一种制备N末端乙酰化的胸腺素Α1的方法及其专用工程菌.pdf

本发明公开了一种制备N-末端乙酰化的胸腺素α1的方法及其专用工程菌。该工程菌，是将胸腺素α1的编码基因与N-末端乙酰转移酶的编码基因导入宿主菌中得到的；所述N-末端乙酰转移酶为如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-末端乙酰转移酶活性的由a)衍生的蛋白质。用本发明工程菌制备得到的Tα1，全部是N-末端乙酰化的，克服了传统基因工程技术中不能乙酰化或仅部分N-末端乙酰化的缺点，彻底实现了通过基因工程技术获得N-末端乙酰化Tα1，具有很强的实际用途。

1、  一种工程菌，是将胸腺素α1的编码基因与N-末端乙酰转移酶的编码基因导入宿主菌中得到的；所述N-末端乙酰转移酶为如下a)或b)的蛋白质：
a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将序列表中序列7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-末端乙酰转移酶功能的由a)衍生的蛋白质。

2、  根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述N-末端乙酰转移酶的编码基因与可调控启动子一起导入所述宿主菌中，所述N-末端乙酰转移酶的编码基因位于所述可调控启动子下游；
所述胸腺素α1的编码基因与可调控启动子一起导入所述宿主菌中，所述胸腺素α1的编码基因位于所述可调控启动子下游；
所述可调控启动子为可诱导型启动子或组成型启动子。

3、  根据权利要求2所述的工程菌，其特征在于：所述N-末端乙酰转移酶的编码基因与可调控启动子通过载体导入所述宿主菌中；所述N-末端乙酰转移酶的编码基因及所述可调控启动子位于所述载体上或整合到所述宿主菌的染色体上；
所述胸腺素α1的编码基因与可调控启动子通过载体导入所述宿主菌中；所述胸腺素α1的编码基因及所述可调控启动子位于所述载体上。

4、  根据权利要求1-3中任一所述的工程菌，其特征在于：所述N-末端乙酰转移酶的编码基因为如下1)、2)或3)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中序列8所示DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述N-末端乙酰转移酶的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且编码所述N-末端乙酰转移酶的DNA分子。

5、  根据权利要求1-4中任一所述的工程菌，其特征在于：所述胸腺素α1为如下a)或b)的蛋白质：
a)由序列表中序列10自N端第2-29位氨基酸残基所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将序列表中序列10自N端第2-29位氨基酸残基所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有胸腺素α1活性的由a)衍生的蛋白质。

6、  根据权利要求1-5中任一所述的工程菌，其特征在于：所述胸腺素α1的编码基因为如下1)、2)或3)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中序列11的5′末端第4-87位核苷酸所示DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述胸腺素α1的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且编码所述胸腺素α1的DNA分子。

7、  根据权利要求1-6中任一所述的工程菌，其特征在于：所述胸腺素α1的编码基因是通过所述胸腺素α1的编码基因与内含肽的编码基因形成的融合基因导入所述宿主菌中的；所述融合基因的核苷酸序列为序列表中序列11所示。

8、  根据权利要求1-7中任一所述的工程菌，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌。

9、  根据权利要求8所述的工程菌，其特征在于：所述大肠杆菌为表达T7RNA聚合酶的大肠杆菌；所述表达T7RNA聚合酶的大肠杆菌为BL21(DE3)或JM109(DE3)。

10、  一种制备N末端乙酰化修饰的胸腺素α1的方法，包括如下步骤：发酵权利要求1-9中任一所述工程菌，得到N末端乙酰化修饰的胸腺素α1。

一种制备N-末端乙酰化的胸腺素α1的方法及其专用工程菌
技术领域
本发明涉及一种制备N-末端乙酰化的胸腺素α1的方法及其专用工程菌。
背景技术
乙酰化是一种广泛存在的蛋白质修饰方式，存在于原核生物、古细菌和真核生物中，大约80～90％的哺乳动物细胞质蛋白、50％的酵母蛋白、少量的原核或古细菌蛋白质会发生乙酰化(Polevoda B，Sherman F.The diversity of acetylatedproteins.Genome Biology，2002，3：1-6)。
乙酰化修饰对一些蛋白质的活性和稳定性有影响，如酶活性、酶稳定性、DNA结合、蛋白质-蛋白质相互作用、受体识别等等。在有些情况下，缺少乙酰化会导致蛋白质热稳定性的下降或其它动力参数的改变，或者复合体组装效率下降。酵母细胞中蛋白质的乙酰化修饰与细胞的生长、非发酵碳源的利用、芽胞生成等有关。在哺乳动物细胞中，乙酰化修饰与组织发育、细胞增殖和肿瘤发生等有关。N-末端乙酰化修饰对原肌球蛋白(tropomyosin)功能及其重要，无乙酰化修饰的原肌球蛋白不能与肌动蛋白(actin)结合，不能形成多聚体(Urbancikova M，andHitchcock-DeGregori SE.Requirement of amino-terminal modification forstriated muscle alpha-tropomyosin function.J.Biol.Chem.，1994，269：24310-24315.)。对肽类药物而言，乙酰化修饰可以提高多肽在体内的半衰期，如乙酰化修饰的促黑素细胞激素的半衰期是非乙酰化修饰的3倍(Rudman D，Hollins BM，Kutner MB，Moffitt SD，Lynn MJ：Three types ofα-melanocyte-stimulating hormone：bioactivity and half-lives.Am J Physiol1983，245：E47-E54.)。
胸腺素α1(Tα1)由28个氨基酸组成，分子量3 108kD，等电点4.2，结构保守，在各哺育动物中结构一致，分布广泛，存在于哺育动物各组织器官中，尤以胸腺中含量最高。N-末端乙酰化修饰的Tα1是一种生物反应调节因子，主要是T淋巴系统的免疫增强剂，对NK细胞也有协同作用。N-末端乙酰化修饰的Tα1联用干扰素治疗乙型肝炎与丙型肝炎、联用化学疗法或放射疗法或白介素-2(IL-2)治疗非小细胞肺癌和恶性黑色素瘤、联用叠氮胸苷和干扰素治疗免疫缺陷综合征等等临床试验都显示其有良好的治疗效果(刘玉英.胸腺素α1的研究进展.上海医药，2003，24(5)：211-216)。化学合成的Tα1已在中国、美国、日本等在内的多个国家批准临床应用，以治疗乙型肝炎、丙型肝炎和肺癌等发病率较高且严重危害人类健康的疾病。如美国SciClone制药公司生产的Tα1(商品名ZADAXIN)，在2006年销售额达到3243万美元(约合人民币2.5亿元)，其中90％来自中国市场，比2005年增加16％。在中国售价每支(1.6mg)800元左右。如果能进一步降低生产成本，作为抗病毒、肿瘤治疗药物，Tα1在国内的市场将会进一步扩大。
目前国内外均采用化学合成方法生产N-末端乙酰化的Tα1。但由于化学合成成本高，用基因工程方法制备Tα1更具吸引力。曾有多人尝试利用基因工程技术表达Tα1，无论采用融合表达或者串联表达都不能获得N-末端乙酰化的Tα1或者仅部分乙酰化(Esipov RS，Gurevich AI，Stepanenko VN，Chupova LA，ChuvikovskyDV，and Miroshnikov AI.Recombinant Thymosin α1.Russian Journal ofBioorganic Chemis try，Vol.30，No.5，2004，pp.431-435.)。
蛋白质的N-末端乙酰化修饰是由N-末端乙酰转移酶(N-terminalacetyltransferases，NATs)将乙酰辅酶A的乙酰基团转移到蛋白质氨基末端的α-氨基上。

