猪流行性腹泻病毒及其应用.pdf

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810364796.7 (22)申请日 2018.04.23 (83)生物保藏信息 CGMCC No.15289 2018.01.19 (71)申请人 南京农业大学 地址 210014 江苏省南京市玄武区卫岗1号 (72)发明人 王先炜姜平王咪王广操 刘倩玉 (74)专利代理机构 北京索睿邦知识产权代理有 限公司 11679 代理人 刘丽 (51)Int.Cl. C12N 7/00(2006.01) C12Q 1/70(2006.01) C12Q 1/6858(2018.0

2、1) A61K 39/215(2006.01) A61P 31/14(2006.01) C12R 1/93(2006.01) (54)发明名称 猪流行性腹泻病毒及其应用 (57)摘要 本发明涉及病毒技术领域， 特别涉及一种猪 流行性腹泻病毒， 保藏编号为CGMCCNo.15289。 在病毒鉴别诊断及动物疫苗中的应用。 该毒株具 有较强的致病性， 通过与不同的PEDV经典毒株和 变异毒株的基因序列比对， 分析其之间的差异， 阐明了流行毒株的遗传变异规律， 为研制新型疫 苗和鉴别诊断技术奠定了基础。 权利要求书1页 说明书6页 序列表13页 附图3页 CN 108588036 A 2018.09.

3、28 CN 108588036 A 1.一种猪流行性腹泻病毒， 其特征在于猪流行性腹泻病毒PEDV-SH2016， 保藏编号为 CGMCC No.15289。 2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒， 其特征在于病毒全基因序列见序列表中 序列3。 3.根据权利要求1或2所述的猪流行性腹泻病毒， 其特征在于S基因新增了16个氨基酸 突变365E-Q、 387V-I、 403V-F、 429D-A、 454S-A、 474A-S、 542D-E、 633E-V、 671V-I、 763P-L、 765Q-K、 824T-I、 880Y-R、 1006N-D、 1250D-Y、 1363S-A；

4、N蛋白从399aa起连续缺失了12个氨基 酸； 在ORF3基因新增了4个氨基酸突变即25L-S、 66R-T、 101A-I、 164C-F。 4.一种权利要求1-3中所述的猪流行性腹泻病毒在病毒鉴别诊断及动物疫苗中的应 用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108588036 A 2 猪流行性腹泻病毒及其应用 0001 技术领域 本发明涉及病毒技术领域， 特别涉及一种猪流行性腹泻病毒， 还涉及猪流行性腹泻病 毒的应用。 背景技术 0002 猪流行性腹泻是以猪了能连续急性肠炎、 水样腹泻、 脱水和哺乳仔猪高度致死率为特 征的一种高度接触性肠道传染病。 该病最先流行于欧洲， 1988年Hofm

5、an等人通过在营养液 中添加胰酶， 用非洲绿猴肾细胞分离出传代的猪流行性腹泻病毒。 1973年， 中国首次发现类 似TGEV的病毒， 但1984年才证实该病毒为PEDV。 0003 从2010年下半年开始， 我国全国范围内爆发PEDV， 对我国养猪业造成了严重的经 济损失。 尽管猪流行性腹泻弱毒苗和灭活苗在我国已批量生产投入使用， 但近几年来该病 的持续流行表明国内疫苗的保护力不高。 猪流行性腹泻病毒的细胞培养与分离是疫苗的研 制以及各种猪流行性腹泻病毒研究的关键。 尽管PEDV的感染率很高， 但研究表明， PEDV分离 的成功率相当低， 甚至已分离的病毒也可能无法进一步在传代细胞培养。 00

6、04 现有技术中也有许多猪流行性腹泻病毒新毒株的记载， 但是很多都是通过生物基 因技术得到的工程菌株， 从自然界分离出的很少。 发明内容 0005 为了解决以上现有技术中猪流行性腹泻病毒大范围爆发、 疫苗保护力度不高的问题， 本申请提供了一种猪流行性腹泻病毒， 具有较强毒性， 可用于疫苗研发。 0006 本发明还提供了猪流行性腹泻病毒的应用。 0007 本发明是通过以下步骤得到的： 一种猪流行性腹泻病毒， 名称猪流行性腹泻病毒PEDV-SH2016， 保藏编号为CGMCC No.15289。 0008 所述的猪流行性腹泻病毒， 病毒全基因序列见序列表中序列3。 0009 所述的猪流行性腹泻病毒

