穿心莲内酯衍生物，其制备方法和它们的药物组合物 本发明涉及脱水穿心莲内酯衍生物，制备方法，及含有它们的药物组合物，具体地说，本发明涉及脱水穿心莲内酯双马来酸半酯单钾盐和脱水穿心莲内酯磷酸酯钠盐及制备方法，及含有它们的药物组合物及其在解热和抗病毒方面的临床应用。
穿心莲Andrographis Paniculata(Burm.f.)Nees是临床广泛应用的清热解毒的植物药，已收入中国药典[2000]一部220页；对其引种栽培、有效成分的化学结构分析及其衍生物制备、制剂工艺及药理临床等已有较多研究，多认为其主要有效成分是二萜内酯类化合物，如穿心莲内酯(Andrographolide)、脱水穿心莲内酯(Dehydroandrographolide)等[药学通报，1982年17卷4期；四川省中药研究所：十三种穿心莲针剂的药理作用]。
为提高临床疗效，一般提取穿心莲内酯后，制备各种水溶性衍生物的注射液，如亚硫酸氢钠加成物、磺酸钠加成物和琥珀酸半酯单钾盐等。其中亚硫酸氢钠加成穿心莲内酯和穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐(注射用穿琥宁)已收入药品标准(如四川药品标准)。但是，上述已知药品在解热效果和水中溶解度均不理想。
为了克服上述缺陷，本发明提供式(II)和式(III)化合物及其制备方法及含有它们的药物组合物。本发明的另一目的是式(II)和式(III)化合物作为制备解热消炎剂和抗病毒剂的用途。
制备式(II)化合物的方法：
以穿心莲内酯为原料，在0.01～0.20mpa，60～200℃下与马来酸酐发生酯化反应，回流0.5～10小时生成脱水穿心莲内酯双马来酸半酯，最后在催化剂吡啶作用下与碳酸氢钾生成脱水穿心莲内酯双马来酸半酯单钾盐。
4、式(III)化合物的制备方法：
以穿心莲内酯为原料，用POCl3磷酰化，吡啶为催化剂制备脱水穿心莲内酯磷酸酯，然后和NaOH反应得脱水穿心莲内酯磷酸酯钠盐：
5、本发明的解热与抗病毒活性的药物组合物，包括治疗有效量权利要求1定义的式(II)化合物或权利要求2定义的式(III)化合物作为活性组分和药学上常规的药用载体/或稀释剂。治疗有效量为每日100mg静脉点滴3～4日为一个疗程。
6、式(II)化合物或式(III)化合物用作制备解热消炎剂和抗病毒剂。实施例1：
脱水穿心莲内酯双马来酸半酯单钾盐
(穿马酯)的制备工艺研究11，12-二脱氢-14-脱羟穿心莲内酯-3，19-二马来酸半酯单钾盐
穿心莲内酯2g(0.006mol)，马来酸肝2g(0.041mol)，亚硫酸钠0.2g，置反应瓶中，混匀，安上回流装置和干燥管，开始加热，同时减压至0.01～0.20mpa，100℃，回流反应5小时，冷却后除真空。加40ml水于反应瓶内，充分搅拌至全部固化和析晶疏散为止。抽滤，滤饼常温真空干燥，得脱水穿心莲内酯马来酸半酯粗品3.0g。脱水穿心莲内酯马来酸半酯粗品3.0g置反应瓶中，快速搅拌下，缓缓滴加25％KHCO3水溶液6.0ml，至无气泡产生为止。自然放冷结晶。用无水乙醇重结晶，常温下真空干燥，即得脱水穿心莲内酯马来酸半酯单钾盐1.44g，收率42.3％(以穿心莲内酯计)。(附图谱：图1，脱水穿心莲内酯双马来酸半酯质谱图；图2，脱水穿心莲内酯双马来酸半酯核磁图)
理化性质：微黄色粉末，无臭，味苦。溶于1％NaHCO3水溶液，略溶于稀乙醇，不溶于氯仿或乙醚。250℃不熔化，但开始发黄变色。实施例2：
磷酸酯钠盐的制备工艺研究14-脱羟-11，12-脱氢穿心莲内酯-3，19磷酸酯钠盐：