细胞内存在多种N-末端乙酰转移酶，分别负责不同类型氨基酸序列多肽的乙酰化修饰。迄今酵母细胞的N-末端乙酰转移酶研究较多。酵母有三类不同的N-末端乙酰转移酶：NatA、NatB、NatC，分别催化不同的底物群体(Polevoda B and ShermanF.N-terminal Acetyltransferases and Sequence Requirements for N-terminalAcetylation of Eukaryotic Proteins.J.Mol.Biol.2003，325：595-622.)。NatA催化Ser、Ala、Gly和Thr残基为末端的蛋白质乙酰化修饰，NatB催化Met-Glu、Met-Asp以及部分Met-Asn、Met-Met为末端残基的蛋白质乙酰化修饰，NatC催化Met-Ile、Met-Leu、Met-Trp和Met-Phe为末端残基的乙酰化修饰。真核生物的NATs都由二个或以上不同亚基组成。NatA至少有两个亚基Ard1p(27kDa)、Nat1p(99kDa)，NatB也有两个亚基Nat3p(23kDa)和Mdm20p(92kDa)，NatC由三个亚基组成：Mak3p(20kDa)、Mak10p(84kDa)和Mak31p(10kDa)。高等真核生物中也存在上述三种酶的催化亚基Ard1p、Nat3p和Mak3p的同源序列，但单个亚基没有催化乙酰转移的活性。
大肠杆菌中已知的N-末端乙酰转移酶有RimI、RimJ和RimL，分别与核糖体蛋白S18(N-Ala)、S5(N-Ala)和L12(N-Ser)的N-末端的Ala或Ser残基乙酰化有关(Yoshikawa A，Isono S，Sheback A，Isono K.Cloning and nucleotide sequencingof the genes rimI and rimJ which encode enzymes acetylating ribosomalproteins S18 and S5 of Escherichia coli K12.Mol Gen Genet，1987，209：481-488.Tanaka S，Matsushita Y，Yoshikawa A，Isono K.Cloning andmolecular characterization of the gene rimL which encodes an enzymeacetylating ribosomal protein L12 of Escherichia coli K12.Mol Gen Genet，1989，217，289-293.)。此外，根据生物信息学分析，大肠杆菌基因组中一些未知功能基因可能也具有乙酰转移酶活性。现有的研究表明，与真核细胞的NATs不同，原核细胞的NATs可能只需要一种亚基蛋白组成。2005年Vetting等报道鼠伤寒沙门氏菌的RimL具有二聚体结构，并可在体外对其底物进行乙酰化修饰反应(Vetting MW，de Carvalho LPS，Roderick SL，and Blanchard JS.A Novel Dimeric Structureof the RimL N^α-acetyltransferase from Salmonella typhimurium.J Biol Chem，2005，280(23)：22108-22114)。根据晶体结构及计算机模拟结果，显示原核生物的NATs不同于真核生物NATs，推测只能催化一种蛋白底物。大肠杆菌的RimL在体外可以催化L12的N-末端乙酰化修饰，并且还可以催化L12的两种突变体(S1A和I2D)的N-末端乙酰化修饰(Miao L，Fang H，Li Y，Chen H.Studies of the in vitroN^α-acetyltransferase activities of　E.coli RimL protein.Biochem BiophysRes Commun，2007，357：641-64)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种能产生N-末端乙酰化的胸腺素α1的工程菌。
本发明所提供的工程菌，是将胸腺素α1的编码基因与N-末端乙酰转移酶的编码基因导入宿主菌中得到的；所述N-末端乙酰转移酶为如下a)或b)的蛋白质：
a)由序列表中序列7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将序列表中序列7所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有N-末端乙酰转移酶功能的由a)衍生的蛋白质。
所述N-末端乙酰转移酶的编码基因与可调控启动子可以一起被导入所述宿主菌中，所述N-末端乙酰转移酶的编码基因位于所述可调控启动子下游；所述可调控启动子为可诱导型启动子或组成型启动子，所述可诱导型启动子为T7、Lac、Tac、Trp或P_L/P_R。
所述N-末端乙酰转移酶的编码基因与可调控启动子可通过载体导入所述宿主菌中；所述N-末端乙酰转移酶的编码基因及所述可调控启动子可位于所述载体上，也可整合到所述宿主菌的染色体上。
所述胸腺素α1的编码基因与可调控启动子一起导入所述宿主菌中，所述胸腺素α1的编码基因位于所述可调控启动子下游；
所述胸腺素α1的编码基因与可调控启动子通过载体导入所述宿主菌中；所述胸腺素α1的编码基因及所述可调控启动子位于所述载体上。
其中，所述N-末端乙酰转移酶的编码基因可为如下1)、2)或3)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中序列8所示DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述N-末端乙酰转移酶的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且编码所述N-末端乙酰转移酶的DNA分子。
所述胸腺素α1可为如下a)或b)的蛋白质：
a)由序列表中序列10自N端第2-29位氨基酸残基所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将序列表中序列10自N端第2-29位氨基酸残基所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有胸腺素α1活性的由a)衍生的蛋白质。
