技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体而言，涉及一种高亲和力的PD1胞外区突变体多肽及相关融合蛋白。
背景技术
PD1(程序性死亡因子受体1，Programmed Death-1)是在激活的T细胞和B细胞上表达的免疫抑制性受体，其配体为PDL-1或PDL-2。PD-1属于B7家族，是大小为50-55kD的Ig超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白；由胞外IgV区、跨膜区、胞内区三部分组成，通过结构和生化分析发现，由于缺少膜近端半胱氨酸残基，PD-1以单体存在(Xuewu Zhang and Almo,Immunity,2004,20,337–347)。PD1与配体PDL1相互作用，在免疫应答的负调控方面发挥着重要作用。许多肿瘤细胞系和肿瘤细胞高表达PDL1分子(Konishi J et al.,Clin.Cancer Res.,2004，10(15):5094－5100)，其与淋巴细胞表面的PD1分子结合后，削弱了机体的抗肿瘤免疫应答(Radziewicz H et al.,J Virol，2007,81(6):2545－2553)，从而导致肿瘤免疫逃逸的发生。
已有的PD1抗体的治疗效果，和肿瘤细胞表面具有功能活性PDL1分子的量存在一定的关系，但并无有效定量PDL1分子的制剂存在，虽然PDL1抗体能够特异性的结合PDL1分子，但抗体的抗原表位有可能并非PDL1与PD1结合的关键结构域，因此，使用PDL1抗体对PDL1分子进行定量，可能受到无活性的PDL1的干扰，因此，临床上需要更有效的用于定量PDL1分子的产品。
另外，PD1抗体分子量较大，大分子对于实体性肿瘤的治疗效果往往不佳，因此，获得分子量更小且同样具有与PD1抗体类似的竞争性结合PDL1配体并介导免疫反应的分子，也是具有极大的临床应用前景。
在天然状态下，PD1与其配体PDL1的结合亲和力不高，因此，可以通过基因工程的方法，优化PD1分子胞外区与PDL1分子的亲和力，从而解决上述问题。
发明内容
本发明首先涉及一组人PD1分子胞外区突变体多肽，所述的突变体多肽在如Seq ID No.23所示的野生型PD1分子胞外区多肽序列的基础上，包含至少一个的如下突变位点：E13G、A17V、A17D、S29G、L32M、N33S、L46M、L46V、R52G、S54T、Q66H、S76P、W83S、L89P、A99V、K102E、I110V、E117G。
优选的，所述的突变体多肽具体为，在如Seq ID No.23所示的野生型PD1分子胞外区多肽序列的基础上，包含如下表所示具体突变位点的21个突变体：
更优选的，所述的PD1胞外区的突变体多肽是在如Seq ID No.23所示的野生型PD1分子胞外区多肽序列的基础上，包含至少一个的如下突变位点：K102E、A99V。
本发明还涉及一种包含所述PD1胞外区的突变体多肽的融合蛋白。
优选的，所述的融合蛋白包含如下结构域：
(1)所述的PD1胞外区的突变体多肽
(2)人免疫球蛋白或其片段；
以及，可选的：
(3)其他功能性多肽片段，所述的功能性多肽片段可选自：细胞毒多肽、细胞激素、免疫检查点配体/受体、白介素等。
(4)可用特定检测方法检测的检测标记，所述的检测标记包括但不限于荧光成像标记基团、核磁共振标记基团或正电子发射断层扫描标记基团。
优选的，所述的人免疫球蛋白是人IgG1；
优选的，所述的人免疫球蛋白片段是免疫球蛋白恒定区(Fc区)或其片段；
最优选的，所述的融合蛋白的氨基酸序列如Seq ID No.26～30所示。
本发明还涉及包含所述PD1胞外区的突变体多肽或融合蛋白的药品或检测试剂。
本发明还涉及编码所述PD1胞外区的突变体多肽或融合蛋白的核苷酸片段。
附图说明
图1、PDL1-Fc分子的电泳结果。
图2、CHO-PD1细胞株的构建流程示意图。
图3、流式细胞仪检测CHO-PD1细胞表面的PD1胞外区展示率及PD1胞外区与PDL1-Fc分子的结合亲和力。
图4、利用体细胞突变技术对展示在CHO-PD1细胞表面的PD1胞外区与PDL1-Fc分子的亲和力进行人工进化的流程图。
图5、通过流式细胞仪分选进化后的P3区域的CHO-PD1细胞。
图6、流式细胞仪检测第一轮进化后分选出的细胞与PDL1-Fc的结合能力。
图7、流式细胞仪检测四轮进化后分选出的细胞与PDL1-Fc的结合能力。
图8、流式细胞仪检测突变体与PDL1-Fc的结合能力，其中，数据归一化公式为：
[(LR％gated×LRmean)+(UR％gated×UR mean)]/UL％gated+UR％gated(具体可参见Xiufen Lei，Yong Zhu，et al；Nucleic Acids Research，2004，Vol.32，No.12，第六页表1)。
图9、流式细胞仪检测PD1(mut)-Fc和PD1(WT)-Fc竞争性结合PDL1的的能力。
图10、PD1-Fc融合蛋白二聚体结构示意图。
图11、融合蛋白的分子量测定结果。
具体实施方式
利用本实验室现有的基于CHO细胞和AID突变体系的蛋白人工进化系统，进化PD-1胞外区结构域与PDL1的亲和力，所用的CHO细胞株为在先专利(CN104531623B)中所保藏的细胞株。
实施例1、构建及扩增替换质粒pFRT-PD1-G4S-HA
替换目标细胞株中的PuroR基因，将PD1-G4S-HA稳定展示在细胞表面。
使用PUC57-optiPD1-G4S-HA(optiPD1-G4S-HA序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成后连入载体PUC57中)为扩增模板，该模板中含以下Seq ID No.1所示碱基序列；
其中，信号肽1的序列为Seq ID No.2所示，
野生型PD1分子的胞外区序列为Seq ID No.3所示，
信号肽1和野生型PD1分子之间的linker(G4Slinker)如Seq ID No.4所示，
HA标签(HA tag)的序列为Seq ID No.5所示，
具体实验步骤如下：
将上述碱基序列Seq ID No.2～Seq ID No.5通过如下步骤连入pFRT-SP-HA-TM-Loxp载体(该载体由本实验室自行保存)中，用于替换细胞CHO/dhFr--PuroR-TK-12中的PuroR基因序列：
(1)PCR扩增：利用Pyrobest高保真扩增酶(Takara)对目的基因(由金斯瑞公司合成)进行PCR扩增出来。(引物为Seq ID No.6和Seq ID No.7，模板为PUC57-optiPD1-G4S-HA)，
扩增引物为：
PD1-EcoRI-SP-F：Seq ID No.6；
XhoI-HA-R：Seq ID No.7：
PCR条件为：退火56℃，72℃延伸1min，35个循环。
(2)胶回收PCR产物：上一步已完成的PCR反应物依照DNA凝胶试剂盒(QIAGEN)使用说明进行纯化。
(3)酶切目的基因片段和载体质粒：步骤(2)回收后得到的PCR产物以及载体(pFRT-SP-HA-TM-Loxp，本实验室自行保存)经核酸内切酶(EcoRI,XhoI,NEB)切割后采用DNA凝胶试剂盒(QIAGEN)回收。
(4)回收后的酶切片段以及载体用T4连接酶(NEB)连接，转化并扩增目标质粒：将步骤(3)酶切完成的质粒和PCR产物片段用T4连接酶连接，获得目标质粒pFRT-PD1-G4S-HA。将扩增质粒转入TOP10感受态细胞(Transgen Biotech)中进行扩增(转化步骤参照Transgen Biotech CD101产品说明书进行)。
(5)测序鉴定：挑取转化了目标片段的阳性单克隆(随机挑取六个克隆，提取质粒后EcoRI,XhoI进行酶切，经琼脂糖凝胶电泳分析有500bp片段的为阳性克隆)，并进行测序(Biosune)。
测序结果显示，经酶切鉴定为阳性的克隆包含了正确的Seq ID No.2～Seq ID No.5的碱基序列。
实施例2、构建PDL1-Fc表达载体
为提高PD-1与其配体PDL1的亲和力，还需构建能够表达PDL1的质粒，本实施例中，我们将将PDL1胞外区C端偶联人的IgG1Fc序列，在293-F细胞中表达。
