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1、10申请公布号CN101978053A43申请公布日20110216CN101978053ACN101978053A21申请号200880000633522申请日20080909C12N15/09200601C12C11/02200601C12G1/02200601C12N1/1920060171申请人三得利控股株式会社地址日本大阪府72发明人畠中治代大村文彦74专利代理机构隆天国际知识产权代理有限公司72003代理人高龙鑫54发明名称葡萄糖诱导性失活及降解抗性转运蛋白基因及其用途57摘要本发明涉及对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白的基因及其用途，特别涉及具有优异的低聚糖麦芽糖、麦芽三。
2、糖等分解性的酿造酵母、使用该酵母制造的酒类、其制造方法等。特别是本发明涉及MAL21P等对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白、编码该转运蛋白的基因、利用该转运蛋白的酒类的制造方法等。85PCT申请进入国家阶段日2009022586PCT申请的申请数据PCT/JP2008/0662412008090987PCT申请的公布数据WO2010/029612JA2010031851INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书13页序列表18页附图13页CN101978058A1/1页21多核苷酸，其特征在于，选自由下述AF所组成的组中，A多核苷酸，其含有由序列号1。
3、的碱基序列组成的多核苷酸，B多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸，C多核苷酸，其含有编码转运蛋白的多核苷酸，该转运蛋白由序列号2的氨基酸序列中115个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成、且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性，D多核苷酸，其含有编码转运蛋白的多核苷酸，该转运蛋白具有与序列号2的氨基酸序列有90以上同一性的氨基酸序列、且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性，E多核苷酸，其含有与由序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白的多核苷酸，以及F多核苷酸，其含有与编码由序列号2的。
4、氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白的多核苷酸。2如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，选自由下述GI所组成的组中，G多核苷酸，其含有编码转运蛋白的多核苷酸，该转运蛋白由序列号2的氨基酸序列或序列号2的氨基酸序列中15个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成、且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性，H多核苷酸，其含有编码转运蛋白的多核苷酸，该转运蛋白具有与序列号2的氨基酸序列有97以上的同一性的氨基酸序列、且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性，I多核苷酸，其含有由序列号1的碱基序列。
5、组成的多核苷酸，或者含有与由序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交、且编码对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白的多核苷酸。3如权利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于，含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸。4如权利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于，含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。5如权利要求14中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，其为DNA。6蛋白质，其特征在于，其为被权利要求15中任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。7载体，其特征在于，含有权利要求15中任一项所述的多核苷酸。8转化酵母，其特征在于，其中导入了权利要求7所述的载体。9如。