穿心莲内酯1g(0.01mol)，三氯氧磷2ml，吡啶5ml，三乙烯二氨0.2g，置反应瓶中，混匀，回流加热，搅拌，同时减压至500～650mmHg，50℃以下反应1小时，冷却后除真空，反应液升温至70℃搅拌3小时，加水3ml，和40％NaOH水溶液调ph至7.5，40℃搅拌10小时，直至完全水解。氯仿萃取5次，合并有机相，真空除溶媒，烘干，必要时用硅胶柱层析即得得脱水穿心莲内酯磷酸酯钠盐结晶性粉末0.5g，收率50％(以穿心莲内酯计)。(附图谱：图3，14-脱氧-11，12-脱氢穿心莲内酯-3，19磷酸酯钠盐核磁图；图4，14-脱氧-11，12-脱氢穿心莲内酯-3，19磷酸酯钠盐二维核磁图)
理化性质微黄色粉末，无臭，味苦。溶于水和稀乙醇，不溶于氯仿或乙醚。260℃不熔化，但开始发黄变色。
穿心莲内酯琥珀酸半酯单钾盐又称穿琥宁，临床已有大量研究，证明其有明显的解热、抗炎、促进肾上腺皮质功能及镇静作用，可促进中性粒细胞巨噬细胞的吞噬能力，提高血清中溶菌酶的含量。研究认为，穿心莲内酯化合物以对炎症早期毛细血管通透性增高和渗出、水肿抑制作用为显著，提示穿心莲内酯类化合物是一种新类型的非特异性抗炎药。穿琥宁临床广泛应用于婴幼儿肺炎、病毒性上呼吸道感染、气管炎、流感、钩端螺旋体病及急性细菌性痢疾等，其中以解热效果最为显著。
脱水穿心莲内酯马来酸半酯单钾盐药效学研究表明其解热效果远远高于穿琥宁。
稳定性试验
1、仪器与试剂 仪器 UV-265FW型分光光度计(日本岛津)
试剂 间二硝基苯(上海试剂一厂)，乙醇(北京化工厂)
2、恒温加速试验方法 将样品分别置于97℃、87℃、77℃和67℃的四个恒温箱中，
每隔一定时间取样，按下述方法测定含量。
3、测定方法
3.1对照品(精制脱水穿心莲内酯马来酸半酯单钾盐，纯度为99％)溶液地配制：
取置4℃暗处保存的对照品适量，用稀乙醇溶解成1mg/ml的溶液。
3.2样品(脱水穿心莲内酯马来酸半酯单钾盐)溶液的配制：
取在一定温度下加热一定时间的样品约0.1g，精密称定，置100ml容量瓶中，用稀乙醇稀释至刻度，摇匀。
3.3测定步骤
分别精密量取样品溶液及对照品溶液各5ml，置10ml容量瓶中，加0.5％间二硝基苯乙醇液2ml与0.2mol/L NaOH溶液1ml，用稀乙醇定容。放置3分钟，置1cm吸收池中，在485nm处测定吸收度，以对照品溶液含量为100％计算样品含量。结果如下：
97℃
时间(h) 0 2 4 6 8 10 12 14
含量(％) 99.5 95.4 91.0 87.1 82.7 80.9 77.4 72.6
87℃
时间(h) 0 6 12 18 24 30 36 42
含量(％) 99.5 94.9 92.4 89.5 84.2 81.8 79.1 75.7
77℃
时间(h) 0 12 24 36 48 60 72 84
含量(％) 99.5 96.7 93.9 91.6 89.2 86.6 84.3 82.1
67℃
时间(h) 0 24 48 72 96 120 144 168
含量(％) 99.5 97.3 95.2 92.1 89.7 87.5 85.2 82.8
由以上数据可以求得，K25＝5.328×10-6，t0.9＝2.3年。故有效期可暂定为2年。
穿马酯初步药效学研究
穿马酯对干酵母所致的大鼠发热及内毒素所致的家兔发热均有降低作用，可减轻蛋清所致大鼠足肿胀与二甲苯所致的小鼠腹膜炎，但对金色葡萄球菌和大肠杆菌生长抑制作用不明显。试验结果显示：与穿琥宁注射液相比，穿马酯的解热作用及抗炎作用均较优。急性毒性试验穿马酯ip LD50为699.8mg/kg，iV LD50为411.0mg/kg.