其中，人的IgG1Fc结构区域既可以用于蛋白纯化(Fc与修饰了Protein A的珠子有很高的亲和力)，也可以用于亲和力检测时，与抗人的IgG1Fc的流式标签抗体结合。
人的IgG1Fc序列包括铰链区、CH2和CH3序列，碱基序列如Seq ID No.14所示，Protein A是一种金黄色葡萄球菌细胞壁蛋白质，能特异性地与人和哺乳动物抗体(主要是IgG)的Fc区结合。
扩增PDL1的引物对序列如下所示：
引物KpnI-SP-P1序列如Seq ID No.8所示：
引物Opti-PDL1-Fc-R序列如Seq ID No.11所示：
扩增Fc的引物对如下Seq ID No.9、10所示：
XhoI-Fc-P2序列如Seq ID No.9所示：
pti-PDL1-Fc-F序列如Seq ID No.10所示：
扩增模板为本实验室自行保存的包含目标片段DNA序列的质粒：
pUC57-opti-PD-L1模板，其中包含PD-L1碱基序列，
pCEP4-3f8-Fc模板，其中包含Fc(human IgG1)碱基序列，
1、构建并扩增pCEP4-PDL1-Fc质粒，步骤如下：
(1)引物KpnI-SP-P1及Opti-PDL1-Fc-R自pUC57-opti-PD-L1模板扩增出PD-L1片段；
(2)引物XhoI-Fc-P2及Opti-PDL1-Fc-F自pCEP4-3f8-Fc模板扩增出Fc片段；
(3)通过Overlap PCR将两片段进行连接，Overlap PCR所用引物为KpnI-SP-P1及XhoI-Fc-P2，获得纯化的连接产物后，用KpnI及XhoI进行酶切，与同样经KpnI及XhoI酶切后的表达载体pCEP4连接后，获得pCEP4-PDL1-Fc质粒；
(4)将pCEP4-PDL1-Fc质粒转入TOP10感受态细胞(Transgen Biotech，转化步骤参照Transgen Biotech CD101产品说明书进行)，挑取阳性克隆进行测序，显示pCEP4-PDL1-Fc质粒中正确插入了PDL1-Fc序列片段。
信号肽2-PDL1-Fc的序列为Seq ID No.12所示，
信号肽2的序列如Seq ID No.13所示：
PD-L1胞外区的序列如Seq ID No.14所示：
人IgG1的Fc区序列如Seq ID No.15所示：
2、转染并培养293F细胞以表达PDL1-Fc蛋白
将测序正确的pCEP4-PDL1-Fc质粒经无内毒素质粒大提试剂盒(Tiangen无内毒素质粒大提试剂盒，具体操作按照说明书进行)进行质粒提取，转染293-F细胞，293-F细胞培养及转染过程参照FreeStyleTM MAX293Expression System(Thermo Scientific，货号：K900010)。
3、PDL1-Fc蛋白的回收及纯化
(1)转染后摇床继续培养6天，200g离心3分钟去掉细胞，10000g离心10分钟去掉培养基中的杂质；
(2)用30kd浓缩管在3800rmp条件下，4℃离心浓缩致原体积十分之一左右；
(3)蛋白纯化所用缓冲液及步骤均参照PierceTM Protein A Chromatography Cartridges(Thermo Scientific，货号：89924)，纯化后的PDL1-Fc经nanodrop测定蛋白浓度，定量至浓度为1mg/ml。
4、电泳检测PDL1-Fc蛋白
取适量体积的蛋白质样品在SDS-PAGE胶上进行电泳，将电泳后的SDS-PAGE置于考马斯亮蓝染色液中染色2h，染色完成后置于脱色液中脱色过夜，观察蛋白条带位置及蛋白纯化质量。结果如图1所示，纯化后的PDL1-Fc分子量约为72KD(Fermentas预染蛋白Marker，货号：26616，Marker中的红色条带为72KD)。图中Herceptin是作为阳性对照的纯化后的人IgG1抗体，其重链及轻链分子量分别为55KD及25KD，图中最右边条带为纯化后PDL1-Fc。
实施例3、表面展示PD-1胞外区的细胞(CHO-PD1)的构建
利用现有的CHO细胞系统(可参见我们的在先专利CN104531623B)构建将PD-1胞外区展示在细胞表面的CHO细胞系，构建过程如图2所示
1、我们前期利用重组酶介导的盒式替换技术建立了只含有一个拷贝重组替换位点的细胞株PuroR-14，该细胞株为CN104531623B中构建的PuroR-14细胞株，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC)，编号CGMCC No.9717，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。将质粒pCI-Flp-2A-Cre(本实验室构建，含重组酶)与实施例1中构建的质粒pFRT-PD1-G4S-HA共转染到该细胞株，通过重组酶Flp和Cre的作用，将PD1成功展示到细胞表面。
2、将转染后的CHO细胞培养48h，胰酶消化后收集细胞。PD-1胞外区被展示在CHO细胞表面后，由于其C端带HA标签，展示效率可用抗HA的流式标签抗体检测。用抗HA标签的抗体(Rabbit Anti-HA tag IgG：APC兔抗HA抗体(1：100稀释)，Cayman，货号：13406)标记细胞，流式分选展示PD1胞外区的阳性细胞用于PD1胞外区的亲和力进化实验。
3、经流式细胞仪分选出的表面展示了带HA标签的PD1胞外区的细胞命名为CHO-PD1，细胞生长至107个/ml时，胰酶消化离心收集细胞后重悬于1ml无血清培养基Opti-MEM中，与实施例2制备得到的纯化的PDL1-Fc蛋白在4℃下进行孵育(纯化PDL1-Fc蛋白的浓度为1mg/ml，用无血清培养基Opti-MEM 1：1000稀释，然后每个样本加1ul即1ngPDL1-Fc)，30min后用PBS洗去非特异性结合PDL1-Fc蛋白。
4、将细胞分别用：
(1)标记HA标签的抗体进行标记(来源同上)，标记细胞表面展示的PD1；
及(2)标记Fc的带PE荧光基团的抗体进行标记(Anti-Human IgG(Fc gamma-specific)PE，ebioscience，1：200稀释，货号：12-4998-82)，标记结合的PDL1-Fc；
流式细胞仪检测PD1的展示率及与PDL1-Fc的结合亲和力。
检测结果如图3所示：对照细胞为未替换PD1的细胞株(PuroR-14)，横坐标为PD1与PDL1-Fc的亲和力，纵坐标为PD1的展示效率。(本研究中所用流式细胞仪均为BD公司生产，相关操作步骤及软件由仪器供应商指定。)
实施例4、对PD1胞外区与PDL1的亲和力进行人工进化
体细胞突变(SHM，somatichypermutation)结合胞嘧啶脱氨酶诱导激活(AID，activation-induced cytidinedeaminase)技术，能够在细胞增殖过程中，诱导目标蛋白的氨基酸序列变化，从而改善目标蛋白的亲和力、稳定性或专一性等性质(可参见我们的在专利CN104531623B)。通过该技术，对展示在CHO-PD1细胞表面的PD1胞外区与PDL1-Fc分子的亲和力进行人工进化，每轮的步骤及流程如图4所示。
向实施例3中制备的CHO-PD1的细胞中转入AID并进行目标分子的人工进化的方法可参考CN104531623B，具体如下：
1、将AID转入实施例3制备获得的CHO-PD1细胞株：将约2x105个CHO-PD1细胞转染pCEP4-Ig-Ek-NEO-mAID质粒(本实验室保存)，该质粒为表达AID基因的质粒，带有neo基因，为G418抗性，在培养基中加入G418可以维持AID基因持续表达。
2、将转入pCEP4-Ig-Ek-NEO-mAID质粒的CHO-PD1细胞置于含有G148抗生素的培养基中培养7天(细胞增殖到约2x108个，随着细胞的增殖，转入的AID随机突变PD1胞外区的基因序列，产生大量的随机突变型的PD1胞外区分子并将其展示在细胞表面)，胰酶消化后收集大约1x108个细胞，用抗HA标签的抗体(Rabbit Anti-HA tag IgG:APC兔抗HA抗体，1：100稀释，Cayman，货号：13406)和PDL1-Fc融合蛋白在4℃下共同标记细胞。
