技术领域
本发明涉及生物信息学和生物技术领域，具体地，本发明提供了基于高通 量基因组测序的绵羊肉和鸭肉混合肉类成分的定量检测方法。
背景技术
随着经济的发展和生活水平的提高，人们对肉类的需求日益增加，品种选 择越来越丰富。近年媒体曝光的"假羊肉"事件，在社会上引起了广泛的关注， 由于绵羊肉脂肪含量比较山羊高，吃起来更加细腻可口，不法商贩趁机在绵羊 肉中添加价格低廉的鸭肉，冒充优质绵羊肉，欺骗广大消费者。由于我国食品 检测监督条件不完善以及技术水平和检测成本的限制，使得"假羊肉"事件发生 后，检测部门只能对样品掺假进行定性分析，而不能给出鸭肉在羊肉中掺杂的 比例的定量检测，无法依据混合的比例程度进行进一步的执法处罚。当前，肉 类混合样品的定量鉴定技术上，并没有一个可行的标准检测方法。基于荧光定 量PCR方法理论上虽能准确鉴定肉样来源和混合比例，但是定量PCR技术重复 性不佳，需要熟练的技术人员，而且费用较高，通量比较低。因此，高效准确 经济的鉴定肉类样品依然是一个需要解决的难题。
因此，本领域迫切需要一种基于高通量测序技术平台开发的对绵羊肉和鸭 肉的混合成分进行定量检测的新方法。
发明内容
本发明的目的之一即在于提供一种基于高通量测序技术平台开发的一种 绵羊肉和鸭肉混合成分的物种定量检测新方法。
在本发明的第一方面，提供了一种测定混合肉类的定量检测方法，包含以下 步骤：
(a)提供一待测样品；
(b)从所述样品中，提取全基因组DNA；
(c)用上一步骤的全基因组DNA，构建PCR-free文库；
(d)对上一步骤的PCR-free文库进行测序，从而获得所述待测样品的全基因组 DNA读序；
(f)将所述读序与动物全基因组DNA标准序列进行比对，从而获得匹配的读序 (即比对上的读序)；
(g)计算与所述动物物种全基因组DNA标准序列相匹配的匹配读序的碱基数 总长占总读序碱基数长度的百分比，即读序的比对率；
(h)基于所述的读序比对率，根据制作的标准曲线计算所述待测样品中各动物 源性成分的含量。
在另一优选例中，在步骤(h)中，通过与标准曲线的比较或通过拟合公式的计 算，得出所述待测样品中动物源性成分的含量。
在另一优选例中，在步骤(h)中，所述的标准曲线包括二种或多种不同动物的 全基因组DNA的“读序比对率－质量含量百分比”标准曲线。
在另一优选例中，所述的标准曲线包括，绵羊和鸭的2种不同动物的全基因组 DNA的“读序比对率－质量含量百分比”标准曲线。
在另一优选例中，所述的样本含有2种或多种肉类。
在另一优选例中，所述的肉类为鸭和绵羊的混合肉。
在另一优选例中，在步骤(h)中，包括与绵羊的标准曲线进行比较或通过拟合 公式的计算，得出所述待测样品中绵羊肉的质量含量。
在另一优选例中，在步骤(h)中，包括与鸭的标准曲线进行比较或通过拟合公 式的计算，得出所述待测样品中鸭肉的质量含量。
在另一优选例中，所述的绵羊的拟合公式如下式I所示：
Y＝1.1809X(I)
式中，Y为绵羊肉的质量百分比，按样本的总质量计算；
其中，X为混合肉样本中比对到绵羊染色体基因组的所有读长的碱基数之和/ 测序中所有读长碱基数的总和；
和/或
所述的鸭肉的拟合公式如下式II所示：
Y’＝1.345X’(II)
式中，Y’为鸭肉的质量百分比，按样本的总质量计算；
其中，X’为混合肉样本中比对到鸭染色体基因组的所有读长的碱基数之和/测 序中所有读长碱基数的总和。
在另一优选例中，X’为1-90％；较佳地为10-90％，更佳地为30-90％。
在另一优选例中，X为1-90％；较佳地为10-90％，更佳地为30-90％。
在另一优选例中，在步骤(h)中，按以下判断标准确定羊肉的含量：
当X为≤1％，羊肉的含量为0-1％；
当X为1-10％，羊肉的含量为1-15％；
当X为10-50％，羊肉的含量为10-60％；
当X为50-80％，羊肉的含量为50-95％；
当X为80-99％，羊肉的含量为90-100％；
其中，X为比对到绵羊的读序的比对率；
和/或
在步骤(h)中，按以下判断标准确定鸭肉的含量：
当X’为≤1％，鸭肉的含量为0-1.5％；
当X’为1-10％，鸭肉的含量为1-15％；
当X’为10-50％，鸭肉的含量为10-70％；
当X’为50-70％，鸭肉的含量为60-95％；
当X’为70-99％，鸭肉的含量为90-100％。
其中，X’为比对到鸭的读序的比对率。
在另一优选例中，所述的样品选自：生的、熟制的、半熟制的、腌制的、熏 制的、冷冻和/或冷藏的肉类和/或水产样品，以及它们的组合；并且
所述的样品包含动物脏器和血制品。
在另一优选例中，所述方法还设置阳性对照组；并且，