6、权利要求8所述的酿造用酵母，其特征在于，通过导入权利要求7所述的载体，提高了低聚糖分解能力。10如权利要求9所述的酿造用酵母，其特征在于，通过增加权利要求6所述的蛋白质的表达量，提高了低聚糖分解能力。11酒类的制造方法，其特征在于，使用权利要求810中任一项所述的酵母。12如权利要求11所述的酒类的制造方法，其特征在于，酿造的酒类是麦芽饮料。13如权利要求12所述的酒类的制造方法，其特征在于，酿造的酒类是葡萄酒。14酒类，其特征在于，其为利用权利要求1113中任一项所述的方法制造的酒类。权利要求书CN101978053ACN101978058A1/13页3葡萄糖诱导性失活及降解抗性转运蛋白基因。
7、及其用途技术领域0001本发明涉及葡萄糖诱导性失活/降解抗性转运蛋白基因及其用途，特别涉及具有优异的低聚糖麦芽糖、麦芽三糖等分解性的酿造酵母、使用该酵母制造的酒类及其制造方法等。背景技术0002在制造啤酒、发泡酒、威士忌等麦芽发酵饮料时，将麦芽等进行糖化后的麦汁中含有的糖主要为葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖这3种。这些来自麦芽的糖的比率，可根据糖化方法发生若干变化，但在不添加酶剂、不添加糖化淀粉等的情况下，没有大的改变，可以说为大约151的比例。其中，葡萄糖是单糖，是最适合于酵母的糖，首先被分解。0003在葡萄糖存在下，酵母中有多种基因的转录过程受到抑制。将这种抑制控制称为葡萄糖阻遏。将麦芽糖、麦芽。
8、三糖转运到酵母中时所必须的多种转运蛋白均受到此抑制。并且已知受到葡萄糖阻遏的基因的产物，进一步被翻译后，在葡萄糖存在下也会失活。已知葡萄糖苷转运蛋白也属于这一类，在葡萄糖存在下被快速降解。因为麦芽糖、麦芽三糖分解的第一步骤是，通过该转运蛋白将其转运到酵母细胞内，所以如果转运蛋白被降解，那么这些分解也会停止。这就是将转运蛋白的表达称为分解的限速步骤的理由。0004非专利文献1BRONDIJK，TH，VANDERREST，ME，PLUIM，D，DEVRIES，YDE，STINGL，K，POOLMAN，B，ANDKONINGS，WN1998JBIOLCHEM27325，15352153570005非。
9、专利文献2MEDINTZ，I，WANG，X，HRADEK，T，ANDMICHELS，CA2000BIOCHEMISTRY3915，451845260006非专利文献3GADURA，N，ANDMICHELS，CA2006CURRGENET502，101114发明内容0007发明要解决的课题0008在这种情况下，期望提供表达不易因葡萄糖导致失活或降解的低聚糖转运蛋白、使麦芽糖等低聚糖的分解性提高的酵母。0009解决课题的方法0010本发明者为了解决上述课题进行了精心研究，开发出了用于筛选不易因葡萄糖导致失活、降解的转运蛋白以下称为“对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性转运蛋白”或筛选使其表达的酵母的新。
10、方法，并且根据该筛选方法，找到了对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白或包含其的酵母，从而完成了本发明。0011即本发明涉及编码对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白的基因、被该基因编码的转运蛋白、该基因的表达受到调控的转化酵母、通过使用该基因的表达受到调控的酵母制造酒类的方法等。更加具体地说，本发明提供以下所示的多核苷酸、含有该多核苷酸的载体、导入了该载体的转化酵母、使用该转化酵母的酒类的制造方法等。00121多核苷酸，其为选自由下述AF所组成的组中的多核苷酸，说明书CN101978053ACN101978058A2/13页40013A多核苷酸，其含有由序列号1的核苷酸序列组成的多核。
11、苷酸，0014B多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸，0015C多核苷酸，其含有编码转运蛋白的多核苷酸，该转运蛋白由序列号2的氨基酸序列中115个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成、且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性，0016D多核苷酸，其含有编码转运蛋白的多核苷酸，该转运蛋白具有与序列号2的氨基酸序列有90以上同一性的氨基酸序列、且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性，0017E多核苷酸，其含有与由序列号1的核苷酸序列的互补核苷酸序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白的多核苷酸，以及0018F多核苷酸，。