所述胸腺素α1的编码基因可为如下1)、2)或3)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中序列11的5′末端第4-87位核苷酸所示DNA分子；此序列是对胸腺素α1的编码基因进行了密码子优化，以获得更好的表达效果。
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述胸腺素α1的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且编码所述胸腺素α1的DNA分子。
所述胸腺素α1的编码基因和所述N-末端乙酰转移酶的编码基因可以均是通过重组载体导入所述宿主菌中的。
所述胸腺素α1的编码基因可以是通过如下方法导入所述宿主菌中：将所述胸腺素α1的编码基因与内含肽的编码基因融合，形成融合基因，再将融合基因通过载体导入所述宿主菌中。
其中，所述内含肽可为如下a)或b)的蛋白质：
a)由序列表中序列10自N端第30-165位氨基酸残基所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
b)将序列表中序列10自N端第30-165位氨基酸残基所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有所述内含肽活性的由a)衍生的蛋白质。
所述内含肽的编码基因为可如下1)、2)或3)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中序列11的5′末端第88-495位核苷酸所示DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述内含肽的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列具有90％以上的同源性且编码所述内含肽的DNA分子。
所述融合基因的核苷酸序列具体可如序列表中序列11所示。
所述宿主菌可为肠杆菌科细菌，包括埃希菌属、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、变形杆菌属、枸橼酸杆菌属、葡萄糖非发酵杆菌等，优选埃希菌属的大肠杆菌。
其中，所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌K12来源的、大肠杆菌B来源的、大肠杆菌C来源的或它们的杂交品系的菌株。更具体可为任何带有表达T7RNA聚合酶基因的大肠杆菌。再更具体可为大肠杆菌JM109(DE3)、大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的另一个目的是提供一种制备N-末端乙酰化的胸腺素α1的方法。
本发明所提供的制备N末端乙酰化修饰的胸腺素α1的方法，包括如下步骤：发酵上述任一所述工程菌，得到N末端乙酰化修饰的胸腺素α1。
当所用的工程菌是通过如下方法的得到时：胸腺素α1的编码基因与内含肽的编码基因融合，形成融合基因，再将融合基因通过载体导入所述宿主菌中，所述方法中还包括切割内含肽的步骤。
其中，切割内含肽的方法为：向纯化得到的融合蛋白中加入巯基乙醇或DTT，于37℃进行切割24小时。还可以进一步对切割样品进行脱盐，再进行阴离子层析纯化。
本发明是在大肠杆菌中将rimJ基因与被修饰的目的Tα1编码基因同时表达，避免了基因组上天然存在的rimJ基因表达所受影响因素未知，难以调控的缺点。rimJ基因可以与被修饰的目的Tα1编码基因位于同一表达载体上，也可以分别克隆在不同的相容表达载体上，也可以在基因组上整合表达rimJ，使rimJ基因的表达可被调控。例如可以将rimJ基因置于T7启动子，或Lac启动子，或Tac启动子，或Trp启动子，或P_L/P_R启动子，或组成性启动子控制之下。
原核生物中的RimJ蛋白氨基酸序列同源性较高，推测类似的基因在大肠杆菌中都可以发挥作用。所以本发明中所用的大肠杆菌的RimJ基因可以用来自其它微生物的同源基因替代，如志贺氏菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、肠杆菌、欧文氏菌、沙雷氏菌、弧菌、耶尔森菌等等。
在表达Tα1时，为了便于获得具有天然结构Tα1，可以通过化学切割、特异性酶切割以及内含肽介导的切割等技术达到。
其中，化学切割方法具体可以如下：Tα1与C端融合肽段之间增加一个Cys残基，融合蛋白的切割可以通过特异性化学试剂NTCB、CDAP等方式达到，NATB主要作用X-Cys之间的肽键。
特异性酶切割方法具体可以如下：由于Tα1的C末端残基为Asn，在Tα1和C段融合肽段之间增加一个Gly残基。融合蛋白的切割可以通过羟胺切割或天冬酰胺内肽酶切割来获得完整的Tα1。羟胺切割法主要作用Asn-Gly之间的肽键。天冬酰胺内肽酶主要作用于Asn-X，尤其是Asn-Gly之间的肽键。
内含肽介导的切割方法具体可以如下：将Tα1与内含肽融合表达，融合蛋白可以通过温度诱导切割、DTT或巯基乙醇诱导切割、Cys诱导切割。温度诱导切割可以避免添加一些试剂增加成本。DTT或巯基乙醇诱导效率高，可以获得具有完整结构的Tα1。用Cys诱导切割，可以在Tα1的C端增加一个Cys残基，便于进行化学修饰，改善Tα1的性质，如延长体内半衰期等。
融合蛋白的表达可以采用组成型启动子、热诱导型启动子、或化学诱导型启动子。优选采用T7启动子进行高效可控表达。
本发明方法通过调控提高N-末端乙酰转移酶RimJ的表达水平，获得了充分乙酰化的Tα1及其融合蛋白。用本发明工程菌制备得到的Tα1，全部是N-末端乙酰化的，克服了传统技术中不能N-末端乙酰化、部分N-末端乙酰化、乙酰化效率不高的缺点，彻底的实现了通过基因工程技术获得N-末端乙酰化Tα1。因此，本发明工程菌及方法在制备N-末端乙酰化Tα1领域具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为工程菌I在表达不同时段的全菌蛋白电泳结果。
图2为A2镍金属螯合亲和层析后洗脱液的电泳图。
图3为A2质谱分析结果。
图4为胰蛋白酶消化A2的双电荷峰。
图5为733.78乙酰化峰MS-MS测序结果。
图6为A8镍金属螯合亲和层析得到的蛋白的电泳图。
图7为A8质谱分析结果。
图8为A2在未经任何修饰的JM109(DE3)中表达产物质谱分析。