7、， 其S基因新增了16个氨基酸突变： 365E-Q、 387V-I、 403V-F、 429D-A、 454S-A、 474A-S、 542D-E、 633E-V、 671V-I、 763P-L、 765Q-K、 824T-I、 880Y-R、 1006N-D、 1250D-Y、 1363S-A； N蛋白从399aa起连续缺失了12个氨基酸； 在ORF3基因新增了4 个氨基酸突变即25L-S、 66R-T、 101A-I、 164C-F。 0010 所述的猪流行性腹泻病毒在病毒鉴别诊断及动物疫苗中的应用。 0011 本发明的有益效果： 本研究利用Vero细胞， 从发病猪场患病仔猪小肠组织病料中

8、分离获得PEDV野毒株， 该 毒株具有较强的致病性， 通过与不同的PEDV经典毒株和变异毒株的基因序列比对， 分析其 说明书 1/6 页 3 CN 108588036 A 3 之间的差异， 阐明了流行毒株的遗传变异规律， 为研制新型疫苗和鉴别诊断技术奠定了基 础。 附图说明 0012 图1为RT-PCR检测SH2016 ORF3基因电泳图谱， M： DNA marker； 泳道1： 阴性对照； 泳道2： 阳性对照； 泳道3： SH2016， 图2为病毒生长曲线， 图3为IFA鉴定病毒与单克隆抗体的反应性结果图， 图4为攻毒仔猪典型临床症状， A： 发病仔猪粪便； B： 濒死仔猪， 图5为攻毒仔

9、猪消化道剖检图， 图6为攻毒仔猪体温与体重变化图， A： 体温变化； B： 体重变化， 图7为攻毒仔猪空肠病理与免疫组化切片， A:DMEM组HE染色； B： 攻毒组HE染色； C： DMEM 组免疫组化； D： 攻毒组免疫组化。 0013 菌种保藏信息 保藏时间： 2018年1月19日， 保藏单位： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号： CGMCC No.15289， 保藏单位地址： 北京市朝阳区北辰西路1号院3号， 100101， 分类命名： 猪流行性腹泻病毒。 具体实施方式 0014 下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明： 实施例1 1.1 材料 1.1.1 病料

10、 从上海猪场采集腹泻猪的粪便、 小肠等病料， 置-70保存， 备用。 0015 1.1.2细胞 非洲绿猴肾细胞 （Vero） 为本实验室传代保存。 0016 病毒分离鉴定 1.2.1 病料处理 将疑似病料 （小肠组织） 剪成小块， 加入35倍体积的灭菌PBS， 剪碎匀浆处理， 反复冻融 3次， 低速离心吸取上清至EP管中， 于4 12000rpm离心10min吸取上清备用。 0017 1.2.2 病毒的分离 将收集的上清用0.22m的滤膜过滤。 用含10%胎牛血清的DMEM营养液培养Vero细胞， 待 细胞长满单层后， 弃去营养液， Hank s液洗涤2次， 接种处理好的组织液， 同时加入终浓

11、度为 6 g/mL的胰酶， 37吸附1h； 弃去组织液， 37孵育1h， 换上无血清的DMEM维持液 （胰酶终浓 度为6 g/mL） 。 逐日观察病变， 培养3到4天， 如果没有病变， 反复冻融3次， 盲传至80%的细胞 出现CPE， 冻融三次， 收获病毒液。 将产生CPE的病毒液继续传代培养， 记录产生CPE时间。 说明书 2/6 页 4 CN 108588036 A 4 0018 1.2.3 PCR鉴定 将收获的病毒液按如下方法提取RNA并反转录为cDNA： （1） 首先吸入200 L病毒液， 加入1mL Trizol Plus， 剧烈震荡30s， 静置5min， 4， 12000rpm

12、离心10min； （2） 取1mL上清， 加入200 L 氯仿， 剧烈震荡1min， 静置5min， 4， 12000rpm 离心15min； （3） 取上清， 加入等体积异丙醇， 上下颠倒混匀， 静置15min， 4， 12000rpm离心10min； （4） 弃去上清， 加入1ml 75%乙醇， 将管底沉淀轻轻弹起， 上下颠倒几次， 4， 12000rpm 离心10min； （5） 弃去上清， 风干， 加入20 L DEPC水； （6） 配制反转录体系 （10 L） ： RNA模板6.5 L， 5RT Buffer 2 L， dNTP Mixture (10mmol/L) 0.5 L， O