12、其含有与编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的碱基序列的互补碱基序列所组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白的多核苷酸。00192如上述1所述的多核苷酸，其为选自由下述GI所组成的组中的多核苷酸，0020G多核苷酸，其含有编码转运蛋白的多核苷酸，该转运蛋白由序列号2的氨基酸序列或序列号2的氨基酸序列中15个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成、且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性，0021H多核苷酸，其含有编码转运蛋白的多核苷酸，该转运蛋白具有与序列号2的氨基酸序列有97以上的同一性的氨基酸序列、且对葡萄糖诱导性失活/降解具。
13、有抗性，0022I多核苷酸，其含有与由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸，或者含有与由序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在高严谨条件下杂交、且编码对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白的多核苷酸。00233如上述1或2所述的多核苷酸，其含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸。00244如上述1或2所述的多核苷酸，其含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。00255如上述14中任一项所述的多核苷酸，其为DNA。00266蛋白质，其为被上述15中任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。00277载体，其含有上述15中任一项所述的多核苷酸。00288转化酵母，其中导入了上述7所。
14、述的载体。00299如上述8所述的酿造用酵母，其中，通过导入上述7所述的载体，低聚糖分解能力提高。003010如上述8所述的酿造用酵母，其中，通过增加上述6所述的蛋白质的表达量，低聚糖分解能力提高。003111酒类的制造方法，其中，使用上述810中任一项所述的酵母。003212如上述11所述的酒类的制造方法，其中，酿造的酒类是麦芽饮料。003313如上述12所述的酒类的制造方法，其中，酿造的酒类是葡萄酒。003414酒类，其为利用上述1113中任一项所述的方法制造的酒类。说明书CN101978053ACN101978058A3/13页50035发明的效果0036通过使用本发明涉及的酵母，具有可。
15、加快含有麦芽糖等低聚糖的酒醪的发酵速度的优点。本发明涉及的转运蛋白基因，可导入任何酿造用酵母或实验室酵母中。特别是在大量含有葡萄糖、果糖等单糖的发酵原液中含有本发明涉及的转运蛋白可转运的低聚糖麦芽糖、麦芽三糖、松二糖TURANOSE、海藻糖TREHALOSE等的情况下，更加有效。附图说明0037图1是表示实验室酵母株在2脱氧葡萄糖存在下生长繁殖的不同的图。0038图2表示MAL21基因的碱基序列。0039图3表示MAL21P的氨基酸序列。0040图41是MAL21P/MAL31P/MAL61P的氨基酸序列的比对图。0041图42是MAL21P/MAL31P/MAL61P的核苷酸序列的比对图。0。
16、042图43是接续图42。0043图44是接续图43。0044图5是表示具有MAL21/MAL61基因的菌株在2脱氧葡萄糖存在下生长繁殖的不同的图。0045图6是表示MAL21P及MAL61P在葡萄糖存在下的降解速度的图。0046图7是表示使MAL21/MAL61基因高表达的实验室株在麦芽糖培养基上的生长繁殖的图。0047图8是表示使MAL21基因高表达的下面啤酒酵母株的发泡酒或者发泡酒富含葡萄糖麦汁中的麦芽糖发酵速度的图。0048图9是表示使MAL21P转运蛋白高表达的上面啤酒酵母的麦汁中的麦芽糖发酵速度的图。0049图10是表示质粒PJHXSB的组成的图。0050图11是表示质粒PJHIX。
17、SB的组成的图。0051图12是表示质粒PYCGPY的组成的图。0052图13是表示质粒PUP3GLP的组成的图。具体实施方式0053本发明者认为，如果能够控制翻译后的转运蛋白因葡萄糖导致的失活或降解，即使在葡萄糖存在下，麦芽糖及麦芽三糖也可被酵母更高效地分解。基于这种想法进行精心研究，结果从自然界中发现了不易被降解的葡萄糖苷转运蛋白MAL21P，并且确认MAL21P的降解速度远远低于其他转运蛋白。0054此外，通过使新获取的不易因葡萄糖导致失活或降解的转运蛋白进行高表达，确实成功地提高了在麦芽糖培养基上的增殖速度，并且在啤酒酿造中可加快麦芽糖的分解速度。本发明根据这种设想和研究成果而得以完成。