图9为A2在突变菌rimJ^-kan^rJM109(DE3)中表达产物质谱分析。
图10为A2在突变菌rimJ^-kan^rJM109(DE3)中与rimJ共表达的产物质谱分析。
图11为工程菌BL21(DE3)/pET-AS/pACYC-rimJ表达后破菌及镍金属螯合亲和层析的蛋白。
图12为巯基乙醇诱导切割及阴离子交换层析得到的样品电泳图。
图13为质谱测定由阴离子交换层析得到的N-末端乙酰化Tα1的分子量。
图14为rimJ基因被敲除的菌的鉴定。
图15为rimJ基因被敲除的菌的鉴定。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的酶试剂均购自TaKaRa公司。
pKD4质粒(Datsenko KA，Wanner BL.One-step inactivation of chromosomalgenes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97：6640-6645.)(中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所)。
实施例1、胸腺素α1(Tα1)与L12、S18的融合蛋白的表达及乙酰化修饰鉴定
一、Tα1与L12的融合蛋白表达及乙酰化修饰鉴定
1、表达Tα1与L12的融合蛋白工程菌I的构建
融合基因的获得：以大肠杆菌基因组为模板，以L1、L2为引物PCR扩增编码核糖体蛋白L12的基因rplL的序列，产物约370bp；以上述370bp的PCR产物为模板，以Ta2、L2为引物进行PCR扩增，得到约320bp产物；再以320bp的产物为模板，以Ta1、L2为引物PCR扩增得到约370bp产物，得到的产物即为Tα1与L12的融合蛋白的融合编码基因，测序，得其核苷酸序列如序列表中序列2所示，其中自序列2的5′末端第91-363位核苷酸为编码L12的部分基因，第4-87位核苷酸为编码Tα1的基因；该融合基因编码的融合蛋白(A2)的氨基酸序列如序列表中序列1所示，序列1自N端第2-29位氨基酸残基所示的氨基酸序列为Tα1，第31-121位氨基酸残基所示的氨基酸序列为L12蛋白的C端部分。
重组载体pET-A2的获得：用NdeI和XhoI双酶切(购自宝生物工程(大连)有限公司)上述融合基因，用NdeI和XhoI双酶切载体pET22b(购自Novagen公司，目录号69337-3)，连接，得到重组载体，将重组载体转化大肠杆菌DH5α，筛选得到阳性克隆，再进行测序鉴定，获得表达Tα1与L12的融合蛋白(简称为A2)的重组载体pET-A2。
工程菌I的获得：将重组载体pET-A2转化宿主大肠杆菌BL21(DE3)，筛选，得到表达A2的工程菌I。
所用的各引物的序列如下：
L1：5’GGAATTCCATATGTCTATCACTAAAGATCA3’
L2：5’GTGCTCGAGTTTAACTTCAACTTCAGCG3’
Ta1：5’
GAATTCCATATGTCTGATGCAGCTGTAGATACTAGCTCTGAAATCACTACTAAA
GATCTTAAGGAGAAGAAGGA3’
Ta2：5’
GATCTTAAGGAGAAGAAGGAAGTTGTCGAAGAGGCTGAGAACGGCTTCGGTG
TTTCCGCT3’
2、A2的表达、纯化及乙酰化修饰鉴定
首先挑取工程菌I的单菌落接入含有100mg/L氨苄青霉素的2ml LB培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；pH7.0)中，30℃培养12小时。然后转接到50ml的相同培养基中，30℃振荡培养10小时，作为种子。将种子接入1升含有氨苄青霉素的FML培养基中(酵母粉12g/L，蛋白胨15g/L，Na₂HPO₄·2H₂O3g/L，KH₂PO₄·3H₂O 7g/L，NaCl 2.5g/L，0.2％葡萄糖，2mM乳糖，0.05％MgSO₄·7H₂O，100mg/L氨苄青霉素)振荡培养8小时，期间在不同时段取样离心收获表达的菌体，进行电泳。不同时段的全菌蛋白电泳结果如图1所示，表明在培养4小时至8小时均有目的蛋白表达。
取表达8小时后的(湿重)菌体10克，加100mL缓冲液PB(50mM磷酸盐缓冲液，pH7.0)，冰浴条件下超声破菌。破菌后补加5.844克NaCl和2克Triton X-100，定容至200mL，8000rpm离心40min，取上清，用0.45μm的滤膜过滤，得到的滤液再进行镍金属螯合亲和层析纯化。
镍金属螯合亲和层析柱(16×60mm)先用缓冲液A(50mM磷酸盐缓冲液，0.5MNaCl，pH7.0)平衡4个柱体积，然后上样，再用缓冲液B(50mM磷酸盐缓冲液，0.5M NaCl，10％甘油，pH7.0)冲洗10个柱体积，接着再用缓冲液A平衡4个柱体积。然后用缓冲液C(50mM磷酸盐缓冲液，0.5M NaCl，200mM咪唑，pH7.0)直接洗脱。
将洗脱液分别进行电泳，蛋白电泳图结果如图2所示(其中“A”表示过柱前的样品，“B”表示样品穿过柱子后的收集液，M表示蛋白质分子量标准，泳道1-7分别表示在洗脱过程中收集的不同样品)。
将上一步收集的样品用C8柱进行纯化，收集样品，用于Q-TOF-MS质谱分析测定分子量。A2的理论分子量为13199.72道尔顿，乙酰化修饰后则分子量增加42道尔顿。质谱分析结果如图3所示，表明有一部分A2被乙酰化修饰，表明存在乙酰化和非乙酰化两种形式。
将A2进行胰蛋白酶消化后进行MS-MS串联质谱分析鉴定乙酰化修饰位点，结果如图4(胰蛋白酶消化双电荷峰，712.78为未经乙酰化的N端14个残基的质荷比，733.78为经乙酰化的N端14个残基的质荷比)和图5所示，表明乙酰化修饰发生在N端的Ser残基上。
二、Tα1与S18的融合蛋白基因构建及表达、乙酰化修饰鉴定
1、表达Tα1与S18的融合蛋白工程菌II的构建
融合基因的构建：以大肠杆菌基因组为模板，以S81、S82为引物PCR扩增编码核糖体蛋白S18的基因rpsR的序列，约230bp；然后以此230bp的PCR片段为模板，以Ta3、S82为引物PCR扩增得到约190bp产物；再以此190bp的PCR片段为模板，以Ta1、S82为引物PCR扩增得到约230bp产物，即为表达Tα1与S18的融合蛋白的融合基因，测序，得其核苷酸序列如序列表中序列4所示，其中自序列4的5′末端第91-225位核苷酸为编码S18的基因，第4-87位核苷酸为编码Tα1的基因；该融合基因编码的融合蛋白(A8)的氨基酸序列如序列表中序列3所示，序列3自N端第2-29位氨基酸残基所示的氨基酸序列为Tα1，第31-75位氨基酸残基所示的氨基酸序列为S18的C端部分。