1、试验材料
1.1动物
昆明种小鼠，体重18～22g；wistar大鼠，160～180g，均由河南省实验动物中心提供，合格证号：99010；日本大耳白家兔，2.0-2.5kg，本河南医科大实验动物中心提供。
1.2药品及试剂
穿马酯，北京医工生物技术研究所提供发本明式(II)化合物，批号：0001201，临用前用磷酸盐缓冲液配成注射液。
穿琥宁注射液，中美合资黑龙江制药有限公司，批号：0008100
二甲苯，开封化学四厂，批号：990523。
高活性干酵母，湖北安琪酵母股份有限公司，批号：000412。
伊文思兰，上海化学试剂采购供应站，批号：971103。
金黄色葡萄球菌/大肠杆菌，开封市医学科学研究所微生物室赠。
2、方法与结果
2.1解热作用
2.1.1对干酵母致大鼠发热的影响
大鼠30只，随机分为3组，每组10只，一组给生理盐水，二组给穿琥宁注射液100mg/kg，三组给穿马酯注射液100mg/kg，均ip给药，给药前2.5h大鼠背部皮下给20％新鲜干酵母悬液10ml/kg，测定注射干酵母后3、4、5、7、9、11h时的大鼠体温，结果如下。
表1.穿马酯对干酵母致大鼠发热的影响
剂量 致热后(h) 体温升高℃ (X±SD)组别 (mg/kg) 3 4 5 7 9 11生理盐水 - 0.82±0.33 1.57±0.27 1.88±0.45 2.18±0.32 1.98±0.31 1.48±0.83穿琥宁 150 0.58±0.34 0.90±0.30*** 1.074±0.29** 1.33+±0.44** 1.574±0.59* 1.374-±0.43穿马酯 150 0.254±0.32*** 0.054±0.44*** 0.104±0.43**** 0.454±0.60*** 0.974±0.79*** 1.154±0.35与生理盐水比较*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01与穿琥宁比较 ΔP＞0.05 ΔΔP＜0.05 ΔΔΔP＜0.01
结果：穿琥宁、穿马酯均可抑制干酵母致大鼠发热，但穿马酯的作用时间维持较长，且作用强度明显高于穿琥宁。
2.1.2对内毒素致家兔发热的影响
家兔18只，随机分为3组，每组6只，一组给生理盐水，二组给穿琥宁注射液80mg/kg，三组给穿马酯注射液80mg/kg，均耳缘静脉注射。注射前测量体温1次作0时基础体温，每只家兔均于左耳iV内毒素200mg/kg，随后立即右耳iv相应药物，测量给药后1、2、3、4、6h时各家兔体温，结果如下。
表2. 穿马酯对内毒素致家兔发热的影响
剂量 给药后不同时间(h) 体温升高℃ (X±SD)组别 (mg/kg) 1 2 3 4 6生理盐水 - 1.14±0.17 1.18±0.12 0.90±0.18 0.61±0.10 0.38±0.12穿琥宁 300 0.904±0.19*** 0.79±0.16*** 0.61±0.12*** 0.52±0.13* 0.30±0.08穿马酯 300 0.81±0.16*** 0.78±0.09*** 0.62±0.09*** 0.48±0.08** 0.30±0.08
Δ Δ Δ Δ
与生理盐水比较*P＞0.05 **P＜0.05 ***P＜0.01与穿琥宁比较ΔP＞0.05 ΔΔP＜0.05 ΔΔΔP＜0.01结果：穿琥宁、穿马酯均可抑制内毒素致家兔发热，二药作用时间及强度均无明显差异。2.2抗炎作用2.2.1对二甲苯致小鼠腹膜炎的影响
小鼠36只，随机分为3组，每组12只，一组给生理盐水，二组给穿琥宁注射液200mg/kg，三组给马酯注射液200mg/kg，均sc给药，给药后1h于小鼠尾部iv0.5％的伊文思兰10ml/kg，随后立即于小鼠腹部剪毛处滴二甲苯0.1ml/只。滴二甲苯后30min处死小鼠，剥离腹部皮肤，计分各鼠皮下染兰深度，结果如下：
表3. 穿马酯对二甲苯致小鼠腹膜炎的影响
剂量组别 (mg/kg) 皮肤染色积分生理盐水 - 4.62±0.70穿琥宁 300 2.50±1.12***穿马酯 300 2.44±1.26***Δ