13、ligo(dT)18 (25 mol/L) 0.5 L； （7） 70水浴5min， 置冰水中2min； （8） 加入0.5 L 反转录酶； （9） 42水浴1h得到cDNA， 置-20保存备用。 0019 PCR方法检测是否分离到PEDV， 引物由南京金斯瑞公司合成， 序列如下： 上游引物ORF3 F: 5 - TCCTAGACTTCAACCTTACG -3 下游引物ORF3 R: 5 - GGTGACAAGTGAAGCACAGA -3 按上述方法提取的cDNA， 扩增PEDV ORF3基因 （632bp） 。 反应体系如下： 2Taq plus Master Mix12.5 L ORF3-

14、F1 L ORF3-R1 L cDNA2 L dd H2O8.5 L 总计：25 L 反应程序： 95预变性5min； 95变性30s， 53退火30s， 72延伸50s， 共35个循环， 最 后72终延伸10min。 PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离。 0020 将PCR检测为阳性 （见图1） 的临床病料 （粪便和肠） 匀浆， 无菌处理后， 接种Vero细 胞， 分离PEDV。 2016年9-10月从上海某猪场感染猪的小肠组织中成功分离出猪流行性腹泻 病毒， 命名为SH2016， PCR检测结果阳性。 接种Vero细胞48小时后局部出现细胞融合现象， 将 细胞毒反复冻融3次后继续传代，

15、第3代即出现明显的细胞病变。 0021 病毒纯化 采用噬斑纯化法对病毒进行纯化， 具体方法如下： （1） 将生长状态较好的Vero细胞接种6孔细胞培养板； （2） 将病毒液用DMEM （含6 g/mL的胰酶） 从10-1-10-5 作连续10倍稀释； （3） 待细胞长满单层后， 用Hank s液洗涤2次， 依次接种稀释好的病毒液， 同时设置正常 细胞对照孔， 37， 5%CO2温箱中吸附1h， 每隔15min晃一次， 使病毒液均匀覆盖细胞板； （4） 弃去病毒液， 将2%低熔点琼脂糖与含12 g/mL 胰酶的2x DMEM 1:1混合， 2ml/孔， 加 入培养板， 注意不要产生气泡， 待琼脂

16、冷却后， 放入37， 5%CO2温箱中培养。 0022 （5） 每日观察病变， 选择病毒蚀斑形态较好的单个斑， 用剪好的枪头挑取后置于 说明书 3/6 页 5 CN 108588036 A 5 100 L的DMEM维持液中， 反复吹打。 0023 （6） 按上述方法将病毒连续纯化3次， 保存34个病毒蚀斑样品， 进行增殖， 同时用 RT-PCR方法进行检测。 0024 病毒滴度测定 （1） 将Vero细胞接种96孔细胞培养板， 待80%左右细胞长满单层即可接毒。 0025 （2） 将铺好的Vero细胞弃去营养液， 用Hank s液洗涤1遍； （3） 用DMEM将病毒液作连续10倍的稀释， 从1

17、0-1-10-10； （4） 将稀释好的病毒液接种到96孔细胞培养板中， 每一稀释度做8孔重复， 每孔接种100 l， 同时设置正常细胞作为对照； （5） 37， 5%CO2温箱中孵育1h， 弃病毒液， 加维持液 （含6 g/mL的胰酶） 继续放温箱培 养； （6） 逐日观察并记录结果， 观察3天。 0026 （7） 按Reed-Muench氏法计算结果。 0027 SH在纯化后第2代效价可达106.1 TCID50 /ml。 0028 病毒生长曲线测定 为了研究病毒的生长特性， 将病毒接种Vero细胞绘制生长曲线。 将分离毒株在Vero细 胞上进行连续传代， 取不同代次的病毒液， 按200T

18、CID50的病毒量分别接种Vero细胞， 37吸 附1h后弃去病毒液， 加入维持液 （含6 g/mL的胰酶） 继续培养。 每隔6h取样， 直至接种后36h。 不同时间点收集病毒的TCID50， 每个时间点进行3次重复测定， 根据测定结果绘制病毒在 Vero细胞上的生长曲线， 见图2。 0029 全基因的PCR扩增、 克隆与基因测序 根据GenBank 公布的PEDV CV777基因序列， 应用Primer5软件， 设计分段扩增全基因的 引物， 引物由南京金斯瑞公司合成， 引物序列见表2-1。 将分离到的病毒液按本章1.2.3的 方法提取RNA， 反转录为cDNA， 分别扩增各段基因。 胶回收后