重组载体的构建：用NdeI和XhoI双酶切(购自宝生物工程(大连)有限公司)上述融合基因，用NdeI和XhoI双酶切载体pET22b(购自Novagen公司，目录号69337-3)，连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选得到阳性克隆，再进行测序鉴定，得到表达Tα1与S18的融合蛋白(简称为A8)的载体pET-A8。
工程菌II的构建：将载体pET-A8转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，筛选，得到表达A8的工程菌II。
所用的引物序列如下：
S81：5’GGAATTCCATATGGCACGTTATTTCCGTC3’
S82：5’GTGCTCGAGCTGATGGCGATCAGTGTA3’
Ta1：5’
GAATTCCATATGTCTGATGCAGCTGTAGATACTAGCTCTGAAATCACTACTAAAGATCTTAAGGAGAAGAAGGA3’
Ta3：5’
GATCTTAAGGAGAAGAAGGAAGTTGTCGAAGAGGCTGAGAACTGCAACTACATCACCGAAAGCG3’
2、A8的表达、纯化及乙酰化修饰鉴定
首先挑取工程菌II的单菌落接入含有100mg/L氨苄青霉素的2ml LB培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；pH7.0)中，30℃培养12小时。然后转接到50ml的相同培养基中，30℃振荡培养10小时，作为种子。将种子接入1升含有氨苄青霉素的FML培养基中(酵母粉12g/L，蛋白胨15g/L，Na₂HPO₄·2H₂O3g/L，KH₂PO₄·3H₂O 7g/L，NaCl 2.5g/L，0.2％葡萄糖，2mM乳糖，0.05％MgSO₄·7H₂O，100mg/L氨苄青霉素)振荡培养8小时，离心收获表达的菌体。
取10克(湿重)菌体，加100mL缓冲液PB(50mM磷酸盐缓冲液，pH7.0)，冰浴条件下超声破菌。破菌后补加5.844克NaCl和2克Triton X-100，定容至200mL，8000rpm离心40min，取上清，将上清用0.45μm的滤膜过滤，得到的滤液再进行镍金属螯合亲和层析纯化。
镍金属螯合亲和层析柱(16×60mm)先用缓冲液A(50mM磷酸盐缓冲液，0.5MNaCl，pH7.0)平衡4个柱体积，然后上样，再用缓冲液B(50mM磷酸盐缓冲液，0.5M NaCl，10％甘油，pH7.0)冲洗10个柱体积，接着再用缓冲液A平衡4个柱体积。然后用缓冲液C(50mM磷酸盐缓冲液，0.5M NaCl，200mM咪唑，pH7.0)直接洗脱。
将洗脱液进行电泳，蛋白电泳结果如图6所示(其中“A”表示过柱前样品，“B”表示样品穿过柱子后的收集液，M表示蛋白质分子量标准，泳道1-7分别表示洗脱过程中收集的不同样品)。
将上一步收集的样品用C8柱进行纯化，收集样品，用于Q-TOF-MS质谱分析测定分子量。A8的理论分子量为9506.61道尔顿，乙酰化修饰后则分子量增加42道尔顿。质谱分析结果如图7所示，表明有一部分A8被乙酰化修饰，表明存在乙酰化和非乙酰化两种形式。
上述实验是先将Tα1分别与大肠杆菌核糖体蛋白L12和S18进行融合表达，然后进行纯化和Q-TOF-MS精确测定分子量，观察是否存在乙酰化修饰，然后通过质谱测序方法确定乙酰化位点。结果发现两种融合蛋白均存在乙酰化修饰，并且修饰位点在N末端第一个残基Ser。因此，推断Tα1的乙酰化修饰与其自身序列有关，而与融合蛋白序列关系不密切。为了提高乙酰化修饰程度，使Tα1的N端发生充分乙酰化修饰，很有必要寻找到使之乙酰化的关键酶。
实施例2、与Tα1的乙酰化修饰相关基因的筛选
大肠杆菌内已知的N-末端乙酰转移酶有三个，分别是RimI、RimJ、RimL。在大肠杆菌基因组中还有许多未知功能的基因，其中也可能存在未知的N-末端乙酰转移酶。发明人从基因组挑选了五个推测为乙酰转移酶的基因(yjaB、yjhQ、yjgM、yhhY、yiiD)。利用Red重组技术敲除这8个基因，构建不同的酶基因缺失突变株，在其中分别表达Tα1，进行分离纯化、质谱鉴定乙酰化修饰形式。当rimJ基因被敲除时，发现融合蛋白A2就不存在乙酰化修饰形式，推断该酶可能是参与Tα1乙酰化修饰的酶。现将rimJ基因敲除的相关实验详述如下：
本实施例中的融合蛋白为实施例1中的A2。
本实施例中应用Red重组系统敲除候选酶基因。由于短同源片段(40-60bp)在大肠杆菌BL21(DE3)中的重组效率极低，所以本试验在大肠杆菌JM109(DE3)中实施。
将实施例1中的重组载体pET-A2转入大肠杆菌JM109(DE3)中，按照实施例1中所述方法进行重组菌筛选、表达、及乙酰化修饰鉴定，结果表明同转入大肠杆菌BL21(DE3)中一样，在大肠杆菌JM109(DE3)中表达的A2有部分存在乙酰化修饰，另一部分不存在乙酰化修饰。
一、rimJ基因敲除菌的构建
1、Red重组感受态细胞的制备
将编码Red重组系统的质粒pKOBEG(Chaveroche et al.，Nucleic AcidsResearch，28(22)：e97，2000)(中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所)用CaCl₂法转化至大肠杆菌JM109(DE3)中；将重组菌在含有氯霉素的LB培养基中30℃过夜振荡培养；接1ml菌液于50ml的带有氯霉素的LB培养基中，30℃振荡培养；至A₆₀₀＝0.2-0.4，加入L-阿拉伯糖(终浓度为0.2％)，继续振荡培养；至A₆₀₀为1.0，4000g、4℃离心10min，收集菌体；用去离子水洗3次，最后将菌体重悬于150μl冷的10％甘油中，得到大肠杆菌Red重组感受态细胞JM109(DE3)/pKOBEG。
2、PCR扩增打靶片段
以J5和J3为引物，pKD4质粒(Datsenko KA，Wanner BL.One-step inactivation ofchromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97：6640-6645.)作为模版，扩增带有卡那抗性基因用于敲除rimJ基因的线性打靶片段，反应体系如下：