18、。0055本发明中序列号16表示以下基因的碱基序列或以下转运蛋白的氨基酸序列。0056序列号1MAL21核苷酸序列0057序列号2MAL21P葡萄糖苷转运蛋白氨基酸序列说明书CN101978053ACN101978058A4/13页60058序列号3MAL31核苷酸序列0059序列号4MAL31P葡萄糖苷转运蛋白氨基酸序列0060序列号5MAL61核苷酸序列0061序列号6MAL61P葡萄糖苷转运蛋白氨基酸序列0062本说明书中使用的“葡萄糖苷转运蛋白”是指与葡萄糖苷的转运相关的蛋白质，作为葡萄糖苷转运蛋白，包括麦芽糖转运蛋白、麦芽三糖转运蛋白等。00631本发明的多核苷酸0064首先，本发明。
19、提供的多核苷酸是A多核苷酸，含有由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸；以及B多核苷酸，含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。多核苷酸可以是DNA，也可以是RNA。0065在本发明中作为对象的多核苷酸，并不限定于编码上述序列的蛋白质的多核苷酸，还包括编码与该蛋白质具有同等功能的蛋白质的其他多核苷酸。作为功能同等的蛋白质，可例举出，例如C由序列号2的氨基酸序列中115个优选为114个、113个、112个、111个、110个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个或1个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成、且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转。
20、运蛋白。0066作为这种蛋白质，可例举出，由序列号2的氨基酸序列中例如114个、113个、112个、111个、110个、110个、19个、18个、17个、16个1数个、15个、14个、13个、12个、1个氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成、且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白。上述氨基酸残基的缺失、取代、插入及/或添加的数量，通常情况下越小越好。此外，作为这种蛋白质，可例举，D具有与序列号2的氨基酸序列有90以上、91以上、92以上、93以上、94以上、95以上、96以上、97以上、98以上、99以上、991以上、992以上、993以上、994以上、995以上、。
21、996以上、997以上、998以上或999以上同一性的氨基酸序列，且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白。上述同源性的数值通常情况下越大越好。00670068在本发明中，对葡萄糖诱导性失活/降解的抗性，例如，可按以下方法进行评价。首先，确认表达各转运蛋白的菌株在含有02MM的2脱氧葡萄糖的包含2麦芽糖的完全合成培养基SCM无氨基酸酵母氮源YEASTNITROGENBASEW/OAMINOACIDS67G/L、麦芽糖20G/L、硫酸腺嘌呤20MG/ML、尿嘧啶20MG/ML、L色氨酸20MG/ML、L组氨酸盐酸盐20MG/ML、L精氨酸盐酸盐20MG/ML、L蛋氨酸20MG/ML、L酪氨酸。
22、30MG/ML、L亮氨酸30MG/ML、L异亮氨酸30MG/ML、L赖氨酸盐酸盐30MG/ML、L苯丙氨酸50MG/ML、L谷氨酸100MG/ML、L天冬氨酸100MG/ML、L缬氨酸150MG/ML、L苏氨酸200MG/ML、L丝氨酸400MG/ML或者在含有02MM的2脱氧葡萄糖的麦芽糖等的最小必需培养基无氨基酸酵母氮源YEASTNITROGENBASEW/OAMINOACIDS67G/L、麦芽糖等5G/L，但对于营养缺陷型转化株，含有其营养素上的生长繁殖状况，即使产生葡萄糖诱导性失活/降解信号的状态的酵母，也要筛选其转运蛋白具有麦芽糖转运活性并发挥作用的菌株。接着，将该菌株接种到YPD酵。
23、母浸膏10G/L、多聚蛋白胨20G/L、葡萄糖20G/L中，30振荡培养一夜。将说明书CN101978053ACN101978058A5/13页7培养液接种到YPM培养基酵母浸膏10G/L、多聚蛋白胨20G/L、麦芽糖5G/L中，使OD66010，30振荡培养25小时，并进行集菌。测取60个OD660单位的细胞，使其悬浮于预先在30保温的降解速度测定用培养基无氨基酸酵母氮源不含氨YEASTNITROGENBASEW/OAMINOACIDSANDAMMONIA17G/L、葡萄糖20G/L、环己酰亚胺25G/L30ML中，30进行温育。在适当的时间0、10、20、30及40分钟或者0、30、60、。