19、， 将回收的片段与pEASY-Blunt 载体在25条件下连接， 转化感受态细胞中， 挑取可疑菌落培养4h， 用M13引物进行菌液PCR 鉴定， 菌液PCR鉴定阳性的菌液送南京金斯瑞公司测序。 0030 根据GenBank公布的PEDV CV777基因序列设计引物， 通过RT-PCR扩增和序列测定 获得PEDV SH株的全基因序列， 基因序列符合变异毒株的特征， 全基因序列见序列表中序列 3。 遗传进化树显示， 本株病毒属于G2b亚群 （变异毒株） ， 与中国BJ2011-1和越南HUA- 14PED96毒株亲缘关系最近。 0031 全基因核苷酸和编码氨基酸序列比对分析 用DNAstar Ed

20、itSeq软件将PEDV基因序列翻译为氨基酸序列。 将分离毒株基因序列推 导的氨基酸与参考序列采用BioEdit软件进行比对分析。 0032 基因序列分析表明， 与近几年国内外分离到的变异毒株相比， 该分离毒株均在S基 因新增了16个氨基酸突变， 引起了S蛋白抗原表位和糖基化位点发生改变； N蛋白从399aa起 连续缺失了12个氨基酸； 在ORF3基因新增了4个氨基酸突变。 0033 由于N蛋白缺失12个氨基酸 （36bp） ， 可利用real-time PCR方法鉴别诊断其他毒株 和该毒株。 0034 实验： 说明书 4/6 页 6 CN 108588036 A 6 为了鉴定病毒与单克隆抗体

21、的反映性， 用实验室制备的单克隆抗体McAb1、 McAb2和 McAb3进行IFA。 其中McAb1针对表位为N蛋白398HEEA IYDDV406， 位于SH2016 N蛋白缺失部位。 0035 方法 （1） 用Vero细胞铺96孔细胞板， 待80%-90%细胞长满单层， 用Hank s洗一遍； （2） 用维持液 （含终浓度为8ug/mL的胰酶） 将病毒进行10倍比稀释， 从10-1-10-3； （3） 弃掉96孔板里的洗液， 每孔加入100 L 10-3稀释倍数的病毒液， 设置未接毒阴性对 照组， 在37， 4% CO2温箱中孵育1h； （4） 弃掉病毒液， 加入100 L维持液， 在3

22、7， 4% CO2温箱中培养； （5） 30%细胞出现病变， 将细胞板用PBS洗3遍， 用吸水纸吸干， 每孔加入100 L 4% 多聚 甲醛， 室温， 固定20min； （6） 用PBS洗3遍， 吸干， 每孔加入100 L 0.1% Triton， 室温20min； （7） 用PBS洗3遍， 吸干， 每孔加入100 L用 2%BSA 1:250稀释的PEDV单抗， 37， 孵育 1.5h； （8） 用PBS洗3遍， FITC羊抗鼠二抗1： 250倍稀释， 每孔加入50 L， 37孵育1h(全部避 光)； （9） 用PBS洗3遍， 加入100 l PBS， 荧光显微镜下观察。 0036 结果见图

23、3： 3株单克隆抗体与SH2016反应， 而单克隆抗体1不能与其反应， 可以作 为鉴别诊断使用。 0037 动物攻毒试验 选用9只3日龄无母源抗体哺乳仔猪， 随机分为两组， 实验组5头， 对照组4头。 实验组口 服3105 TCID50PEDV SH 2016病毒液， 同时设定DMEM对照组。 攻毒后观察临床症状， 排泄物 形态， 每天测定体温、 体重， 记录存活时间。 在攻毒前后每天采集各组试验仔猪的肛拭子， 用 Real Time PCR检测PEDV的载量。 采集攻毒前、 后各试验组的血液， 分离血清， 测定中和抗体 活性。 0038 在试验期间， 对试验中死亡及试验结束后的猪进行病理剖检

