《PDE2催化结构域/PDE2特异性抑制剂复合物的晶体及其生长方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PDE2催化结构域/PDE2特异性抑制剂复合物的晶体及其生长方法.pdf（11页珍藏版）》请在专利查询网上搜索。
1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201210545326.3 (22)申请日 2012.12.14 C12N 9/99(2006.01) C12Q 1/44(2006.01) (73)专利权人 上海美迪西生物医药股份有限公 司 地址 201203 上海市浦东新区自由贸易试验 区李冰路 67 弄 5 号楼 (72)发明人 朱坚 王涛 彼得雷瑟 (74)专利代理机构 上海瀚桥专利代理事务所 ( 普通合伙 ) 31261 代理人 曹芳玲 郑优丽 WO 2005083069 A,2005.09.09, CN 1585821 A,2005.02.23, Pandit J. et 。
2、al.Mechanism for the allosteric regulation of phosphodiesterase 2A deduced from the X-ray structure of a near full-length construct.PNAS .2009, 第 106 卷 ( 第 43 期 ), 第 18225-18230 页 . Ying Xu et al.Phosphodiesterase-2 inhibitor reverses corticosterone-induced neurotoxicity and related behavioural chan。
3、ges via cGMP/PKG dependent pathway.International Journal of Neuropsychopharmacology .2012, 第 16 卷第 835-847 页 . Jian Zhu et al.X-ray Crystal Structure of Phosphodiesterase 2 in Complex with a Highly Selective,Nanomolar Inhibitor Reveals a Binding-Induced Pocket Important for Selectivity.J.Am.Chem.Soc。
4、. .2013, 第 135 卷第 11708-11711 页 . 赵新筠等 . 磷酸二酯酶 2（PDE2） 结构及其选 择性抑制剂的研究进展 .有机化学 .2009, 第 29 卷 ( 第 2 期 ), 第 159-165 页 . (54) 发明名称 PDE2 催化结构域 /PDE2 特异性抑制剂复合物 的晶体及其生长方法 (57) 摘要 本发明涉及一种 PDE2 催化结构域 /PDE2 特异性抑制剂复合物的晶体及其生长方法， 该 晶体具有单斜晶系中的空间群 P1， 该晶体具有 晶 格 常 数 ： =109.590.1%,=91.93 0.1%,=90.88 0.1%。 (51)Int.Cl。
5、. (56)对比文件 审查员 王婷 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 序列表2页 附图1页 CN 103865914 B 2016.05.25 CN 103865914 B 1.一种PDE2催化结构域和PDE2特异性抑制剂复合物的晶体， 其特征在于， 该晶体具有 单斜晶系中的空间群P1， 该晶体具有晶格常数： 109.59 0.1, 91.93 0.1,90.88 0.1， 所述PDE2催化结构域 由SEQIDNO:1中列出的氨基酸序列组成， 所述PDE2特异性抑制剂为BAY60-7550化合物， 所述PDE2催化结构域和PDE2特异性抑制剂复。
6、合物的晶体的每个不对称单元中有四个 等同分子， 每个分子的分子量为390.5kD， 溶剂含量为611。 2.根据权利要求1所述的晶体， 其特征在于， PDE2催化结构域的每个结合口袋中结合有 一个PDE2特异性抑制剂分子。 3.根据权利要求2所述的晶体， 其特征在于， PDE2催化结构域由16个 螺旋组成， 在所述 结合口袋的底部有一个Mg2+和一个Zn2+。 4.一种生长根据权利要求13中任一项所述的晶体的方法， 其特征在于， 包括以下步 骤： 1)在缓冲液中制备含8-12mg/ml的PDE2催化结构域蛋白的蛋白缓冲液； 2)混合所述蛋白缓冲液和池液作为结晶溶液， 其中在18混合1 L蛋白缓。