PCR反应条件：

将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳回收(回收片段大小约1500bp)，再用Dpn I酶切，目的在于消化残留的质粒模板，减少假阳性，再次1％琼脂糖凝胶电泳回收。
引物序列如下：
J5：5’-atgtttggctatcgcagtaacgtgccaaaagtgcgcttaaccaca TAA gtgtaggctggagctgcttc-3’
J3：5’-ttagcggccgggcgtccagtctggggtagttaatgccgtcagtacatgggaattagccatggtcc-3’
3、电击转化
取100～300ng回收的线性打靶片段与前述步骤1中制备的50μL大肠杆菌Red重组感受态细胞JM109(DE3)/pKOBEG混合，将混合物吸入0.1cm的BTX电转杯进行电击，设置电压1850V。电击后快速加入0.5mL冰冷的LB培养基，混匀，37℃振荡培养60min。将全部菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素的平板上，37℃培养过夜，待长出菌落后进行后续鉴定试验。将在卡那霉素平板上生长的菌株命名为rimJ^-kan^rJM109(DE3)，理论上此菌株中的rimJ基因应该已被敲除并且该菌株具有卡那霉素抗性。
4、敲除菌的菌落PCR鉴定
所用的引物序列如下：Jsy：5’-cgtattaaagacgttacggg-3’，Jxy：
5’-cacctgcttttccagcaagc-3’，K2：5’-atgggaattagccatggtcc-3’。
方案一：用分别与rimJ基因上、下游同源的Jsy和Jxy作为引物，分别以未转入任何载体和基因的大肠杆菌JM109(DE3)和突变菌rimJ^-kan^rJM109(DE3)为模板进行PCR扩增。
反应体系如下：