2、流式分选出亲和力最高的部分细胞(约占总细胞的0.02～0.05％)，分选后的细胞置于无G418抗生素的培养基中培养3天，细胞扩增到约2x105个以上时，取2x105个细胞重新转染pCEP4-Ig-Ek-NEO-mAID质粒进行下一轮进化，其余的细胞继续扩增用于验证本轮的进化效果。
第一轮人工进化的结果如图5所示，用流式细胞仪AriaIII将图5中P3区域(AID诱导突变后，产生高活性突变的细胞)中的细胞分选出来，进行扩增培养，检测P3区域中的CHO-PD1细胞表面所展示的PD1胞外区分子与PDL1-Fc结合的亲和力，检测方法同实施例3，检测结果如图6所示，图中CHO-PD1-G4S-HA-S1样本为收集到的目标细胞，CHO-PD1-G4S-HA-S0为未进行人工进化的原始CHO-PD1细胞株，CHO-PD1-G4S-HA-S0+AID为刚转染了AID质粒且未进行增殖培养和筛选的CHO-PD1细胞株，结果可见，分选到的P3区域的细胞株表面展示的PD1胞外区分子对于PDL1-Fc的亲和力有明显提高。
在第一轮分选到的细胞(S1代细胞)的基础上，按照上述实验流程，再进行三轮人工进化，共计进化四轮，收集每轮进化的P3区域细胞，分别命名为CHO-PD1-G4S-HA-S2～S4，同样方法检测进化后的PD1胞外区与PDL1-Fc的亲和力，结果见图7，可见，随着进化轮次的提升，进化后的PD1胞外区分子与PDL1-Fc分子的亲和力有大幅提升。
实施例5、PD1胞外区突变体的鉴定及PD1-Fc融合蛋白的构建与检测
提取每轮进化后的S1～S4代的典型细胞的基因组，检测进化后的PD1胞外区突变体的序列结构。
1、每轮进化后分选出的P3区域的细胞，在无G418的培养基中扩增细胞后提取全基因组，基因组提取采用Genomic DNA Purification Kit提取试剂盒(Promega)提取，具体操作按照说明书进行。以基因组为模板，用引物
PD1-NheI-SP-F：序列如SEQ ID No.16所示；
PD1-XhoI-HA-R：序列如SEQ ID No.17所示。
2、扩增出转入的PD1胞外区序列，经核酸内切酶(NheI，XhoI，NEB)酶切后回收，连接于pCDNA3.1(+)质粒上(本实验保存)，随机挑取50个克隆进行测序，与野生型PD-1碱基序列比对检测有无突变发生。测序及比对结果显示：经过4轮的进化和分选，共获得30余个含有不同氨基酸突变或者氨基酸突变组合的突变体。
3、随机挑选其中21个突变体(突变体相比于野生型PD1胞外区的突变的氨基酸见下表1)将上述各种突变体连入pCDNA3.1(+)质粒(该质粒含有突变的PD-1序列及G4S-HA序列，可以瞬时表达在细胞表面，用于检测突变体的亲和力)后瞬时转染CHO/dhFr-细胞，48小时后收集细胞，经标记后流式检测不同PD1胞外区突变体对PDL1-Fc蛋白的结合能力(具体检测方法与实施例3所述一致)。结果如图8所示：mut1及mut2、mut3相对于其它突变体，与PDL1-Fc蛋白具有更高的结合能力。其中，mut1含有三个氨基酸突变，mut2含有两个氨基酸突变，mut3含有一个氨基酸突变。对突变体6～21的亲和力的归一化处理数据结果见下表2。
表1、PD1胞外区突变体突变氨基酸位点分析
突变体编号 突变位点分析 突变体编号 突变位点分析 Mut1 L46M、A99V、K102E Mut12 I110V、K102E Mut2 A99V、K102E Mut13 A17D、K102E Mut3 A99V Mut14 L46V、K102E Mut4 L46M、A99V Mut15 S29G、K102E Mut5 K102E Mut16 S76P、K102E Mut6 Q66H Mut17 L32M、K102E Mut7 A17V Mut18 W83S、K102E Mut8 R52G Mut19 L89P、K102E Mut9 N33S、K102E Mut20 A17V、K102E Mut10 S54T、K102E Mut21 E117G、K102E Mut11 E13G、K102E
表2、突变体6～21的亲和力的归一化数据处理结果
野生型PD1胞外区(WT PD1)的氨基酸序列如Seq ID No.23所示。
4、突变体亲和力检测：
4.1、融合蛋白PD1(WT)-Fc以及融合蛋白PD1(mut1-5)-Fc的构建与制备
(1)根据流式细胞仪分选及测序结果，我们将PD1胞外区野生型序列(WT)及突变体1-5序列(mut1-5)的N端连接上信号肽(Seq ID No.2所示信号肽)，C端连接上人IgG Fc片段后，构建在pCEP4载体上形成表达载体pCEP4-PD1(Mut)-Fc和pCEP4-PD1(WT)-Fc，所用引物为：
PD1-SP-HindIII-F：序列如SEQ ID No.18所示；
Fc-BamHI-R：序列如SEQ ID No.19所示；
PD1-Fc-F：序列如SEQ ID No.20所示；
PD1-Fc-R：序列如SEQ ID No.21所示；
构建pCEP4-PD1(Mut)-Fc与pCEP4-PD1(WT)-Fc所用方法及步骤与实施例2中构建pCEP4-PDL1-Fc相同；
(2)将上述构建好的pCEP4-PD1(Mut)-Fc与pCEP4-PD1(WT)-Fc质粒纯化后分别转染293-F细胞，PD1胞外区(WT)与人IgGFc融合的融合蛋白PD1(WT)-Fc以及PD1胞外区突变体与人IgGFc融合的融合蛋白PD1(mut1-5)-Fc的表达及纯化与实施例2中所述的PDL1-Fc的表达纯化方法相同。
人IgG1的Fc区域的氨基酸序列如Seq ID No.24所示；
融合蛋白PD1(WT)-Fc的氨基酸序列如Seq ID No.25所示；
融合蛋白PD1(mut1)-Fc(L46M、A99V、K102E)的氨基酸序列如Seq ID No.26所示；
融合蛋白PD1(mut2)-Fc(A99V、K102E)的氨基酸序列如Seq ID No.27所示；
融合蛋白PD1(mut3)-Fc(A99V)的氨基酸序列如Seq ID No.28所示；
融合蛋白PD1(mut4)-Fc(L46M、A99V)的氨基酸序列如Seq ID No.29所示；
融合蛋白PD1(mut5)-Fc(K102E)的氨基酸序列如Seq ID No.30所示；
4.2、融合蛋白PDL1-his的构建
(1)构建pCEP4-PDL1-his质粒用于表达PDL1蛋白，所用引物为：
KpnI-SP-P1：序列如SEQ ID No.8所示；
XhoI-O-PDL1-P2：序列如SEQ ID No.22所示；
所用方法及步骤与实施例1中构建pFRT-PD1-G4S-HA质粒相同。
将上述构建的质粒纯化后转染293-F细胞，PDL1-his在293-F中表达后，用镍柱进行纯化，步骤为：
1)将上清加到填有硫酸镍(NiSO4)的Sepharose High Performance(Amersham Bioscience)的层析柱中；
2)用分别含有30、60、90、120、250mM咪唑的磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱液，将洗脱液用超滤管浓缩后即得。
4.3、检测突变体PD1蛋白的亲和力
PD1(WT)-Fc蛋白、PD1(mut1～5)-Fc蛋白与其配体PDL1-his蛋白的亲和力测定使用ForteBio Octet分子相互作用技术平台(Octet biomolecular interaction technology Platform，ForteBio Octet,USA)进行测定。具体步骤和条件如下：
(1)用7根抗人Fc片段动能传感器(Anti-hFc kinetic grade biosensors(ForteBio:18-5060,USA))检测抗体的亲和力，检测条件为:
(i)基线(baseline)240s；
(ii)上样(loading)240s；
(iii)基线(baseline)180s；
(IV)结合(association)120s(结合过程中抗原浓度分别为1600nM，800nM，400nM，200nM，100nM，50nM，25nM)；