7、冲液和1 L池 液作为结晶溶液； 3)从所述结晶溶液中生长含PDE2催化结构域蛋白的蛋白晶体； 以及 4)将所述蛋白晶体浸泡在含0.5-2mMPDE2特异性抑制剂的池液中以获得PDE2催化结 构域和PDE2特异性抑制剂复合物的晶体； 所述蛋白缓冲液的制备包括： a)将PDE2催化结构域克隆至pET32a原核表达载体； b)将重组载体转化入原核细胞BL21CodonPlus(DE3)中， IPTG诱导蛋白质表达； c)纯化PDE2催化结构域蛋白； 以及 d)将纯化的PDE2催化结构域蛋白浸入缓冲液中， 然后浓缩至8-12mg/ml； 所述缓冲液的pH值为7.5， 并含有25mM的Hepes、 2。
8、5mM的NaCl、 以及2mM的TCEP； 所述池液的pH值为8.5， 并含有0.1M的Tris-HCl、 0.2M的MgCl2、 以及16-20的PEG6000； 所述蛋白晶体通过蒸汽扩散悬滴方法来生长。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103865914 B 2 PDE2催化结构域/PDE2特异性抑制剂复合物的晶体及其生长 方法 技术领域 0001 本发明涉及一种磷酸二酯酶2 （PDE2） 催化结构域/PDE2特异性抑制剂复合物的晶 体， 以及生长该晶体的方法。 背景技术 0002 环腺苷酸 （cAMP） 和环鸟苷酸 （cGMP） 是细胞内信号传导的第二信使分子， 在细胞生 命活动中具有。
9、重要的意义。 其细胞内浓度水平的调控主要由核苷酸环化酶的合成作用与磷 酸二酯酶 （PDE， Phosphodiesterase） 的水解作用来实现。 磷酸二酯酶能催化环磷酸腺苷 （cAMP） 和环磷酸鸟苷 （cGMP） 的磷酸二酯键的水解， 生成无活性的腺苷酸 （AMP） 和鸟苷酸 （GMP） ， 使得细胞内的cAMP和cGMP的水平下降， 从而调控细胞乃至生物体的多种代谢功能。 0003 磷酸二酯酶是一个庞大的蛋白质家族， 迄今共计有11种磷酸二酯酶被鉴定， 命名 为PDE1-PDE11。 磷酸二酯酶家族除了C端的催化结构域相对保守之外， N端的调控域不尽相 同。 一些磷酸二酯酶对cAMP的。
10、水解高度特异 （PDE4、 PDE7、 PDE8） ， 一些是对cGMP的水解高度 特异 （PDE5、 PDE6、 PDE9） ， 磷酸二酯酶2 （PDE2） 则具有混合特异性， 属于双底物磷酸二酯酶， 即、 既能催化水解cGMP和又能水解cAMP。 已有研究表明底物cGMP结合至PDE2的GAFB区激活 该酶的活性。 磷酸二酯酶2 （PDE2） 全长约为940个氨基酸， 由N端的GAFA/GAFB和C端的催化结 构域组成。 0004 PDE2在人体组织中广泛表达， 但在大脑和中枢神经系统中浓度尤为高。 大量研究 揭示了PDE2参与学习、 记忆和认知等过程， 同时抑制PDE2能增强神经元的塑性。
11、和抗抑郁。 也 有研究表明PDE2能改善内皮细胞的渗透性。 PDE2作为潜在的药物靶标， 其抑制剂也可以用 来治疗中枢神经系统疾病、 改善记忆力和内皮细胞的渗透性等。 在这些研究中， 都运用了 PDE2的特异性抑制剂来阐明PDE2的生理功能。 0005 近年来， 随着结构生物学的发展， 利用X射线晶体学已经揭示了越来越多的蛋白质 空间结构。 通过分析蛋白质的空间， 有助于理解蛋白质的生物学功能。 同时， 蛋白是重要的 药物靶标。 利用疾病相关蛋白质的三维结构信息， 可以设计出针对该蛋白质的特异性抑制 剂， 从而达到治疗疾病的目的。 WO2003/038080A公开一种PDE5的晶体以及PDE5。
12、/PDE5配体复 合物的晶体。 已有关于PDE2的全酶和其催化结构域与非特异性抑制剂IBMX的复合物三维结 构的报道(Pandit,J.,etal.ProcNatlAcadSciUSA,2009.106(43):p.18225-30)， 但是 PDE2与特异性抑制剂的三维结构尚未见报道。 由于各PDE家族之间的催化域结构中蛋白质 折叠模式相近， 容纳底物分子的结合口袋形状也相似， 因此了解PDE与特异性抑制剂的相互 作用特征对于开发高选择性的PDE药物分子显得尤为重要。 PDE2与非特异性抑制剂IBMX的 相互结合模式并不能充分提供开发PDE2特异性抑制剂的有用信息。 0006 因此有必要阐明。
