技术领域
本发明涉及病毒技术领域，特别涉及一种猪流行性腹泻病毒，还涉及猪流行性腹泻病毒的应用。
背景技术
猪流行性腹泻是以猪了能连续急性肠炎、水样腹泻、脱水和哺乳仔猪高度致死率为特征的一种高度接触性肠道传染病。该病最先流行于欧洲，1988年Hofman等人通过在营养液中添加胰酶，用非洲绿猴肾细胞分离出传代的猪流行性腹泻病毒。1973年，中国首次发现类似TGEV的病毒，但1984年才证实该病毒为PEDV。
从2010年下半年开始，我国全国范围内爆发PEDV，对我国养猪业造成了严重的经济损失。尽管猪流行性腹泻弱毒苗和灭活苗在我国已批量生产投入使用，但近几年来该病的持续流行表明国内疫苗的保护力不高。猪流行性腹泻病毒的细胞培养与分离是疫苗的研制以及各种猪流行性腹泻病毒研究的关键。尽管PEDV的感染率很高，但研究表明，PEDV分离的成功率相当低，甚至已分离的病毒也可能无法进一步在传代细胞培养。
现有技术中也有许多猪流行性腹泻病毒新毒株的记载，但是很多都是通过生物基因技术得到的工程菌株，从自然界分离出的很少。
发明内容
为了解决以上现有技术中猪流行性腹泻病毒大范围爆发、疫苗保护力度不高的问题，本申请提供了一种猪流行性腹泻病毒，具有较强毒性，可用于疫苗研发。
本发明还提供了猪流行性腹泻病毒的应用。
本发明是通过以下步骤得到的：
一种猪流行性腹泻病毒，名称猪流行性腹泻病毒PEDV-SH2016，保藏编号为CGMCC No.15289。
所述的猪流行性腹泻病毒，病毒全基因序列见序列表中序列3。
所述的猪流行性腹泻病毒，其S基因新增了16个氨基酸突变：365E-Q、387V-I、403V-F、429D-A、454S-A、474A-S、542D-E、633E-V、671V-I、763P-L、765Q-K、824T-I、880Y-R、1006N-D、1250D-Y、1363S-A；N蛋白从399aa起连续缺失了12个氨基酸；在ORF3基因新增了4个氨基酸突变即25L-S、66R-T、101A-I、164C-F。
所述的猪流行性腹泻病毒在病毒鉴别诊断及动物疫苗中的应用。
本发明的有益效果：
本研究利用Vero细胞，从发病猪场患病仔猪小肠组织病料中分离获得PEDV野毒株，该毒株具有较强的致病性，通过与不同的PEDV经典毒株和变异毒株的基因序列比对，分析其之间的差异，阐明了流行毒株的遗传变异规律，为研制新型疫苗和鉴别诊断技术奠定了基础。
附图说明
图1为RT-PCR检测SH2016 ORF3基因电泳图谱，
M：DNA marker；泳道1：阴性对照；泳道2：阳性对照；泳道3：SH2016，
图2为病毒生长曲线，
图3为IFA鉴定病毒与单克隆抗体的反应性结果图，
图4为攻毒仔猪典型临床症状，A：发病仔猪粪便；B：濒死仔猪，
图5为攻毒仔猪消化道剖检图，
图6为攻毒仔猪体温与体重变化图，A：体温变化；B：体重变化，
图7为攻毒仔猪空肠病理与免疫组化切片，A:DMEM组HE染色；B：攻毒组HE染色；C：DMEM组免疫组化；D：攻毒组免疫组化。
菌种保藏信息
保藏时间：2018年1月19日，
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，
保藏编号：CGMCC No.15289，
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101，
分类命名：猪流行性腹泻病毒。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：
实施例1
1.1 材料
1.1.1 病料
从上海猪场采集腹泻猪的粪便、小肠等病料，置-70℃保存，备用。
1.1.2细胞
非洲绿猴肾细胞（Vero）为本实验室传代保存。
病毒分离鉴定
1.2.1 病料处理
将疑似病料（小肠组织）剪成小块，加入3~5倍体积的灭菌PBS，剪碎匀浆处理，反复冻融3次，低速离心吸取上清至EP管中，于4℃ 12000rpm离心10min吸取上清备用。
1.2.2 病毒的分离
将收集的上清用0.22µm的滤膜过滤。用含10%胎牛血清的DMEM营养液培养Vero细胞，待细胞长满单层后，弃去营养液，Hank’s液洗涤2次，接种处理好的组织液，同时加入终浓度为6μg/mL的胰酶，37℃吸附1h；弃去组织液，37℃孵育1h，换上无血清的DMEM维持液（胰酶终浓度为6μg/mL）。逐日观察病变，培养3到4天，如果没有病变，反复冻融3次，盲传至80%的细胞出现CPE，冻融三次，收获病毒液。将产生CPE的病毒液继续传代培养，记录产生CPE时间。
1.2.3 PCR鉴定
将收获的病毒液按如下方法提取RNA并反转录为cDNA：
（1）首先吸入200μL病毒液，加入1mL Trizol Plus，剧烈震荡30s，静置5min，4℃，12000rpm 离心10min；
（2）取1mL上清，加入200μL 氯仿，剧烈震荡1min，静置5min，4℃，12000rpm 离心15min；
（3）取上清，加入等体积异丙醇，上下颠倒混匀，静置15min，4℃，12000rpm离心10min；
（4）弃去上清，加入1ml 75%乙醇，将管底沉淀轻轻弹起，上下颠倒几次，4℃，12000rpm 离心10min；