24、， 观察肺、 脾、 肾、 胃、 肠、 腹股沟淋巴结、 肠系膜淋巴结等组织脏器病理变化， 采集组织样品， 制作病理组织切片。 0039 1.9.1临床观察 攻毒组仔猪接种PEDV SH 2016株后0-18 h无明显临床症状， 食欲、 精神状态正常。 18- 48 h出现腹泻及呕吐症状， 并逐渐加重。 食欲下降， 部分仔猪出现呕吐， 呈乳糜状； 严重腹 泻， 部分仔猪腹泻呈喷射状， 粪便为黄色水样； 精神萎靡， 被毛粗乱， 眼窝凹陷， 聚堆。 49-72 h仔猪发病症状进一步加重， 严重脱水， 体温降低， 2只仔猪分别于69、 71h死亡， 濒死前出现 抽搐症状。 72-84 h攻毒组仔猪全部死

25、亡， 见图4。 DMEM组仔猪在试验期间临床表现正常， 未 出现呕吐、 腹泻症状。 0040 1.9.2病理剖检 对发病的濒死仔猪进行病理剖检， 小肠可见明显病变。 胃内可见黄白相间的凝乳块， 小 肠内含有黄白色液体或乳糜状物质， 肠腔扩张， 肠壁变薄， 呈半透明状， 肠系膜充血， 见图5。 DMEM组仔猪剖检显示正常， 无明显病变， 见图5。 0041 1.9.3体温、 体重变化 攻毒组仔猪在攻毒后体温逐渐下降， 攻毒后第三天体温下降明显， 无法测量直肠温度， 说明书 5/6 页 7 CN 108588036 A 7 并相继脱水死亡。 DMEM组在试验期间体温存在波动， 但无明显变化， 见图

26、6-A。 随着呕吐、 腹 泻等症状的出现及逐渐加重， 攻毒组仔猪体重呈明显下降趋势。 DMEM组仔猪体重存在轻微 降低的现象 （见图6-B） 。 0042 1.9.4组织切片学观察 对DMEM与接毒组的仔猪各肠段进行切片与HE染色， 显微镜下观察发现病变主要存在于 空肠。 可见小肠绒毛显著萎缩， 绒毛长度与隐窝深度比值下降， 肠上皮细胞变性、 脱落， 固有 层毛细血管扩张、 充血， 粘膜下层水肿， 炎性细胞浸润， 见图7-B。 DMEM组HE染色显示空肠无 明显病变 （图7-A） 。 对空肠进行免疫组织化学染色， 在小肠绒毛上皮细胞可见明显褐色着 染， 表明病毒在此处增殖 （图7-D） ， D

27、MEM组未见明显褐色， 见图7-C。 0043 本病毒由于与其他流行毒株比较N蛋白有12个氨基酸缺失， 其致病性较强， 可以作 为动物模型的建立和疫苗的开发。 0044 上述实施例为本发明较佳的实施方式， 但本发明的实施方式并不受实施例的限 制， 其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、 修饰、 组合、 替代、 简化均应为 等效替换方式， 都包含在本发明的保护范围之内。 说明书 6/6 页 8 CN 108588036 A 8 序列表 南京农业大学 猪流行性腹泻病毒及其应用 3 SIPOSequenceListing 1.0 1 20 DNA Artificial sequence

28、1 2 20 DNA Artificial sequence 2 3 27755 DNA 猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus) 3 tccgtcgcct tctacatact agacaaacag ccatcctccg gttccgtctg ggggttgcgt 60 ggataactag ttccgtctag tttgaaacca gtaactgtcg gctatggcta gcaaccaagt 120 cacattggct tttgccaatg atgcagaaat ttcagctttt ggcttttgca ctgctagtga 180 ag

29、ccgtctca tactattctg aggccgccgc tagtggattt atgcaatgcc gtttcgtgtc 240 cttcgatctc gctgacactg ttgagggatt gcttcccgaa gactatgtca tggtggtggt 300 cggcactacc aagcttagtg cgtatgtgga cacttttggt agccgcccca gaaacatttg 360 tggttggctg ttattttcta actgtaatta cttcctcgaa gagttagagc tcacttttgg 420 tcgtcgtggt ggtaacatcg

30、tgccagttga ccaatacatg tgtggcgctg acgggaaacc 480 tgttcttcag gaatccgagt gggagtatac agactttttt gctgactccg aagacggtca 540 actcaacatt gctgggatca cttatgtgaa ggcctggatt gtagagcgat cggacgtctc 600 ttatgcgagt cagaatttaa catctattaa gtctattact tactgttcaa cctatgagca 660 tacttttcct gatggtactg ccatgaaggt tgcacgtac