13、PDE2与某一种特异性抑制剂的空间结构， 利用该信息可以指导基 于结构的药物设计。 0007 BAY60-7550是一种PDE2的强力抑制剂， 对于PDE2的半数抑制率IC50值为4.7nM。 然 说明书 1/6 页 3 CN 103865914 B 3 而BAY60-7550与PDE2的结合模式尚未阐明。 在本发明之前， 人们无法获知参与PDE2与 BAY60-7550结合的氨基酸残基和相应的结合作用力， 如氢键、 疏水作用力、 范德华力等。 因 缺乏上述信息而无法设计、 生产出针对PDE2的更好的药物分子。 发明内容 0008 面对现有技术存在的问题， 本发明通过对PDE2催化区结构域与其。
14、特异性抑制物 （例如BAY60-7550） 复合物晶体的结构解析， 揭示了PDE2催化结构域与BAY60-7550的空间结 合特征， 基于此获知参与PDE2与BAY60-7550结合的氨基酸残基和相应的结合作用力， 如氢 键、 疏水作用力、 范德华力等。 0009 在此， 一方面， 本发明提供一种PDE2催化结构域/PDE2特异性抑制剂复合物的晶 体， 该晶体具有单斜晶系中的空间群P1， 该晶体具有晶格常数： =109.59 0.1%, =91.93 0.1%,=90.88 0.1%。 0010 本发明通过原子坐标描述的催化结构域晶体结构与其特异性抑制剂复合物的三 维结构， 所述原子结构可通过。
15、该复合物的X-射线晶体学获得。 基于该晶体可获得了关于该 PDE2催化结构域与其特异性抑制剂 （例如BAY60-7550） 相互作用的特征信息。 用于PDE2抑制 剂的鉴定以及这类抑制剂在作为用于治疗中枢神经系统疾病的药物的筛选、 评价。 有望用 于基于结构的药物设计， 0011 0012 较佳地， 在所述晶体中， 一个不对称单元中有四个分子， 每个分子的分子量约为39 0.5kD， 溶剂含量约为611%。 0013 较佳地， 所述晶体的三维结构符合表1限定的三维结构： 0014 表1： 说明书 2/6 页 4 CN 103865914 B 4 0015 0016 修正好的结构显示PDE2催化。
16、结构域中参与和BAY60-7550作用的氨基酸残基有： Gln859,Gln812,Ile826,Phe862,Met847,Ile822,Leu809,Leu770和Ile870等。 0017 较佳地， PDE2催化结构域的结合口袋中结合有一个PDE2特异性抑制剂分子。 0018 较佳地， PPDE2催化结构域由16个 螺旋组成， 在所述结合口袋的底部有一个Mg2+和 一个Zn2+。 0019 在本发明中， 所述PDE2特异性抑制剂可为BAY60-7550化合物， 0020 0021 较佳地， 所述PDE2催化结构域的氨基酸序列来源于人。 0022 较佳地， 所述PDE2催化结构域具有SEQ。
17、IDNO:1中列出的氨基酸序列或其同系物、 片段、 变体。 0023 另一方面， 本发明还提供一种生长上述PDE2催化结构域/PDE2特异性抑制剂复合 物的晶体的方法， 包括以下步骤： 0024 1)在缓冲液中制备含8-12mg/ml的PDE2催化结构域蛋白的蛋白缓冲液； 说明书 3/6 页 5 CN 103865914 B 5 0025 2)混合所述蛋白缓冲液和池液作为结晶溶液； 0026 3)从所述结晶溶液中生长含PDE2催化结构域蛋白的蛋白晶体； 以及 0027 4)将所述蛋白晶体浸泡在含0.1-5mMPDE2特异性抑制剂的池液中以获得PDE2催 化结构域/PDE2特异性抑制剂复合物的晶。
18、体。 0028 又， 所述蛋白缓冲液的制备包括： 0029 a)将PDE2催化结构域克隆至pET32a原核表达载体； 0030 b)将重组载体转化入原核细胞BL21(DE3)CodonPlus中， IPTG诱导蛋白质表达； 0031 c)纯化PDE2催化结构域蛋白； 以及 0032 d)将纯化的PDE2催化结构域蛋白浸入缓冲液中， 然后浓缩至8-12mg/ml。 0033 较佳地， 所述缓冲液的pH值为7.5， 并含有25mM的Hepes （羟乙基哌嗪3硫磺酸） (N- (2-羟乙基)哌嗪-N -(2-乙磺酸)、 25mM的NaCl、 以及2mM的TCEP （三(2-羧乙基)膦盐酸盐） 。 0。
19、034 较佳地， 所述池液的pH值为8.5， 并含有0.1M的Tris （三羟甲基氨基甲烷） -HCl、 0.2M的MgCl2、 以及16-20%的PEG6000。 0035 较佳地， 所述蛋白晶体可通过蒸汽扩散悬滴方法来生长。 0036 本发明通过培养PDE2催化结构域/PDE2特异性抑制剂复合物的晶体并分析其三维 结构示出了PDE2催化结构域与其特异性抑制剂， 例如BAY60-7550的结合特征。 关于PDE2催 化结构域与BAY60-7550的三维结构的信息为设计和生产针对PDE2的中枢神经系统药物小 分子药物 （化学药物） 提供给了一种方式 （基于结构的药物设计） 。 比如， 通过计算。