24、90及120分钟抽取细胞悬浮液样品5ML，快速离心弃除上清液，将细胞用乙醇干冰冷冻。根据通常方法从冷冻细胞中检测转运蛋白，测定蛋白条带的强度，由其减少速度计算半衰期。在本发明中优选的转运蛋白，例如，与MAL31P或MAL61P比较，具有2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、6倍以上或8倍以上的半衰期。0069本发明还提供E多核苷酸，其含有与由序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且编码对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白的多核苷酸；以及F多核苷酸，其含有与编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸在严谨条件下杂交、且。
25、编码对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白的多核苷酸。0070在本发明中优选的多核苷酸为上述AF中规定的多核苷酸、含有编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的多核苷酸、或者含有由序列号1的核苷酸序列组成的多核苷酸的多核苷酸。更优选为由序列号1特定的多核苷酸。0071在此，“在严谨条件下进行杂交的多核苷酸”是指，例如，以由序列号1的碱基序列的互补碱基序列组成的多核苷酸、或者编码序列号2的氨基酸序列的多核苷酸的全部或一部分作为探针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或SOUTHERN杂交法等所得到的多核苷酸例如DNA。作为杂交的方法，例如可使用MOLECULARCLONING3RDED。
26、、CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JOHNWILEYSONS19871997等中所记载的方法。0072本说明书中所述的“严谨条件”，可以为低严谨条件、中严谨条件及高严谨条件中的任一种。“低严谨条件”，例如为5SSC、5DENHARDT溶液、05SDS、50甲酰胺、32的条件。此外，“中严谨条件”，例如为5SSC、5DENHARDT溶液、05SDS、50甲酰胺、42的条件。“高严谨条件”，例如为5SSC、5DENHARDT溶液、05SDS、50甲酰胺、50的条件。在上述条件中，越提高温度，越能期待高效获得具有高同源性的DNA。但是，作为影响杂交的严谨性的因素。
27、，认为有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，如果是本领域技术人员，通过适当选择这些因素可实现同样的严谨性。0073此外，杂交中使用市售的试剂盒时，例如可使用ALKPHOSDIRECTLABELLINGREAGENTSAMERSHAMPHARMACIA公司制。此时，根据试剂盒中附带的说明方案，与标记后的探针保温过夜后，在55的条件下用含有01W/VSDS的1次洗涤缓冲液洗涤膜后，可检出杂交后的DNA。0074除上述以外，作为可杂交的DNA，可例举，通过FASTA、BLAST等同源性搜索软件，使用默认参数计算时，与编码序列号2或4的氨基酸序列的DNA有约90以上、91以上、。
28、92以上、93以上、94以上、95以上、96以上、97以上、98以上、99以上、991以上、992以上、993以上、994以上、995以上、996以上、997以上998以上、999以上同一性的DNA。0075此外，氨基酸序列、碱基序列的同一性，可使用根据KARLIN及ALTSCHUL的BLAST说明书CN101978053ACN101978058A6/13页8算法PROCNATLACADSCIUSA8722642268，1990；PROCNATLACADSCIUSA905873，1993决定。已开发了基于BLAST算法的被称为BLASTN、BLASTX的程序ALTSCHULSF，ETALJMO。
29、LBIOL215403，1990。使用BLASTN分析碱基序列时，参数例如为SCORE100、WORDLENGTH12。此外，使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如为SCORE50、WORDLENGTH3。使用BLAST和GAPPEDBLAST程序时，使用各程序的默认参数。00762本发明的蛋白质0077本发明提供被上述AI中任一个多核苷酸所编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质为由序列号2的氨基酸序列中115个优选114个、113个、112个、111个、110个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个或1个氨基酸发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成，且对葡萄。