31、t ccaaagatta agaagactgt 720 tgtcttgtct gagccacttg ctactatcta cagggaaatt ggttctcctt ttgtggataa 780 tgggagcgat gctcgttcta tcattaagag accagtgttc ctccacgctt ttgttaagtg 840 taagtgtggt agttatcatt ggactgttgg tgattggact tcctatgtct ccacttgctg 900 tggctttaag tgtaagccag tccttgtggc ttcatgctct gctacgcctg gttctgt

32、tgt 960 ggttacgcgc gctggtgctg gcactggtgt taagtattac aacaacatgt tcctgcgcca 1020 tgtggcagac attgatgggt tggcattctg gcgaattctt aaggtgcagt ccaaagacga 1080 序列表 1/13 页 9 CN 108588036 A 9 cctcgcttgc tctggtaaat tccttgaaca ccatgaggaa ggtttcacag atccttgcta 1140 ctttttgaat gactcgagca ttgctactaa gctcaagttt gacat

33、cctta gtggcaagtt 1200 ttctgatgaa gtcaaacaag ctatctttgc tggtcatgtt gttgttggca gtgcgctcgt 1260 tgacattgtt gacgatgcac tgggacagcc ttggtttata cgtaagcttg gtgaccttgc 1320 aagtgcagct tgggagcagc ttaaggctgt cgttagaggc cttagcctcc tgtctgatga 1380 ggtcgtgctc tttggcaaaa gacttagctg tgccactctt agtatcgtta acggtgtttt

34、 1440 tgagtttatc gccgaagtgc cagagaagtt ggctgcggct gttacagttt ttgtcaactt 1500 cttgaatgag ctttttgagt ctgcctgtga ctgcttaaag gtcggaggta aaacctttaa 1560 caaggttggc tcctatgttc tttttgacaa cgcattggtt aagcttgtca aggcaaaagt 1620 tcgcggccca cgacaggcag gtgtttgtga agttcgttac acaagccttg ttattgggag 1680 tactaccaag

35、 gtggtttcca agcgcgttga aaatgccaat gtgaatctcg tcgtcgttga 1740 cgaggatgtg accctcaaca ccactggtcg tacagttgtt gttgacggac ttgcattctt 1800 cgagagtgac gggttttaca gacatcttgc tgatgctgac gttgtcattg aacatcctgt 1860 ttataagtct gcttgtgagc tcaagccagt ttttgagtgt gacccaatac ctgattttcc 1920 tatgcctgtg gccgctagtg ttgc

36、agagct ttgtgtgcaa actgatctgt tgcttaaaaa 1980 ttacaacact ccttataaaa cttacagctg cgttgtgaga ggtgataagt gttgtatcac 2040 ttgcacctta catttcacag caccaagtta tatggaggct gctgctaatt ttgtagacct 2100 ctgtaccaag aacattggta ctgctggttt tcatgagttc tacattacgg cccatgaaca 2160 acaggatctg caagggttcg taaccacttg ttgcacgat

37、g tcaggttttg agtgttttat 2220 gcctataacc ccacagtgtc cagcagtgct tgaagagatt gatggtggta gcatctggcg 2280 gtcttttatc actggtctta atacaatgtg ggatttttgc aagcatctta aagtcagctt 2340 tggactagat ggcattgttg tcactgtagc acgcaaattt aaacgacttg gtgctctctt 2400 ggcagaaatg tataacactt acctttcaac tgtggtggaa aacttggtac tgg

38、ccggtgt 2460 tagcttcaag tattatgcca ccagtgtccc aaaaattgtt ttgggctgtt gttttcacag 2520 tgttaaaagt gttcttgcaa gtgccttcca gattcctgtt caggcaggcg ttgagaagtt 2580 taaagtcttc cttaactgtg ttcaccctgt tgtaccacgt gtcattgaaa cttcttttgt 2640 ggaattagaa gagacgacat ttaaaccacc agcactcaat ggtagtattg ctattgttga 2700 tgg

39、ctttgct ttctattatg atggaacact atactatccc accgatggta atagcgttgt 2760 tcctatctgc tttaagaaga aaggtggtgg tgatgtcaaa ttctctgatg aagtctctgt 2820 taaaaccatt gacccagttt ataaggtctc ccttgaattt gagttcgagt ctgagactat 2880 tatggctgtg cttaataagg ctgttggtaa ttgtatcaag gttacaggtg gttgggacga 2940 tgttgttgag tatatcaa