(V)解离(dissociation)180s。
Kon and Koff由系统软件根据结合和解离曲线拟合得到，而Kd值则是通过Koff/Kon计算得出。
结果如下表3所示：
表3、蛋白和PDL1的结合常数
样品名称 KD值(M) Kon值(1/Ms) Koff值(1/s) WT 3.346×10-8 68800 2.302×10-3 Mut1 4.46×10-10 181700 8.102×10-5 Mut2 5.317×10-10 156000 8.294×10-5 Mut3 2.555×10-9 69710 1.781×10-4 Mut4 1.772×10-8 119300 2.114×10-3 Mut5 2.228×10-8 49250 1.098×10-3
结果显示：mut1及mut2、mut3相对于其它突变体，与带his标签的PDL1蛋白具有更高的结合能力。其中，mut1含有三个氨基酸突变，mut2含有两个氨基酸突变，mut3含有一个氨基酸突变。
实施例6、PD1(mut1-5)-Fc热稳定性测试
测试突变后的PD1-Fc融合蛋白的热力学稳定性。
将纯化的PD1(WT)-Fc及PD1(mut1-5)-Fc稀释至4uM，经sypro-orange染色后，用Applied实时定量PCR系统测定上述蛋白热力学稳定性，sypro-orange染料可以与蛋白暴露的疏水区域结合并发出荧光，Protein Thermal ShiftTM软件可识别Applied实时定量PCR仪器生成的文件来从而分析蛋白熔解温度)，经Protein Thermal ShiftTM软件计算结果，得出如表4所示数据：
表4、融合蛋白热力学稳定性
该实验重复三次，有很好的一致性，可见，PD1(mut1-5)-Fc与PD1(WT)-Fc相比，其热力学稳定性没有明显的变化。
实施例7、PD1(mut1-5)-Fc与PDL1的竞争性结合分析
通过流式细胞仪检测PD1(mut1-5)-Fc与PD1(WT)-Fc对PDL1的竞争性结合情况
(1)将本实验室保存的质粒pEGFP-N1-PDL1瞬时转染293T细胞(实验室保存)，48小时后收集2X107个表面展示了PDL1胞外区的细胞；
(2)按照参考文献的方法制备野生型PD1和鼠源的IgG2a Fc融合的融合蛋白PD1-mFc(Suppression of human T-cell responses to beta-cells by activation of B7-H4pathway.Cell Transplant.2006；15(5):399-410.Ou D1,Wang X,Metzger DL,Ao Z,Pozzilli P,James RF,Chen L,Warnock GL.)，其中的质粒pMIgV质粒由本实验室保存；
(3)向上述细胞中加入纯化的野生型PD1-mFc1ug，混匀；
(3)分别加入不同比例的上述实施例中纯化得到的PD1(WT)-Fc、PD1(mut3)-Fc及PD1(mut2)-Fc，置于4℃孵育三十分钟，使加入的蛋白的与竞争性结合情况，其中，
1)CTR为空白对照；
2)CTR-O为细胞仅与PD1-mFc混合，不加上述竞争样本；
3)PD1(WT)-Fc样本分别加入0.33ug、1ug、3ug、9ug；
4)PD1(mut2)-Fc样本分别加入0.04ug、0.08ug、0.17ug、0.34ug；
5)PD1(mut3)-Fc样本分别加入0.04ug、0.08ug、0.17ug、0.34ug、0.75ug、1.5ug；
(4)PBS洗去非特性结合蛋白，加入荧光二抗anti-mIgG-APC(APC标记的抗鼠Fc的荧光二抗)(ebioscience)在4℃继续孵育二十分钟；
(5)洗去非特性结合的二抗，流式细胞仪检测APC荧光信号，检测的荧光信号的强度及反应PD1(WT)-Fc和PD1(mut)-Fc与PD1-mFc竞争结合PDL1(PDL1分子展示在步骤(1)制备的293细胞的表面)能力。
结果如下图9所示：纵坐标为细胞数，横坐标为APC荧光信号，即APC信号越弱，表示这种PD1-Fc的竞争能力越强。结果可见：PD1(WT)-Fc无法与PD1-mFc竞争结合PD-L1，而PD1(mut3)-Fc和PD1(mut2)-Fc均可以有效与PD1-mFc与竞争性结合PDL1，尤其是PD1(mut2)-Fc的竞争结合更为高效，在低至0.04ug时仍然可以高效替换PD1-mFc与PDL1的结合。
实施例8、PD1(WT)-Fc及PD1(mut3)-Fc蛋白分子量的测定
本工作制备的PD1-Fc融合蛋白，理论上会形成类似于抗体的二聚体形式，其结构如下图10所示，这样PD1融合蛋白的分子量会在90KD左右，我们用超速离心的方法对前述PD1(WT)-Fc蛋白及PD1(mut3)-Fc蛋白进行分子量测定(BECKMAN COULTER ProteomeLabTMXL-1,50000rpm,5hour,各蛋白浓度调整为0.8mg/ML)，结果如图11所示，图中，标准品为商品化的的Anti-CRP antibody IgG，该抗体分子量为150KD，PD1(WT)-Fc融合蛋白的分子量为92.2KD，PD1(mut3)-Fc融合蛋白的分子量约为90KD，与预期一致。
最后需要说明的是，以上实施例仅用作本领域技术人员理解本发明的实质，不用做对本发明保护范围的限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 海珂分子（北京）科技有限责任公司
<120> 高亲和力的PD1胞外区突变体多肽及相关融合蛋白
<130> CP11802212C
<160> 30
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 408
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgacccggc tgaccgtgct ggccctgctg gccggcctgc tggcctcctc cagggccccc 60
cctactttct cccctgccct gctggtggtc accgaggggg acaatgctac cttcacatgc 120
agcttttcca acacatctga aagtttcgtg ctgaattggt acaggatgtc acctagcaac 180
cagactgata agctggccgc ttttccagag gaccggagcc agccaggaca ggattgccga 240
ttccgggtca cccagctgcc aaatggccgc gactttcaca tgtccgtggt ccgagcccgg 300
agaaacgatt ctggcacata cctgtgcgga gcaatcagtc tggcaccaaa ggcacagatc 360
aaggagtctc tgagagctga actgagggtg accgagaggc gcgcagaa 408
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgacccggc tgaccgtgct ggccctgctg gccggcctgc tggcctcctc cagggcc 57
<210> 3
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccccctactt tctcccctgc cctgctggtg gtcaccgagg gggacaatgc taccttcaca 60
tgcagctttt ccaacacatc tgaaagtttc gtgctgaatt ggtacaggat gtcacctagc 120
aaccagactg ataagctggc cgcttttcca gaggaccgga gccagccagg acaggattgc 180
cgattccggg tcacccagct gccaaatggc cgcgactttc acatgtccgt ggtccgagcc 240
cggagaaacg attctggcac atacctgtgc ggagcaatca gtctggcacc aaaggcacag 300