30、糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白。0078作为这种蛋白质，可例举，由序列号2的氨基酸序列中上述数量的氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或添加后的氨基酸序列组成，且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白。此外，作为这种蛋白质，可例举，具有与序列号2的氨基酸序列有上述同源性的氨基酸序列，且对葡萄糖诱导性失活/降解具有抗性的转运蛋白。这种蛋白质，可使用MOLECULARCLONING3、CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY、“NUCACIDSRES，10，64871982”、“PROCNATLACADSCIUSA，79，64091982”、“GENE，34，3。
31、151985”、“NUCACIDSRES，13，44311985”、“PROCNATLACADSCIUSA，82，4881985”等所述的定点突变引入法而获得。0079本发明的多核苷酸涉及的蛋白质的氨基酸序列中115个优选为114个、113个、112个、111个、110个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个或1个氨基酸残基发生缺失、取代、插入及/或添加，是指在同一序列中的任意并且115个、114个、113个、112个、111个、110个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个或1个的氨基酸序列中的位置上，缺失、取代、插入及/或添加115个、1。
32、14个、113个、112个、111个、110个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个或1个的氨基酸残基，缺失、取代、插入及添加中的2种以上可同时发生。0080下面列举可互相取代的氨基酸残基，同一组中包含的氨基酸残基可互相取代。A组亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2氨基丁酸、蛋氨酸、O甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己丙氨酸；B组天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2氨基己二酸、2氨基辛二酸；C组天冬酰胺、谷氨酰胺；D组赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4二氨基丁酸、2，3二氨基丙酸；E组脯氨酸、3羟基脯氨酸、4羟基脯氨酸；F组丝氨酸、苏氨。
33、酸、高丝氨酸；G组苯丙氨酸、酪氨酸。0081本发明的蛋白质，也可以通过FMOC法芴甲氧羰基法、TBOC法叔丁氧羰基法等化学合成法制造。此外，也可以利用ADVANCEDCHEMTECH公司、PERKINELMER公司、PHARMACIA公司、PROTEINTECHNOLOGYINSTALLMENT公司、SYNTHECELLVEGA公司、PERSEPTIVE公司、岛津制作所等制造的肽合成仪进行化学合成。00823本发明的载体及导入该载体的转化酵母0083本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体，优选含有上述AI说明书CN101978053ACN101978058A7/13页9中任一项所述的多。
34、核苷酸DNA、或由序列号1的碱基序列组成的多核苷酸、或者编码由序列号2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。并且，本发明的载体通常以包含表达盒的形式构成，该表达盒包含的结构要素为X在酵母细胞内可转录的启动子；Y与该启动子以正向或反向连接的上述任一项所述的多核苷酸DNA；以及Z与RNA分子的转录终止及多聚腺苷化作用相关，在酵母内发挥作用的信号。此外，要使上述本发明的蛋白质进行高表达时，优选将上述AI中任一项所述的多核苷酸DNA以相对于该启动子的正向导入，以促进这些多核苷酸的表达。0084作为向酵母中导入时使用的载体，可利用多拷贝型YEP型、单拷贝型YCP型、染色体整合型YIP型中的任一种。例如，作。
35、为YEP型载体，已知有YEP24JRBROACHETAL，EXPERIMENTALMANIPULATIONOFGENEEXPRESSION，ACADEMICPRESS，NEWYORK，83，1983，作为YCP型载体，已知有YCP50MDROSEETAL，GENE，60，237，1987，作为YIP型载体，已知有YIP5KSTRUHLETAL，PROCNATLACADSCIUSP，76，1035，1979，且容易获得。此外，也可使用染色体整合型的PUP3GLPOMURA，FETAL，FEMSMICROBIOLLETT，194，207，2001图13、PJHIXSB图11、PYCGPYKODAM。