（5）弃去上清，风干，加入20μL DEPC水；
（6）配制反转录体系（10μL）：RNA模板6.5μL，5×RT Buffer 2μL，dNTP Mixture(10mmol/L) 0.5μL，Oligo(dT)18 (25μmol/L) 0.5μL；
（7）70℃水浴5min，置冰水中2min；
（8）加入0.5μL 反转录酶；
（9）42℃水浴1h得到cDNA，置-20℃保存备用。
PCR方法检测是否分离到PEDV，引物由南京金斯瑞公司合成，序列如下：
上游引物ORF3 F: 5’- TCCTAGACTTCAACCTTACG -3’
下游引物ORF3 R: 5’- GGTGACAAGTGAAGCACAGA -3’
按上述方法提取的cDNA，扩增PEDV ORF3基因（632bp）。反应体系如下：
2×Taq plus Master Mix 12.5μL ORF3-F 1μL ORF3-R 1μL cDNA 2μL dd H2O 8.5μL 总计： 25μL
反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸50s，共35个循环，最后72℃终延伸10min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离。
将PCR检测为阳性（见图1）的临床病料（粪便和肠）匀浆，无菌处理后，接种Vero细胞，分离PEDV。2016年9-10月从上海某猪场感染猪的小肠组织中成功分离出猪流行性腹泻病毒，命名为SH2016，PCR检测结果阳性。接种Vero细胞48小时后局部出现细胞融合现象，将细胞毒反复冻融3次后继续传代，第3代即出现明显的细胞病变。
病毒纯化
采用噬斑纯化法对病毒进行纯化，具体方法如下：
（1）将生长状态较好的Vero细胞接种6孔细胞培养板；
（2）将病毒液用DMEM（含6μg/mL的胰酶）从10-1-10-5 作连续10倍稀释；
（3）待细胞长满单层后，用Hank’s液洗涤2次，依次接种稀释好的病毒液，同时设置正常细胞对照孔，37℃，5%CO2温箱中吸附1h，每隔15min晃一次，使病毒液均匀覆盖细胞板；
（4）弃去病毒液，将2%低熔点琼脂糖与含12μg/mL 胰酶的2x DMEM 1:1混合，2ml/孔，加入培养板，注意不要产生气泡，待琼脂冷却后，放入37℃，5%CO2温箱中培养。
（5）每日观察病变，选择病毒蚀斑形态较好的单个斑，用剪好的枪头挑取后置于100μL的DMEM维持液中，反复吹打。
（6）按上述方法将病毒连续纯化3次，保存3~4个病毒蚀斑样品，进行增殖，同时用RT-PCR方法进行检测。
病毒滴度测定
（1）将Vero细胞接种96孔细胞培养板，待80%左右细胞长满单层即可接毒。
（2）将铺好的Vero细胞弃去营养液，用Hank’s液洗涤1遍；
（3）用DMEM将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10；
（4）将稀释好的病毒液接种到96孔细胞培养板中，每一稀释度做8孔重复，每孔接种100µl，同时设置正常细胞作为对照；
（5）37℃，5%CO2温箱中孵育1h，弃病毒液，加维持液（含6μg/mL的胰酶）继续放温箱培养；
（6）逐日观察并记录结果，观察3天。
（7）按Reed-Muench氏法计算结果。
SH在纯化后第2代效价可达106.1 TCID50 /ml。
病毒生长曲线测定
为了研究病毒的生长特性，将病毒接种Vero细胞绘制生长曲线。将分离毒株在Vero细胞上进行连续传代，取不同代次的病毒液，按200TCID50的病毒量分别接种Vero细胞，37℃吸附1h后弃去病毒液，加入维持液（含6μg/mL的胰酶）继续培养。每隔6h取样，直至接种后36h。不同时间点收集病毒的TCID50，每个时间点进行3次重复测定，根据测定结果绘制病毒在Vero细胞上的生长曲线，见图2。
全基因的PCR扩增、克隆与基因测序
根据GenBank 公布的PEDV CV777基因序列，应用Primer5软件，设计分段扩增全基因的引物，引物由南京金斯瑞公司合成，引物序列见表2-1。 将分离到的病毒液按本章1.2.3的方法提取RNA，反转录为cDNA，分别扩增各段基因。胶回收后，将回收的片段与pEASY-Blunt 载体在25℃条件下连接，转化感受态细胞中，挑取可疑菌落培养4h，用M13引物进行菌液PCR鉴定，菌液PCR鉴定阳性的菌液送南京金斯瑞公司测序。
根据GenBank公布的PEDV CV777基因序列设计引物，通过RT-PCR扩增和序列测定获得PEDV SH株的全基因序列，基因序列符合变异毒株的特征，全基因序列见序列表中序列3。遗传进化树显示，本株病毒属于G2b亚群（变异毒株），与中国BJ2011-1和越南HUA-14PED96毒株亲缘关系最近。
全基因核苷酸和编码氨基酸序列比对分析
用DNAstar EditSeq软件将PEDV基因序列翻译为氨基酸序列。将分离毒株基因序列推导的氨基酸与参考序列采用BioEdit软件进行比对分析。
基因序列分析表明，与近几年国内外分离到的变异毒株相比，该分离毒株均在S基因新增了16个氨基酸突变，引起了S蛋白抗原表位和糖基化位点发生改变；N蛋白从399aa起连续缺失了12个氨基酸；在ORF3基因新增了4个氨基酸突变。