atcaaggagt ctctgagagc tgaactgagg gtgaccgaga ggcgcgcaga a 351
<210> 4
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggtggtggtg gttct 15
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tatccatatg atgttccaga ttatgct 27
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atacgcgaat tcatgacccg gctgaccgtg ctggccc 37
<210> 7
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ctgtcctcga gagcataatc tggaacatca tatggataag aacc 44
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgactggtac catgacccgg ctgaccgtgc t 31
<210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctgtcctcga gttattattt acccggagac agggagaggc 40
<210> 10
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ccccgaggaa aaccatactg cagagctggt catcgagccc aaatcttgtg acaaaactca 60
cacatgccc 69
<210> 11
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gggcatgtgt gagttttgtc acaagatttg ggctcgatga ccagctctgc agtatggttt 60
tcctcgggg 69
<210> 12
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
atgacccggc tgaccgtgct ggccctgctg gccggcctgc tggcctcctc cagggccgct 60
tttacagtca cggttcccaa ggatctgtac gtggtcgagt atggcagcaa tatgaccatc 120
gagtgcaagt tccctgtgga aaaacagctg gacctggccg ctctgattgt ctactgggag 180
atggaagata agaacatcat tcagtttgtg cacggcgagg aagacctgaa agtccagcat 240
agctcctata ggcagcgagc acgactgctg aaggaccagc tgtccctggg gaatgcagcc 300
ctgcagatca ctgacgtgaa actgcaggat gccggagtct accggtgcat gatctcttac 360
ggcggggctg attataagag aattaccgtg aaagtcaacg caccttataa caagatcaat 420
cagcggattc tggtggtcga cccagtgact agtgagcacg aactgacctg tcaggctgag 480
ggctacccaa aggcagaagt gatctggacc tctagtgatc atcaggtcct gtcagggaaa 540
accacaacta ccaacagcaa gagggaggaa aaactgttca atgtgacctc cacactgcgc 600
atcaacacaa ctaccaatga gattttctat tgcacatttc ggagactgga ccccgaggaa 660
aaccatactg cagagctggt catcgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca 720
ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 780
aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 840
cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 900
aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 960
gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1020
ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1080
gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1140
ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1200
gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1260
agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1320
atgcatgagg gtctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1380
taataa 1386
<210> 13
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
atgacccggc tgaccgtgct ggccctgctg gccggcctgc tggcctcctc cagggccgct 60
<210> 14
<211> 624
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tttacagtca cggttcccaa ggatctgtac gtggtcgagt atggcagcaa tatgaccatc 60
gagtgcaagt tccctgtgga aaaacagctg gacctggccg ctctgattgt ctactgggag 120
atggaagata agaacatcat tcagtttgtg cacggcgagg aagacctgaa agtccagcat 180
agctcctata ggcagcgagc acgactgctg aaggaccagc tgtccctggg gaatgcagcc 240
ctgcagatca ctgacgtgaa actgcaggat gccggagtct accggtgcat gatctcttac 300
ggcggggctg attataagag aattaccgtg aaagtcaacg caccttataa caagatcaat 360
cagcggattc tggtggtcga cccagtgact agtgagcacg aactgacctg tcaggctgag 420
ggctacccaa aggcagaagt gatctggacc tctagtgatc atcaggtcct gtcagggaaa 480
accacaacta ccaacagcaa gagggaggaa aaactgttca atgtgacctc cacactgcgc 540
atcaacacaa ctaccaatga gattttctat tgcacatttc ggagactgga ccccgaggaa 600
aaccatactg cagagctggt catc 624
<210> 15
<211> 702