36、A，YETAL，APPLENVIRONMICROBIOL，67，3455，2001图12、PJHXSB图10等单拷贝复制型的质粒。0085作为用于调控酵母中的基因表达的启动子/终止子，只要在酿造用酵母中发挥作用的同时不受醪液中的糖、氨基酸等成分的浓度影响，可以任意组合。例如可利用甘油醛3磷酸脱氢酶基因TDH3的启动子、3磷酸甘油酸激酶基因PGK1的启动子等。这些基因均已被克隆，如在MFTUITEETAL，EMBOJ，1，6031982中有详细记载，通过已知的方法可容易地获得。在表达载体中使用的启动子，根据发酵醪液的糖组成、糖浓度、多种转运蛋白的组合等，可有效地改变成具有适当转录活性的启动子。0。
37、086作为转化时使用的选择性标记，因酿造用酵母不能利用营养缺陷型标记，因此，可利用遗传霉素GENETICIN抗性基因G418R、铜抗性基因CUP1MARINETAL，PROCNATLACADSCIUSA，81，3371984、浅蓝菌素抗性基因FAS2M，PDR4猪腰淳嗣等，生物化学，64，660，1992；HUSSAINETAL，GENE，101，149，1991日语原名猪腰淳嗣，生化学，64，660，1992；HUSSAINETETAL，GENE，101，149，1991等。将上述构建的载体导入宿主酵母内。0087作为本发明中利用的宿主酵母，可例举，可用于酿造的任何酵母，例如啤酒、葡萄酒、清。
38、酒等的酿造用酵母等。具体可例举，酵母属SACCHAROMYCES等的酵母，在本发明中，可使用啤酒酵母如巴斯德酵母SACCHAROMYCESPASTORIANUSW34/70等、卡尔斯伯酵母SACCHAROMYCESCARLSBERGENSISNCYC453、NCYC456等、酿酒酵母SACCHAROMYCESCEREVISIAENBRC1951、NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。并且还可使用威士忌酵母，如酿酒酵母SACCHAROMYCESCEREVISIAENCYC90等；葡萄酒酵母，如协会葡萄酒用1号、葡萄酒用3号、葡萄酒用4号等；清酒酵母，如协会酵母清酒用7号、清酒用。
39、9号等，但并不限于这些酵母。在本发明中，优选使用啤酒酵母，例如巴斯德酵母SACCHAROMYCESPASTORIANUS。0088制备本说明书中所述的各转运蛋白基因时使用的染色体DNA，并不限定于酿酒酵母SACCHAROMYCESCEREVISIAEATCC20598、ATCC96955等的菌株，只要是属于具有各基因的酿酒酵母SACCHAROMYCESCEREVISIAE的酵母，可以从任何酵母中制备。0089作为酵母的转化方法，可利用通常使用的公知方法。例如，可实施电穿孔法“METH说明书CN101978053ACN101978058A8/13页10ENZYM，194，P1821990”、原生。
40、质球法SPHEROPLAST“PROCNATLACADSCIUSA，75P19291978”、乙酸锂法“JBACTERIOLOGY，153，P1631983”、PROCNATLACADSCIUSA，75P19291978、METHODSINYEASTGENETICS，2000EDITIONACOLDSPRINGHARBORLABORATORYCOURSEMANUAL等记载的方法，但并不限于这些方法。0090此外，转化菌株，通过将宿主的营养缺陷型互补基因例如URA3整合到表达质粒中，可以用不含尿嘧啶的琼脂培养基来筛选。或者通过将抗药性基因例如对于环己酰亚胺的抗药性基因YAP1、或者遗传霉素抗生素。
41、GENETICIN抗性基因G418R整合到表达质粒中，可以用含有环己酰亚胺例如03G/ML、或者遗传霉素抗生素GENETICIN例如300G/ML的琼脂培养基来筛选。0091更具体地说，将宿主酵母在标准酵母营养培养基如YEPD培养基“GENETICENGINEERINGVOL1，PLENUMPRESS，NEWYORK，1171979”等中培养至OD600NM值为16。将该培养酵母离心分离并收集、洗涤，用浓度约为1M2M的碱性离子金属离子、优选用锂离子进行预处理。将上述细胞在约30下静置约60分钟，然后，与导入的DNA约120G同时在约30下，静置约60分钟。添加聚乙二醇，优选添加约4,000道。
42、尔顿的聚乙二醇，使最终浓度为约2050。在约30下静置约30分钟后，将上述细胞在约42下加热处理约5分钟。优选用标准酵母营养培养基将上述细胞悬浮液洗涤，加入到规定量的新鲜标准酵母营养培养基中，约30下静置约60分钟。然后，将其移植到含有作为选择性标记使用的抗生素等的标准琼脂培养基上，获得转化体。0092此外，对于通常的克隆技术，可参照MOLECULARCLONING3、“METHODSINYEASTGENITICS、ALABORATORYMANUALCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS、COLDSPRINGHARBOR，NY”等。00934本发明的酒类制造方法以及通过。