由于N蛋白缺失12个氨基酸（36bp），可利用real-time PCR方法鉴别诊断其他毒株和该毒株。
实验：
为了鉴定病毒与单克隆抗体的反映性，用实验室制备的单克隆抗体McAb1、McAb2和McAb3进行IFA。其中McAb1针对表位为N蛋白398HEEA IYDDV406，位于SH2016 N蛋白缺失部位。
方法
（1）用Vero细胞铺96孔细胞板，待80%-90%细胞长满单层，用Hank’s洗一遍；
（2）用维持液（含终浓度为8ug/mL的胰酶）将病毒进行10倍比稀释，从10-1-10-3；
（3）弃掉96孔板里的洗液，每孔加入100μL 10-3稀释倍数的病毒液，设置未接毒阴性对照组，在37℃，4% CO2温箱中孵育1h；
（4）弃掉病毒液，加入100μL维持液，在37℃，4% CO2温箱中培养；
（5）30%细胞出现病变，将细胞板用PBS洗3遍，用吸水纸吸干，每孔加入100μL 4% 多聚甲醛，室温，固定20min；
（6）用PBS洗3遍，吸干，每孔加入100μL 0.1% Triton，室温20min；
（7）用PBS洗3遍，吸干，每孔加入100μL用 2%BSA 1:250稀释的PEDV单抗，37℃，孵育1.5h；
（8）用PBS洗3遍，FITC羊抗鼠二抗1：250倍稀释，每孔加入50μL，37℃孵育1h(全部避光)；
（9）用PBS洗3遍，加入100μl PBS，荧光显微镜下观察。
结果见图3：3株单克隆抗体与SH2016反应，而单克隆抗体1不能与其反应，可以作为鉴别诊断使用。
动物攻毒试验
选用9只3日龄无母源抗体哺乳仔猪，随机分为两组，实验组5头，对照组4头。实验组口服3×105 TCID50PEDV SH 2016病毒液，同时设定DMEM对照组。攻毒后观察临床症状，排泄物形态，每天测定体温、体重，记录存活时间。在攻毒前后每天采集各组试验仔猪的肛拭子，用Real Time PCR检测PEDV的载量。采集攻毒前、后各试验组的血液，分离血清，测定中和抗体活性。
在试验期间，对试验中死亡及试验结束后的猪进行病理剖检，观察肺、脾、肾、胃、肠、腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结等组织脏器病理变化，采集组织样品，制作病理组织切片。
1.9.1临床观察
攻毒组仔猪接种PEDV SH 2016株后0-18 h无明显临床症状，食欲、精神状态正常。18-48 h出现腹泻及呕吐症状，并逐渐加重。食欲下降，部分仔猪出现呕吐，呈乳糜状；严重腹泻，部分仔猪腹泻呈喷射状，粪便为黄色水样；精神萎靡，被毛粗乱，眼窝凹陷，聚堆。49-72 h仔猪发病症状进一步加重，严重脱水，体温降低，2只仔猪分别于69、71h死亡，濒死前出现抽搐症状。72-84 h攻毒组仔猪全部死亡，见图4。DMEM组仔猪在试验期间临床表现正常，未出现呕吐、腹泻症状。
1.9.2病理剖检
对发病的濒死仔猪进行病理剖检，小肠可见明显病变。胃内可见黄白相间的凝乳块，小肠内含有黄白色液体或乳糜状物质，肠腔扩张，肠壁变薄，呈半透明状，肠系膜充血，见图5。DMEM组仔猪剖检显示正常，无明显病变，见图5。
1.9.3体温、体重变化
攻毒组仔猪在攻毒后体温逐渐下降，攻毒后第三天体温下降明显，无法测量直肠温度，并相继脱水死亡。DMEM组在试验期间体温存在波动，但无明显变化，见图6-A。随着呕吐、腹泻等症状的出现及逐渐加重，攻毒组仔猪体重呈明显下降趋势。DMEM组仔猪体重存在轻微降低的现象（见图6-B）。
1.9.4组织切片学观察
对DMEM与接毒组的仔猪各肠段进行切片与HE染色，显微镜下观察发现病变主要存在于空肠。可见小肠绒毛显著萎缩，绒毛长度与隐窝深度比值下降，肠上皮细胞变性、脱落，固有层毛细血管扩张、充血，粘膜下层水肿，炎性细胞浸润，见图7-B。DMEM组HE染色显示空肠无明显病变（图7-A）。对空肠进行免疫组织化学染色，在小肠绒毛上皮细胞可见明显褐色着染，表明病毒在此处增殖（图7-D），DMEM组未见明显褐色，见图7-C。
本病毒由于与其他流行毒株比较N蛋白有12个氨基酸缺失，其致病性较强，可以作为动物模型的建立和疫苗的开发。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 猪流行性腹泻病毒及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
<210> 3
<211> 27755
<212> DNA
<213> 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)
<400> 3
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taacatgttg tccaagtaca ttgtttctgc tggttctgtc actattgaac gtgtcacgca 5520
tgacggctgt tgttgtagta agcgtgttgt cactgcacca gttgtgaatg ctagcgtatt 5580