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccagcacc tgaactcctg 60
gggggaccgt cagtcttcct cttcccccca aaacccaagg acaccctcat gatctcccgg 120
acccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccctga ggtcaagttc 180
aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240
tacaacagca cgtaccgtgt ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgcaccagga ctggctgaat 300
ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc cagcccccat cgagaaaacc 360
atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa ccacaggtgt acaccctgcc cccatcccgg 420
gatgagctga ccaagaacca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 480
gacatcgccg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540
cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca agctcaccgt ggacaagagc 600
aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgagggtct gcacaaccac 660
tacacgcaga agagcctctc cctgtctccg ggtaaataat aa 702
<210> 16
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
atacgcgaat tcatgacccg gctgaccgtg ctggccc 37
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ctgtcctcga gagcataatc tggaacatca tatggataag aacc 44
<210> 18
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
atacgcaagc ttgccaccat gacccggctg accgtgctgg ccc 43
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
atacgcggat ccttattatt tacccggaga cagggagagg c 41
<210> 20
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gggtgaccga gaggcgcgca gaagagccca aatcttgtga caaaactcac acatgccc 58
<210> 21
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gggcatgtgt gagttttgtc acaagatttg ggctcttctg cgcgcctctc ggtcaccc 58
<210> 22
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ctgtcctcga gttattagtg atgatgatga tgatggtgat gatgatgatg atgagaacca 60
ccaccaccga tgaccag 77
<210> 23
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 23
Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn
1 5 10 15
Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu
20 25 30
Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala
35 40 45
Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val
50 55 60
Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala
65 70 75 80
Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala
85 90 95
Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr
100 105 110
Glu Arg Arg Ala Glu
115
<210> 24
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 24
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
1 5 10 15
Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
20 25 30
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
35 40 45
Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
50 55 60
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
85 90 95
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
100 105 110
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
115 120 125
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
145 150 155 160
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 25
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn
1 5 10 15
Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu
20 25 30
Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala
35 40 45
Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val
50 55 60
Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala
65 70 75 80
Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala
85 90 95
Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr
100 105 110
Glu Arg Arg Ala Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
115 120 125