43、该方法获得的酒类0094将上述本发明的载体导入适合酿造作为制造对象的酒类的酵母中，通过使用该酵母，可制造具有氨基酸组成特征的酒类。作为对象的酒类，可以为啤酒、葡萄酒、威士忌、清酒等，但并不限于这些。0095在制造上述酒类时，除使用本发明获得的酿造酵母代替亲株之外，可利用公知的方法。因此，原料、制造设备、制造管理等可与以往的方法完全相同，不会因制造发酵时间缩短的酒类而增加成本。也就是说，根据本发明能够使用已有的设备不增加成本地进行制造。00965本发明的酵母的评价方法0097构建含有获取的多核苷酸的表达载体，根据常规方法将其导入酵母中，将导入了该基因的酵母在低聚糖培养基例如麦芽糖、麦芽三糖培养基。
44、上进行培养。通过测定培养时该酵母中包含的转运蛋白对葡萄糖诱导性失活/降解的抗性、该酵母的低聚糖分解能力、增殖速度、在麦汁中的发酵速度等，可评价该酵母的适应性。对葡萄糖诱导性失活/降解的抗性、低聚糖分解能力、增殖速度、在麦汁中的发酵速度等，可通过下述实施例中使用的方法进行评价。0098实施例0099以下通过实施例对本发明更加详细地说明，但应该注意到本发明并不限于这些实施例。0100试验方法说明书CN101978053ACN101978058A9/13页110101在本实施例中使用的试验项目和试验方法如下所示。只要无特别限制，本实施例中的试验方法以此为标准。01020103酿酒酵母SACCHARO。
45、MYCESCEREVISIAE的MAL61及MAL31基因己被克隆，其碱基序列已被报道。本说明书中使用的MAL31序列号3从酵母基因组数据库SACCHAROMYCESGENOMEDATABASE注册号YBR298C中获得，MAL61序列号5从基因库GENBANK注册号X17391中获得。MAL61及MAL31基因，是通过以其碱基序列信息为基础，使用从具有各基因的酵母酿酒酵母SACCHAROMYCESCEREVISIAE中制备的染色体DNA作为PCR模板，通过PCR扩增、分离MAL61、及MAL31基因而获取。0104对于酿酒酵母SACCHAROMYCESCEREVISIAE的MAL21，已知其。
46、被III号染色体编码，可并不知道DNA序列。但是因为考虑到被II号染色体编码的MAL31、被VIII号染色体编码的MAL61基因具有99以上的同一性，所以预测MAL21也具有相当高的同一性。0105事实上我们利用从GENBANK注册号X17391中获得的MAL61的DNA序列设计了引物5AGAGCTCAGCATATAAAGAGACA3序列号7和5TGGATCCGTATCTACCTACTGG3序列号8。然后，以具有MAL21基因、但不具有其他葡萄糖苷转运蛋白基因的酵母的染色体DNA为模板，通过PCR可获取MAL21。具体来说，MAL31是由酿酒酵母SACCHAROMYCESCEREVISIAES。
47、288CATCC204508ROSE，MD，WINSTON，FANDHIETER，P1990METHODSINYEASTGENETICSALABORATORYCOURSEMANUAL，COLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS，COLDSPRINGHARBOR，NY、MAL21是由酿酒酵母SACCHAROMYCESCEREVISIAEATCC20598、而且MAL61是由酿酒酵母SACCHAROMYCESCEREVISIAEATCC96955，使用相同的引物通过PCR获取。使用INVITROGEN公司的TOPOTACLONINGKIT，将获取的DNA片段插入载体PCR注册商。
48、标21TOPO后，通过DNA测序确认插入的基因序列。0106对于MAL31及MAL61，确认与数据库中注册的序列分别为基因组数据库注册号YBR298C及GENBANK注册号X17391相同。对于MAL21，独立地对10个克隆以上测序，确定了其序列序列号1。0107此外，使用的引物中起始密码子的上游有XBAI或者SACI位点，终止密码子的下游有BAMHI位点，并已整合到表达载体内。通过使用染色体DNA的PCR的目标基因的扩增以及其后的分离，包括PCR引物的制备，均可利用本领域技术人员公知的方法进行。MAL21的碱基序列如图2所示，氨基酸序列如图3所示。01080109在本发明中，使用14的4个表。
49、达载体。01101PJHXSB图1001112PJHIXSB图1101123PYCGPY图1201134PUP3GLP图1301140115在本发明中，在获取转运蛋白基因和进行菌株之间比较时，使用菌株15，在利用转运蛋白高表达的菌株确认生长繁殖速度、发酵速度时，使用菌株68。01161酿酒酵母S288CATCC204508MATALPHASUC2MALMELGAL2CUP1说明书CN101978053ACN101978058A10/13页1201172酿酒酵母ATCC96955MATAMAL61MAL62MAL63MAL64MAL11MAL12MAL13URA352LEU23LEU2112TRP1HIS01183酿酒酵母ATCC20598MATASUCMAL2MEL1HIS4LEU201194酿酒酵母CB11BERKLEYSTOCKCENTERMATAADE1MAL。