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tatatggatc tcctgcttga cgattttgtc agcattctta aatctttgga tttgggcgtt 19440
gtatctaaag ttcatgaagt tatggtcgat tgtaaaatgt ggaggtggat gttgtggtgt 19500
aaggatcata aactccagac attttatccg caacttcagg ccagtgaatg gaagtgtggt 19560
tattccatgc cttctattta caagatacaa cgtatgtgtt tagaaccttg caatctctac 19620
aactatggtg ctggtattaa gttacctgat ggcattatgt ttaacgtagt taaatacaca 19680
cagctttgtc aatatctcaa tagcaccaca atgtgtgtac cccatcacat gcgtgtgcta 19740
catcttggtg ctggctccga caagggtgtt gcacctggca cggctgtctt acgacgttgg 19800
ttgccactgg atgccattat agttgacaat gatagtgtgg attacgttag cgatgctgat 19860
tatagtgtta caggagattg ctctacctta tacctgtcag ataagtttga tttagttata 19920
tctgatatgt atgatggtaa gattaaaagt tgtgatgggg agaacgtgtc taaagaaggc 19980
ttctttccct acattaatgg tgtcatcacc gaaaagttgg cacttggtgg tactgtagct 20040
attaaggtga cggagtttag ttggaataag aagttgtatg aactcattca gaagtttgag 20100
tattggacaa tgttctgtac cagtgttaac acgtcatcgt cagaggcatt tttaattggt 20160
gttcactatt taggtgattt tgcaagtggc gctgtgattg acggcaacac tatgcatgcc 20220
aattatatct tctggcgtaa ttccacaatt atgactatgt cttacaatag tgtacttgat 20280
ttaagcaagt tcaattgtaa gcataaggct acagttgtca ttaatttaaa agattcatcc 20340
attagtgatg ttgtgttagg tttgttgaag aatggtaagt tgctagtgcg taataatgac 20400
gccatttgtg gtttttctaa tcatttggtc aacgtaaaca aatgaagtct ttaacctact 20460
tctggttgtt cttaccagta ctttcaacac ttagcctacc acaagatgtc accaggtgct 20520
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catgggataa tgatcgtgtc actgtctttt ctgacaagat ctattatttt tattttaaaa 21000
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ttcctaagat ttatggacta ggccaatttt tctcctttaa tcaaacgatc gatggtgttt 21360
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ctggtcatgg cactgacgat gacgtttctg gtttttggac catagcatcg actaattttg 21780
ttgacgcact tatcgaagtt caaggaactg ccattcagcg tattctttat tgtgatgatc 21840
ctgttagcca actcaagtgt tctcaggttt cttttgacct tgacgatggt ttttacccta 21900
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ttaatgatca ttcttttgtt aacattactg tctctgcttc ctttggtggt catagtggtg 22020
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tgattactgg cacgcctaaa ccacttgtag gtgttacgga cgtttctttt atgactctgg 22380
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