20、机模拟软 件等可以根据上述信息虚拟筛选、 设计抑制PDE2的小分子药物， 从而达到治疗抑郁、 改善记 忆、 提高认知功能等目的。 或者利用本发明所提及的PDE2催化结构域与BAY60-7550复合物 晶体的晶体结构， 通过计算机模建的方法， 设计出针对PDE2的小分子物质等， 然后合成该种 物质， 与PDE2形成复合物， 再利用X射线晶体衍射的方法分析复合物， 从而获得真实的结合 位点。 根据X射线晶体衍射分析的结果， 可对小分子物质进行调整， 直至获得最优化的物质 分子。 而在本发明之前， 由于缺乏PDE2与选择性抑制剂的结合信息而无法针对性设计、 生产 出针对PDE2的更好的特异性药物。 。
21、附图说明 0037 图1示出一个非对称单元中含有四个等同的PDE2催化结构域与BAY60-7550复合物 分子； 0038 图2示出PDE2催化结构域与BAY60-7550复合物结构总览； 0039 图3示出显示PDE2催化结构域与BAY60-7550结合特征的三维图。 具体实施方式 0040 以下结合附图及下述实施方式进一步说明本发明， 应理解， 下述实施方式和/或附 图仅用于说明本发明， 而非限制本发明。 0041 PDE2催化区结构域的表达和纯化： 0042 PDE2催化区结构域的基因序列表达： 例如， 将PDE2催化结构域基因序列克隆至原 核表达载体pET32a中。 该PDE2催化结构。
22、域基因序列表达后具有如SEQIDNo.1所表明的序 列或其同系物、 片段、 变体。 说明书 4/6 页 6 CN 103865914 B 6 0043 PDE2催化区结构域的蛋白表达： 例如， 重组载体转化入E.coli细胞BL21(DE3) CodonPlus菌株中， 在LB培养基中培养至OD600值为0.60.8时， 加入IPTG诱导蛋白表达； 0044 蛋白纯化， 例如表达蛋白利用Ni-NTA亲和树脂 （Qiagene） 和Superdex200 （GE Healthcare） 树脂等纯化出足够纯度的蛋白用于结晶， 与PDE2共表达的Trx融合蛋白在此过 程中被用TEV酶去除。 0045。
23、 蛋白晶体生长、 复合物结晶： 0046 蛋白缓冲液的制备： 将纯化的蛋白透析浸入缓冲液中， 然后浓缩 （例如使用离心设 备(PALLCorp.)浓缩管浓缩） 至812mg/ml （可按照Bradford测定法测定） 。 所使用的缓冲 液可例如含有25mMHepes(N-(2-羟乙基)哌嗪-N -(2-乙磺酸)， pH7.5， 25mMNaCl， 2mMTCEP （三(2-羧乙基)膦盐酸盐） 。 0047 蛋白晶体生长： 在18混合1 L蛋白质溶液和1 L池液 （reservoirbuffer） 作为结 晶液滴。 所述池液可含有0.1MTris-HCl， pH8.5， 0.2MMgCl2， 1。
24、620%PEG6000。 若干天后， 晶体生长至100200 m大小。 0048 复合物结晶： 将长大的晶体转移浸泡到含有0.52mMBAY60-7550的上述池液中。 浸泡6小时后收集晶体并转移到含有20%甘油的池液中作为冷冻保护， 随后将晶体速冻于液 氮中。 晶体通常能衍射到左右。 应理解， 这里采用BAY60-7550作为PDE2的特异性抑制 剂配体， 但可以采用其它的合适的特异性抑制剂。 0049 数据收集、 处理和模型优化： 0050 在同步辐射装置SSRF的BL17U束线上进行数据收集， 并使用iMOSFLM进行处理。 X射 线波长为每隔1 收集一张衍射图， 共收集180张。 结构。
25、解析使用CCP4软件包中的 MOLREP程序进行分子置换， 采用PDB库中的编号为1Z1L的模型作为模板。 得到初始结构后进 一步在Refmac程序中优化。 在PRODRG服务器产生化合物Bay60-7550的库文件后， 将BAY60- 7550分子构建入相应的电子云密度图中。 复合物结构最终在PHENIX程序中得到优化。 数据 处理统计和结构优化数值如表1所示。 0051 表1： 说明书 5/6 页 7 CN 103865914 B 7 0052 0053 图1中说明解析后的结构显示一个非对称单元中含有四个等同的PDE2催化结构域 与BAY60-7550复合物分子， 图中箭头显示结合于PDE。