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
130 135 140
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
145 150 155 160
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
165 170 175
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
180 185 190
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
195 200 205
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
210 215 220
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
225 230 235 240
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
245 250 255
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
260 265 270
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
275 280 285
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
290 295 300
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
305 310 315 320
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn
325 330 335
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345
<210> 26
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 26
Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn
1 5 10 15
Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu
20 25 30
Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Met Ala Ala
35 40 45
Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val
50 55 60
Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala
65 70 75 80
Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala
85 90 95
Pro Lys Val Gln Ile Glu Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr
100 105 110
Glu Arg Arg Ala Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
115 120 125
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
130 135 140
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
145 150 155 160
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
165 170 175
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
180 185 190
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
195 200 205
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
210 215 220
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
225 230 235 240
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
245 250 255
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
260 265 270
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
275 280 285
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
290 295 300
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
305 310 315 320
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn
325 330 335
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345
<210> 27
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 27
Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn
1 5 10 15
Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu
20 25 30
Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala
35 40 45
Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val
50 55 60
Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala
65 70 75 80
Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala
85 90 95
Pro Lys Val Gln Ile Glu Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr
100 105 110
Glu Arg Arg Ala Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
115 120 125
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
130 135 140
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
145 150 155 160
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
165 170 175
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
180 185 190
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
195 200 205
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
210 215 220
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
225 230 235 240
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
245 250 255
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
260 265 270
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
275 280 285
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
290 295 300
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
305 310 315 320
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn
325 330 335
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345
<210> 28
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 28
Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn
1 5 10 15
Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu
20 25 30
Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala
35 40 45
Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val
50 55 60
Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala
65 70 75 80
Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala
85 90 95
Pro Lys Val Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr
100 105 110
Glu Arg Arg Ala Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
115 120 125
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
130 135 140
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
145 150 155 160
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
165 170 175
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
180 185 190
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
195 200 205
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
210 215 220
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
225 230 235 240
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
245 250 255
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
260 265 270
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
275 280 285
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
290 295 300
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
305 310 315 320
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn
325 330 335
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345
<210> 29
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 29
Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn
1 5 10 15
Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu
20 25 30
Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Met Ala Ala
35 40 45
Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val
50 55 60
Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala
65 70 75 80
Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala
85 90 95
Pro Lys Val Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr
100 105 110
Glu Arg Arg Ala Glu Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys
115 120 125
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
130 135 140
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
145 150 155 160
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
165 170 175
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
180 185 190
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
195 200 205
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
210 215 220
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
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<210> 30
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 30
Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn
1 5 10 15
Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val Leu
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