品标记第一区域。而在第二区域提供第二光致变色制品，该第二光制变色制品的光敏性与第一制品的不同，因此在未曝光状态下第二区域的光谱发射与第一区域的相同，但是在曝光后，第二区域显示出的发射与第一区域的相比是不同的。第二光致变色制品优选含有野生型的细菌视紫红质或/和不同于第一制品中使用的BR变体的细菌视紫红质变体，并尤其用作为参考色。
本发明还进一步涉及一种光致变色油墨，其含有至少一种，优选至少两种细菌视紫红质变体。优选的细菌视紫红质变体如以上所述，这种类型的光致变色油墨尤其适合于用于保护物品真实性所进行的标记。
本发明的油墨可与本领域技术人员已知的传统的染料组合使用，例如荧光染料，颜料或/和其它光致变色颜料。本发明的含细菌视紫红质材料的油墨可象传统油墨一样使用，除了保护物品的真实性，还可用于装饰和其它特殊效果。
术语“油墨”在此还表示任何书写液体/印刷液体和，当合适时，研细了的应用介质。术语油墨还包括印刷油墨和可用于在物品上印刷的，或一般周于产生印刷物的其它颜料组合物。当用细菌视紫红质材料作油墨时，可以用水或其它溶剂，例如基于醇的溶剂作为溶剂。该油墨优选包含至少两种BR变体。使用至少两种细菌视紫红质变体或使用一种具有至少两个修饰的细菌视紫红质变体给分析提供了有利的效果，所基于的事实是该分析可以是二维的。除了优选的紫膜形式的细菌视紫红质，本发明的油墨还可以包含溶解形式的细菌视紫红质。
溶解形式的细菌视紫红质可由以下方式获得：通过在宿主例如大肠杆菌(E.coli)中表达细菌视紫红质基因，并用加入视黄醛重新构建。还可以从紫膜除去脂类得到细菌视紫红质。为达到该目的，例如将紫膜悬浮液(OD570＜5)与1％在水中或缓冲液中的Triton-X100混合，并用超声波仪微探针连续进行超声处理1小时。离心后所得的上清液含溶解形式的细菌视紫红质。
含BR的光致变色制品可以应用到任何物品上。尤其令人感兴趣的物品的例子有单据，证券，钞票，艺术作品，身份证，衣物，机动车，检验记号，质量封贴等。
因此本发明的另一实施方案涉及具有标记的物品，该标记含有至少一种细菌视紫红质变体。优选用本发明的方法制备所述标记。该标记优选含有如上所述的光致变色油墨。
从以上所解释的内容可知，野生型细菌视紫红质具有低光敏性，因此在通常强度的光源(如日光)下实际上是不可能产生容易被肉眼检测的漂白现象。低光敏性的原因是M状态的半衰期短。但是用合适的手段可以增加野生型细菌视紫红质M状态的半衰期。因此本发明还涉及一种通过将光致变色油墨施加到物品上保护物品真实性的方法，其中包括使用一种光致变色油墨，该油墨含有作为光致变色部分的野生型细菌视紫红质，当用可见光波长范围的光照射时，其发生视觉上可检测的、并可逆转的状态变化，在真实性检测中可作为低级安全特征使用，该油墨进一步含有结合水或/和降低质子利用率(proton availability)的辅助物质。增加野生型细菌视紫红质低光敏性的辅助物质，使得在用于保护真实性的方法中也可以使用野生型细菌视紫红质。在油墨中作为添加剂使用的这些辅助物质的作用是增加野生型细菌视紫红质M状态的半衰期。如果水被几乎完全消除的话，野生型细菌视紫红质M状态的半衰期会增加。因此辅助物质基本上具有结合水和降低质子利用率的目的。合适的辅助物质的例子有含伯氨基或仲氨基的化合物。尤其优选的是用精氨酸或盐酸胍(guanidiniumx HCl)作为辅助物质。这些辅助物质也可以用在细菌视紫红质变体中，以用于增加光敏性。
在本发明用于保护物品真实性的方法中，所用的光致变色油墨优选含有BR变体或BR突变体，该突变体用作高级安全特征信息和/或用于增加光敏性。尤其优选使用含有至少二个修饰的变体，即，其中一个修饰用于增加细菌视紫红质的光敏性，另一修饰是用已知方法可检测到的高级安全特征。
由于低光敏性(在普通照明水平，野生型细菌视紫红质的颜色变化不明显)，单独使用野生型细菌视紫红质的适用性仅是有限的，而且由于野生型细菌视紫红质是普遍可得的，在真实性保护中仅能引起较低的兴趣。但是使用野生型细菌视紫红质和以上所述用于增加光敏性的添加剂的组合可以开发出令人感兴趣的应用。在另一优选实施方案中，以上所述用于增加光敏性的添加剂或其它例如用于调整初始颜色的添加剂、标记等与一种或多种细菌视紫红质变体或细菌视紫红质突变体一起使用。
以下与图1和2相关联的实施例更详细地阐述了本发明。
图1描述了一种真实性检测方法的过程。
图2描述了利用安全特征的复制过程。
实施例1：低级安全特征的检测