40、tg ttgccattga ggttcttaaa gatcacatcg atgtgcctaa 3000 gtactacatc tatgatgagg aaggtggcac cgatcctaat ctgcccgtaa tggtttctca 3060 gtggccgttg aatgatgaca cgatctcaca ggatctgctt gatgttgaag ttgttactga 3120 tgcgccagtt gatttcgagg gtgatgaagt agactcctct gaccctgata aggtggcaga 3180 cgtggctaac tctgagcctg aggatgacgg tc

41、ttaatgta gctcctgaaa caaatgtaga 3240 gtctgaagtt gaggaagttg ccgcaacctt gtcctttatt aaagatacac cttccacagt 3300 tactaaggat ccttttgctt ttgactttgc aagctatgga ggacttaagg ttttaagaca 3360 atctcataac aactgctggg ttacttctac cttggtgcag ctacaattgc ttggcatcgt 3420 序列表 2/13 页 10 CN 108588036 A 10 tgatgaccct gcaatggg

42、gc tttttagtgc tggtagagtt ggtccaatgg ttcgcaaatg 3480 ctatgagtca caaaaggcta tcttgggatc tttgggtgat gtgtcggctt gcctagagtc 3540 tctgactaag gacctacaca cacttaagat tacctgttct gtagtctgtg gttgtggtac 3600 tggtgaacgt atctatgagg gttgtgcttt tcgtatgacg ccaactttgg aaccgttccc 3660 atatggtgct tgtgctcagt gtgctcaagt tt

43、tgatgcac acttttaaaa gtattgttgg 3720 caccggcatc ttttgtcgag atactactgc tctctccttg gattctttgg ttgtaaaacc 3780 tctttgtgcg gctgctttta taggcaagga tagtggtcat tatgtcacta acttttatga 3840 tgctgctatg gctattgatg gttatggtcg tcatcagata aagtatgaca cactgaacac 3900 tatttgtgtt aaagacgtta attggacagc accttttgtc ccagacg

44、ctg tgcctgtatt 3960 ggagcctgtt gtcaaacctt tctattctta taagaatgtt gatttttacc aaggagattt 4020 tagtgacctt gttaaacttc catgtgattt tgttgttaat gctgcaaatg agaatttgtc 4080 tcacggtggc ggcatagcaa aggccattga tgtttatacc aagggcatgt tgcagaagtg 4140 ctcgaatgat tacattaaag cacacggtcc cattaaagtt ggacgtggtg tcatgttgga 4

45、200 ggcattaggt cttaaggtct ttaatgttgt tggtccacgt aagggtaagc atgcacctga 4260 gcttcttgtt aaggcttata agtccgtttt tgctaattca ggtgttgctc ttacaccttt 4320 gattagtgtt ggaattttta gtgttccttt ggaagaatct ttatctgctt ttcttgcatg 4380 tgttggtgat cgccactgta agtgcttttg ttatagtgac aaagagcgcg aggcgatcat 4440 taattacatg g

46、atggtttgg tagatgctat tttcaaagat gcgcttgttg atactactcc 4500 tgtccaggaa gatgttcaac aagtttcaca aaaaccagtt ttgcctaatt ttgaaccttt 4560 caggattgaa ggtgctcatg ctttctatga gtgcaaccct gaaggtttga tgtcattagg 4620 tgctgacaag ctggtgttgt ttacaaattc caatttggat ttttgtagcg ttggtaagtg 4680 tcttaacaat gtgaccggcg gtgcat

47、tgct tgaagccata aatgtattta aaaagagtaa 4740 caaaacagtg cctgctggca actgtgttac ttttgagtgt gcagacatga tttttactat 4800 ggtagtattg ccatctgatg gtgatgctaa ttatgacaaa aattatgcac gcgccgtcgt 4860 caaggtatct aagcttaaag gcaagttatt gcttgctgtt ggtgatgcca cgttgtattc 4920 caagttgtcc cacctcagcg tggtaggttt cgtatccaca cctgatgatg tggagcgttt 4980 ctacgcaaat aagagtgtgg ttattaaagt cactgaggat acacgtagtg ttaaggctgt 5040 taaagtagaa tccactgtta cttatggaca acaaattgga ccttgtcttg ttaatgacac 5100 cgttgtcaca gacaacaaac ctgttgttgc tgatgttgta gctaaggttg taccaagtgc 5160 taattgggat tca