理论上，在未转入任何载体的大肠杆菌JM109(DE3)中应扩增出600bp左右的片段，此片段为rimJ基因及其上、下游序列；突变菌rimJ^-kan^rJM109(DE3)中应扩增出1600bp左右片段，此片段为卡那抗性基因长度加上rimJ的上下游部分序列。
将各PCR产物进行凝胶电泳检测，结果如图14所示(M：DNA分子量标准；1、JM109(DE3)；2、突变菌rimJ^-kan^rJM109(DE3))。结果显示在未转入任何载体的大肠杆菌JM109(DE3)中扩增片段的长度均约600bp，突变菌rimJ^-kan^rJM109(DE3)的扩增片段长约1600bp(此1600bp为卡那抗性基因长度加上rimJ的上下游部分序列)，扩增条带位于1000bp～2000bp之间，表明突变菌rimJ^-kan^rJM109(DE3)中rimJ基因已被敲除但具有卡那霉素抗性基因，与预期结果一致。
方案二：用与rimJ基因上游同源的Jsy引物、以及与卡那霉素抗性基因同源的序列K2作为引物，分别以未转任何基因和载体的大肠杆菌JM109(DE3)和突变菌rimJ^-kan^rJM109(DE3)为模板进行PCR。菌落PCR反应体系和PCR扩增程序同上。
理论上未转任何基因和载体的大肠杆菌JM109(DE3)本身没有卡那抗性基因序列，所以没有K2结合的位置，应该无扩增条带，突变菌rimJ^-kan^rJM109(DE3)应该扩增出只含有卡那霉素抗性基因的片段(卡那霉素抗性基因的长度为1500bp)。
将PCR产物进行凝胶电泳检测，结果如图15所示(M：DNA分子量标准；1、JM109(DE3)；2、突变菌rimJ^-kan^rJM109(DE3))。结果表明，未转任何基因和载体的大肠杆菌JM109(DE3)无扩增条带；而从突变菌rimJ^-kan^rJM109(DE3)可扩增出长约1500bp的条带，说明突变菌rimJ^-kan^rJM109(DE3)在rimJ上游和K2结合的位置间存在卡那抗性基因，与预期结果一致。
以上证明本实验构建的突变菌rimJ^-kan^rJM109(DE3)正确，其中，rimJ基因被部分敲除，同时该菌具有卡那抗性基因。
二、在突变菌rimJ^-kan^rJM109(DE3)中表达A2并进行纯化、质谱分析鉴定乙酰化修饰
将实施例1构建的重组载体pET-A2转化到JM109(DE3)及其突变菌rimJ^-kan^rJM109(DE3)中。挑取单菌落接入含有100mg/L氨苄青霉素的5ml LB培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；pH7.0)中，30℃培养12小时。然后取2ml转接到50ml的相同培养基中，30℃振荡培养10小时，作为种子。将种子接入1升含有氨苄青霉素的LB培养基中37℃培养至菌密度A600＝0.4-0.5时，加入终浓度为0.5mM IPTG，继续培养4小时，离心，收获表达的菌体。
按照实施例1中所述方法，将收集的菌体破碎，离心、过滤，再进行镍金属螯合亲和层析纯化，层析后的样品再用C8柱进行纯化，收集的样品用于Q-TOF-MS质谱分析测定分子量。
结果如图8和图9所示，在突变株rimJ^-kan^rJM109(DE3)中表达产物A2不存在乙酰化修饰，而在未经任何转化的JM109(DE3)中仍存在乙酰化修饰。说明rimJ基因与A2的乙酰化修饰有关。
三、A2与RimJ在突变株rimJ^-kan^rJM109(DE3)中共表达
为了近一步确证rimJ就是使Tα1乙酰化修饰的关键酶，发明人将A2与rimJ基因克隆到相容的质粒上，然后转化rimJ敲除菌中进行共表达。经过分离纯化和质谱鉴定，发现当两者共表达，融合蛋白A2全部被乙酰化修饰。而在rimJ敲除菌中单独表达A2时，融合蛋白则完全没有发生乙酰化修饰。这些结果证明，rimJ基因产物RimJ就是参与Tα1乙酰化修饰的特异性酶。
1、构建含有rimJ基因的重组载体pACYC-rimJ
以大肠杆菌基因组为模板，以J1、J2为引物，PCR扩增，得到的产物即为编码N-末端乙酰转移酶基因rimJ(约600bp)。用NdeI和XhoI双酶切(购自宝生物工程(大连)有限公司)PCR扩增产物，用NdeI和XhoI双酶切载体pACYCDuet-1(购自Novagen公司，目录号71147-3)，连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选得到阳性克隆，再进行测序鉴定，获得表达rimJ的载体pACYC-rimJ，在此载体上rimJ基因的表达由T7启动子控制。rimJ基因的核苷酸序列如序列表中序列8所示，rimJ蛋白如序列表中序列7所示。
J1、J2引物序列如下：J1：5’GGAATTCATATGTTTGGCTATCGCAGTAAC3’，J2：5’CGCCTCGAGTTAGCGGCCGGGCGT3’。
2、A2与RimJ在rimJ基因敲除菌中共表达
将质粒pET-A2与pACYC-rimJ共同转化到rimJ基因敲除菌rimJ^-kan^rJM109(DE3)中，在含有100mg/L氨苄青霉素和25mg/L氯霉素的LB平板上筛选，得到同时含有pET-A2与pACYC-rimJ的重组菌rimJ^-kan^rJM109(DE3)/pET-A2/pACYC-rimJ。这样，在重组菌内A2和rimJ的表达都由T7启动子控制，可以用IPTG诱导同时表达。
将重组菌rimJ^-kan^rJM109(DE3)/pET-A2/pACYC-rimJ接入含有100mg/L氨苄青霉素和25mg/L氯霉素的2ml LB培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；pH7.0)中，30℃培养12小时。然后转接到50ml的相同培养基中，30℃振荡培养10小时，作为种子。将种子接入1升含有100mg/L氨苄青霉素和25mg/L氯霉素的LB培养基中37℃培养至菌密度A₆₀₀＝0.4-0.5时，加入终浓度为0.5mM IPTG，继续培养4小时，离心，收集菌体。
按照实施例1中所述方法，将收集的菌体破碎，离心、过滤，再进行镍金属螯合亲和层析纯化，层析后的样品再用C8柱进行纯化，收集的样品用于Q-TOF-MS质谱分析测定分子量。
结果如图10所示，表明在突变株rimJ^-kan^rJM109(DE3)中将A2与RimJ共表达时，表达产物A2全部以乙酰化形式存在。这一结果进一步说明rimJ基因的产物决定了A2的乙酰化修饰。
实施例3、制备N-末端乙酰化修饰的胸腺素Tα1
前述研究确证了rimJ就是使Tα1乙酰化修饰的关键酶，通过将Tα1融合蛋白与rimJ基因共表达，可使Tα1融合蛋白全部被乙酰化修饰。为获得完整结构的Tα1，需要对融合蛋白进行切割。切割方法可采用酶裂解法、化学裂解法，以及内含肽介导的切割方法。本实施例介绍利用内含肽切割获得N-末端乙酰化修饰的胸腺素Tα1。
一、构建工程菌
(一)构建Tα1与Spl DnaX内含肽融合蛋白表达载体pET-AS
编码Spl DnaX内含肽的基因序列如序列表中序列9所示，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切编码Spl DnaX内含肽的基因，再用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切pET22b载体，连接，得到含有Spl DnaX内含肽的编码基因的重组载体pET-S。
设计两条寡核苷酸片段TA和TAS，将两条片段进行自身退火延伸，得到约100bp的产物；将产物用NdeI和Afl II双酶切，用NdeI和Afl II双酶切pET-S，连接，筛选、测序验证，得到表达Tα1与SplDnaX内含肽融合蛋白(AS)的重组载体pET-AS。其中，Tα1与SplDnaX内含肽融合蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表中序列11所示(序列11自5′末端第4-87位核苷酸为Tα1的编码基因，第88-495位核苷酸为SplDnaX内含肽的编码基因)，Tα1与SplDnaX内含肽融合蛋白的氨基酸序列如序列表中序列10所示，序列10自N端第2-29位氨基酸残基所示的氨基酸序列为Tα1，第30-165位氨基酸残基所示的氨基酸序列为SplDnaX内含肽。
引物序列如下：
TA：5’-GAA TTC CAT ATG TCA GAT GCA GCA GTA GAT ACT AGC TCT GAAATC ACT ACC AAA GAC CTG AAG GAG AAG AAG-3’
TAS：5’-GCT GCT ACT TAA GCA GTT CTC AGC CTC TTC GAC AAC TTC CTTCTT CTC CTT CAG GTC-3’
TA和TAS的自身退火延伸反应条件如下：
反应体系：