用户可容易地检测细菌视紫红质或BR变体的光致变色性能(图1)。被施加到单据1(例如钞票，证券，艺术品或其它有价值的物品)上，并用含有细菌视紫红质变体D96N的制品制备的特征2可根据例如如下事实来检测：当用最大发射在绿光和黄光范围的发光二极管发出的光3照射时，其颜色从紫色变化到黄色。当未完全照射该区域时，在4中尤其容易辨认出来。不进行进一步操作，根据所用制品，在几秒钟到几分钟后重新显现出紫色，并重新建立初始状态。或者，可用最大发射在蓝光范围的发光二极管发出的光5照射，可立刻重现紫色。检测的技术复杂性可以忽略。用户可用肉眼观察色变，也可以用机器进行测量。
实施例2：防止复制
单据1含本发明特征2，在该特征中使用了特定量的光敏细菌视紫红质材料(例如野生型细菌视紫红质)与更高光敏性细菌视紫红质材料(例如细菌视紫红质变体D96N)的组合，该单据在未曝光状态下具有相同颜色的均匀区域(图2)。替代不敏感的细菌视紫红质材料的，还可以使用具有相同颜色的合适染料。如果借助照相复印机3复制所述单据，由于在复制过程中用光照射，光敏性细菌视紫红质材料比周围具有更低感光度的材料更强地被漂白。结果是复制品4将显示低级安全特征5，在该特征中将永久保持其不同颜色。由此可以清楚地辨认出该复制品是复制品。
实施例3：后处理，辅助物质和应用方法
a)其后的交联
底材带有干燥的由基材和细菌视紫红质组成的光致变色层，在此底材上施加40％的戊二醛溶液15分钟。然后用水冲洗该戊二醛溶液。通过这样的处理光致变色层被赋予不溶于水的性能。
b)光化学反应
将10mg紫膜(BR-D96N)细细地分散到4ml可紫外固化的油墨(Schmitt公司的IFS3000)中。用刮刀涂覆该混合物之后，在紫外光下进行过夜固化。
c)应用
丝网印刷
丝网印刷的原理是多孔印刷(porous printing)，类似于掩膜技术。印刷板由设有油墨不能渗透的阻挡层的网眼织物组成。印刷花纹一直是开敞的状态。用刮刀刷涂充满油墨的丝网来进行印刷。在该过程中，油墨被转移到以下的底材上。在一整在搅拌下，将100mg/ml颜料(野生型细菌视紫红质)加入到7.2％PVA溶液(Mowiol 56-98型)中制备丝网印刷油墨。当其流变学性能与标准样品一致时，可以在传统丝网印刷中用所得混合物进行印刷。
胶印
在50℃，将1g紫膜(BR-D96N)搅拌加入到5ml无颜料的油墨(Schmitt，IUF01)中。可用由此获得的混合物进行通常的胶印技术印刷。
d)机械保护
层压
含细菌视紫红质并被施加到底材上的光致变色混合物被一种带有GHQ-120TR型薄膜腔(film pouch)的热层压机(GPM，Mylam9)层压，所用温度范围是90-140℃。
e)辅助物质
防止起泡
在50℃下将PVA(型号Mowiol 56-98，68mg/ml)溶于水中。将冻干形式的紫膜加入到该混合物中，由此获得11mg/ml的浓度。在室温下，将1-辛醇(1％v/v)搅拌加入到该混合物中。在涂覆油墨时形成气泡方面，这样获得的混合物具有改进的性能。
防止紫外辐射
为了保护光致变色颜料，将混合物与以下一种浓度为1-30％，优选3-10％W/W的紫外吸收剂或其衍生物混合：二苯甲酮，羟基萘醌，苯基苯并噁唑，肉桂酯，磺酰胺，氨基苯甲酸酯。
实施例4
一种使用的单据，例如钞票，已设有含细菌视紫红质的安全性标记。在曝光时，安全性标记的颜色从紫色变为黄色。短时间后(约30-60秒)和/或用蓝光波长范围的光曝光后，原有的紫色重新出现。这种类型的使用单据将可防止被违法复制或伪造。
实施例5
类似于实施例4。但是用蓝光波长范围的光曝光，使颜色从黄色变为紫色。曝光后，由于环境光使原有颜色重现。
实施例6
设有紫色带的单据，如合同。用两种掩膜双重印刷得到该色带，这两种掩膜的表现类似于正性和负性。使用两种掩膜使得可以使用两种光敏性不同的油墨制品。当用白光曝光时，光敏性更强的层的颜色从紫色变为黄色，而另一层的颜色如果不是不变，也就是仅稍微改变。这就导致一种颜色反差。由此可以从原先均一区域突出一个单词(例如原始的)或任何其它符号和/或图标顺序。
实施例7
类似于6，但是在此后可被层压的普通纸上或相纸上印刷。将其附着到具有品牌的物品(衣物，如牛仔或类似的)或将其添加到具有品牌的物品上，可以用所述单据保证所述具有品牌的物品的真实性，因此防止被盗版。
实施例8
为了防止单据被非法复制，用如6的方式，用两种掩膜产生表面上同色的区域。在复制中，一部分同色区域发生色变，因此通过不同色区域标记出复制品。