与生理盐水比较*P＞0.05 **P＜0.05 ***P＜0.01与穿琥宁比较ΔP＞0.05 ΔΔP＜0.05 ΔΔΔP＜0.01
结果：穿琥宁、穿马酯均可抑制二甲苯致小鼠腹膜炎，二药作用无明显差异。
2.2.2对蛋清致大鼠足肿胀的影响
大鼠30只，随机分为3组，每组10只，一组给生理盐水，二组给穿琥宁注射液200mg/kg，三组给穿马酯注射液200mg/kg，均sc给药，给药后1h每只大鼠均于左足掌sc新鲜蛋清0.1ml/只，测量注射蛋清1、2、3、4、6h时各鼠足肿胀(排水法，以肿胀后容积减去肿胀前容积为足肿胀)，结果如下。
表4. 穿马酯对蛋清致大鼠足肿胀的影响
剂量 致炎后(h) 足肿胀 (X±SD)组别 (mg/kg) 1 2 3 4 6生理盐水 - 0.77±0.19 0.72±0.17 0.58±0.21 0.51±0.21 0.28±0.14穿琥宁 150 0.37±0.22*** 0.38±0.17*** 0.32±0.19** 0.22±0.14** 0.12±0.09穿马酯 150 0.32±0.15*** 0.30±0.11*** 0.26±0.12*** 0.23±0.10** 0.16±0.00
与生理盐水比较*P＞0.05 **P＜0.05 ***P＜0.01与穿琥宁比较ΔP＞0.05 ΔΔP＜0.05 ΔΔΔP＜0.01结果：穿琥宁、穿马酯均可抑制蛋清致小鼠足肿胀，二药作用时间及强度均无明显差异。2.3对细菌生长的影响
(试管法)将穿琥宁、穿马酯分别制成2％原液，再按1/2，1/4，1/8，1/16，1/32，1/64稀释，制成浓度分别为2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/ml的琼脂试管，接种细菌培养24h后的生理盐水悬液，于37℃孵育18～24h后观察备试管细菌生长情况，结果如下。
表5.穿马酯对细菌生长的影响
穿琥宁(mg/ml) 穿马酯(mg/ml)
菌种 2 1 0.5 0.125 0.0625 2 1 0.5 0.125 0.0625
金葡菌 - + + + + - + + + +
大肠杆菌+ + + + + + + + + +
—无细菌生长+有细菌生长
结果：穿琥宁、穿马酯对细菌生长均无明显抑制作用。
2.4急性毒性试验
2.4.1腹腔注射急性毒性试验
小鼠50只，随机分为5组，每组10只，给药剂量依次为1000、800、640、512、409.6mg/kg。ip一次性给药，观察记录给药后1周内小鼠情况，结果如下。
表6.穿马酯ip急性毒性试验
剂量 死亡(死亡数/实验数)
(mg/kg) 穿琥宁 穿马酯
1000 8/10 9/10
800 7/10 7/10
640 4/10 5/10
512 2/10 3/10
409.6 1/10 1/10
LD50及95％ 739.9 699.8
可信限 646.3～847.0 611.7～800.4
结果：穿琥宁、穿马酯ip的LD50(mg/kg)分别为646.3～847.0、611.7～800.4。
2.4.2静脉注射急性毒性试验
方法同2。4.1，给药方式改为iv，剂量依次为500、400、320、256、204.8mg/kg，结果如下。
表7.穿马酯iv急性毒性试验
剂量 死亡(死亡数/实验数)
(mg/kg) 穿琥宁 穿马酯
500 9/10 9/10
400 6/10 7/10
320 4/10 5/10
256 3/10 2/10
204.8 1/10 1/10
LD50及95％ 420.2 411.0
可信限 366.8～481.5 360.7～468.2结果：穿琥宁、穿马酯iv的LD50(mg/kg)分别为366.8～481.5、360.7～468.2。
穿心莲内酯类化合物具有解热抗炎作用，有些尚有抗菌抗病毒作用，临床多用于治疗病毒性肺炎上呼吸道感染等，疗效确切，不良反应少。本文实验结果表明，穿马酯有明显解热抗炎作用，且其作用强度及持续时间皆优于目前此类化合物中的最好产品穿琥宁，能成为穿心莲内酯类化合物中的新型药物。