PCR反应条件：

(二)构建重组菌
将重组载体pET-AS与pACYC-rimJ共同转化到大肠杆菌BL21(DE3)，在含有100mg/L氨苄青霉素和25mg/L氯霉素的LB平板上筛选，得到同时含有pET-AS与pACYC-rimJ的重组菌BL21(DE3)/pET-AS/pACYC-rimJ。这样，在重组菌内AS和rimJ的表达都由T7启动子控制，可以用IPTG诱导同时表达。
二、N-末端乙酰化的Tα1的制备
发酵：将工程菌BL21(DE3)/pET-AS/pACYC-rimJ接入含有100mg/L氨苄青霉素的2ml LB培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L；pH7.0)中，30℃培养12小时。然后转接到50ml的相同培养基中，30℃振荡培养10小时，作为种子。将种子接入1升含有氨苄青霉素的FML培养基中(酵母粉12g/L，蛋白胨15g/L，Na₂HPO₄·2H₂O 3g/L，KH₂PO₄·3H₂O 7g/L，NaCl 2.5g/L，葡萄糖2g/L，2mM乳糖，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，100mg/L氨苄青霉素)，30℃振荡培养10小时(振荡速度为250rpm/min)，离心，收集菌体。
分离纯化：取菌体(湿重10克)，加100mL缓冲液PB(50mM磷酸盐缓冲液，pH7.0)，冰浴条件下超声破菌。破菌后补加5.844克NaCl和2克Triton X-100，定容至200mL，8000rpm离心40min，取上清，将上清用0.45μm的滤膜过滤，收集滤液，将滤液进行镍金属螯合亲和层析纯化。
镍金属螯合亲和层析柱(16×60mm)先用缓冲液A(50mM磷酸盐缓冲液，0.5MNaCl，pH7.0)平衡4个柱体积，然后上样，再用缓冲液B(50mM磷酸盐缓冲液，0.5M NaCl，10％甘油，pH7.0)冲洗10个柱体积，接着再用缓冲液A平衡4个柱体积。然后用缓冲液C(50mM磷酸盐缓冲液，0.5M NaCl，200mM咪唑，pH7.0)直接洗脱。
将破菌获得的总蛋白、亲和层析纯化得到的蛋白进行电泳，结果如图11所示(泳道1表示蛋白质分子量标准，泳道2表示破菌后离心得到的沉淀样品，泳道3表示破菌后离心得到的上清样品，泳道4表示样品穿过柱子后的收集液，泳道5至7表示洗脱收集的不同样品)，表明目的蛋白基本都挂上柱，并去除了大部分杂蛋白。
向含有目的蛋白AS的组份中，加入200mM的巯基乙醇，于37℃进行切割24小时，对切割后的样品进行电泳，然后将切割样品进行脱盐，通过阴离子层析纯化。
切割样品进行脱盐的方法：50ml切割样品经过0.22μm的膜滤后，上G15FF凝胶层析柱(柱体积300ml，北京韦氏博慧色谱科技有限公司)，用2个柱体积的缓冲液A(20mM的组氨酸，PH6.0)进行洗脱，缓冲液A的流速为8mL/min，收集蛋白质峰。
阴离子层析纯化的方法：将上面收集的蛋白质峰样品上Q Sepharose HP(GEHealthcare，柱体积15ml)，用缓冲液A(20mM的组氨酸，PH6.0)平衡后，用缓冲液B(20mM的组氨酸，1M NaCl，PH6.0)进行线性梯度洗脱。流速为4ml/min。梯度条件为：在300ml的体积内将洗脱液逐渐从100％的缓冲液A转换为100％的缓冲液B。收集样品。
结果如图12所示(泳道1表示蛋白质分子量标准，泳道2表示切割前样品，泳道3表示切割后样品，泳道4表示样品穿过阴离子柱子后的收集液，泳道5至7表示阴离子交换层析洗脱收集的不同样品)，表明大约80％的样品都被切割，通过阴离子交换可以获得比较纯的Tα1。
纯化样品进行质谱分析，质谱分子量测定结果如图13所示，只有N-末端乙酰化的Tα1峰3106.7Da(分子量理论值为3107Da)，未发现非乙酰化的Tα1(分子量理论值为3065Da)，表明获得的Tα1全部为乙酰化形式。经串联质谱测序证明乙酰化修饰发生在N-末端的Ser残基上。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所
<120>一种制备N末端乙酰化的胸腺素α1的方法及其专用工程菌
<130>CGGNAC92068
<160>11
<210>1
<211>129
<212>PRT
<220>
<223>
<400>1

<210>2
<211>390
<212>DNA
<220>
<223>
<400>2

<210>3
<211>83
<212>PRT
<220>
<223>
<400>3

<210>4
<211>252
<212>DNA
<220>
<223>
<400>4


<210>5
<211>175
<212>PRT
<220>
<223>
<400>5

<210>6
<211>528
<212>DNA
<220>
<223>
<400>6

<210>7
<211>194
<212>PRT
<213>肠杆菌科埃希菌属大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>7


Gly Arg
<210>8
<211>585
<212>DNA
<213>肠杆菌科埃希菌属大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>8

<210>9
<211>420
<212>DNA
<220>
<223>
<400>9


<210>10
<211>173
<212>PRT
<220>
<223>
<400>10

<210>11
<211>522
<212>DNA
<220>
<223>
<400>11