26、2催化结构域中的BAY60-7550分子。 0054 图2示出PDE2催化结构域与BAY60-7550复合物结构总览， 该图中显示PDE2催化结 构域由16个 螺旋组成， 在结合口袋底部有一个Mg2+和一个Zn2+。 图3示出显示PDE2催化结构 域与BAY60-7550结合特征的三维图， 该图中显示PDE2催化结构域中参与和BAY60-7550作用 的氨基酸残基有： Gln859、 Gln812、 Ile826、 Phe862、 Met847、 Ile822、 Leu809、 Leu770和 Ile870等。 0055 通过计算机模拟软件等可以根据上述信息虚拟筛选、 设计抑制PDE2的小分子。
27、药 物， 从而达到治疗抑郁、 改善记忆、 提高认知功能等目的。 或者利用本发明所提及的PDE2催 化结构域与BAY60-7550复合物晶体的晶体结构， 通过计算机模建的方法， 设计出针对PDE2 的小分子物质等， 然后合成该种物质， 与PDE2形成复合物， 再利用X射线晶体衍射的方法分 析复合物， 从而获得真实的结合位点。 根据X射线晶体衍射分析的结果， 可对小分子物质进 行调整， 直至获得最优化的物质分子。 说明书 6/6 页 8 CN 103865914 B 8 序列表 SEQIDNO:1 上海美迪西生物医药有限公司 PDE2催化结构域/PDE2特异性抑制剂复合物的晶体及其生长方法 1 P。
28、atentInversion3.5 1 342 PRT 人类 1 SerAspAspGluTyrThrLysLeuLeuHisAspGlyIleGlnPro 151015 ValAlaAlaIleAspSerAsnPheAlaSerPheThrTyrThrPro 202530 ArgSerLeuProGluAspAspThrSerMetAlaIleLeuSerMet 354045 LeuGlnAspMetAsnPheIleAsnAsnTyrLysIleAspCysPro 505560 ThrLeuAlaArgPheCysLeuMetValLysLysGlyTyrArgAsp 657075 Pr。
29、oProTyrHisAsnTrpMetHisAlaPheSerValSerHisPhe 808590 CysTyrLeuLeuTyrLysAsnLeuGluLeuThrAsnTyrLeuGlu 95100105 AspIleGluIlePheAlaLeuPheIleSerCysMetCysHis Asp 110115120 LeuAspHisArgGlyThrAsnAsnSerPheGlnValAlaSerLys 125130135 SerValLeuAlaAlaLeuTyrSerSerGluGlySerValMetGlu 140 145150 ArgHisHisPheAlaGlnAlaIle。
30、AlaIleLeuAsnThrHisGly 序列表 1/2 页 9 CN 103865914 B 9 155160165 CysAsnIlePheAspHisPheSerArgLysAspTyrGlnArgMet 170175180 LeuAspLeuMetArgAspIleIleLeuAlaThrAspLeuAlaHis 185190195 HisLeuArgIlePheLysAspLeuGlnLysMetAlaGluValGly 200205210 TyrAspArgAsnAsnLysGlnHisHisArgLeuLeuLeuCysLeu 215220 225 LeuMetThrSerCy。
31、sAspLeuSerAspGlnThrLysGlyTrpLys 230 235 240 ThrThrArgLysIleAlaGluLeuIleTyrLysGluPhePhe Ser 245 250255 GlnGlyAspLeuGluLysAlaMetGlyAsnArgProMetGluMet 260265270 MetAspArgGluLysAlaTyrIleProGluLeuGlnIleSerPhe 275280285 MetGluHisIleAlaMetProIleTyrLysLeuLeuGlnAsp Leu 290295300 PheProLysAlaAlaGluLeuTyrGluArgValAlaSerAsnArg 305310315 GluHisTrpThrLysValSerHisLysPheThrIleArgGly Leu 320325330 ProSerAsnAsnSerLeuAspPheLeuAspGluGlu 335340 序列表 2/2 页 10 CN 103865914 B 10 图1 图2 图3 说明书附图 1/1 页 11 CN 103865914 B 11 。