所述阳性对照组的试验条件与测试组相同，不同点在于，所述阳性对照组中 为成分已知的单一肉类样品。
在另一优选例中，在步骤(c)中包括以下步骤：
先将所述的全基因组DNA打断为150-350bp(更佳地150-250bp)的片段，然后再 构建文库；和/或
对于所述的经处理的片段化DNA进行纯化，从而获得大小为200-300bp(较佳 地240-260bp)的DNA片段。
在另一优选例中，在所述打断中，采用CovarisLE220打断仪进行打断。
在另一优选例中，在步骤(c)中，还包括对打断的片段化DNA，进行末端修复、 连接接头、和缺口平移处理。
在另一优选例中，在步骤(c)中，还包括在步骤(d)中，用选自下组的测序仪器 进行测序：IonProtonTMSystem，LifeTechnologies的proton或PGM,Illumina HiSeq,ABISOLiD,Roche454。
在另一优选例中，优选使用IonProtonTMSystem进行测序。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施 例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技 术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了本发明的一个优选例中绵羊肉拟合曲线。其中：
x:为混合肉样本中比对到绵羊染色体基因组的所有读长的碱基数之和/测 序中所有读长碱基数的总和。
y:绵羊肉在混合肉中的质量比例
图2显示了本发明的一个优选例中鸭肉拟合曲线。其中：
x:为混合肉样本中比对到鸭染色体基因组的所有读长的碱基数之和/测序 中所有读长碱基数的总和。
y:鸭肉在混合肉中的质量比例
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现对于混合肉类(如绵羊和 鸭的混合肉)，通过提取总DNA、打断、加接头，建立DNA小片段文库进行测 序，所计算出的各自动物的Mappingrate(比对率)与所述混合肉类中各物种肉 类的质量含量百分率之间存在良好的线性关系，因此，可通过所述的比对率来 定量测定所述混合肉类样品中相应肉类的质量含量百分率。此外，本发明还提 供了在DNA文库构建过程中，对于不同的样品连接不同的barcode序列接头，从 而对多样品可进行高通量的准确的定量检测。在此基础上完成了本发明。
读序比对率
该比对率为比对到某一物种基因组的读序的有效碱基数占总测序读序有效碱 基数的百分比，例如测序的10,000个读序中(读序平均长度150bp，总有效基因150 ×10000＝1,500,000bp)，有9000条读序与鸭基因组匹配，匹配的读序(匹配的读序 平均长度100bp，有效碱基数为9000×100＝900,000bp，)，故鸭肉的读序比对率百 分比为900000/1500000＝60％。
文库构建
在本发明中，为了提高检测的准确性和可靠性，优选构建针对全基因组DNA 的PCR－free文库。
在本发明的一个优选例中，包括以下步骤：
将待检测的样品研磨均匀后，提取全基因组DNA。使用CovarisLE220仪 器将DNA打断为200bp左右片段，末端修复酶修复补平，片段两端分别连接测 序的P接头和含有区分样品的barcode序列的A接头。通过磁珠纯化去除多余 的接头序列，琼脂糖凝胶进行电泳，回收添加接头片段的240bpbp-260bpbp片 段。使用Agilent2100和Qpcr检测文库，符合上机测序的标准。
测序
在本发明中，可用常规的测序技术和平台进行测序。优选的测序方法包括： LifeTechnologies的proton或PGM,IlluminaHiSeq,ABISOLiD,Roche454 等测序仪器。
在本发明中，特别适合对本发明构建的PCR－free文库进行测序的方法是 IonProton法。在一优选例中，将符合上机测序标准的文库片段，使用TheIon ProtonTMSystem进行测序。
具体地，本发明的PCR－free文库具体是指，建库过程中，不通过pcr手 段富集上机测序的片段的方法，去除了pcr过程产生的误差，包括但不限于通 常高通量测序文库构建过程中常用的测序建库方法。
数据处理
在本发明的优选例中，数据处理通常包括以下步骤：以Ensembl数据库中 公布的动物源性全基因组基因组为参考标准。将测序的读序与全基因组序列比 对，确定匹配的读序(即比对上的读序)，并计算比对上读序碱基数占总测序读 序的碱基比例。
在另一优选例中，在数据分析之前，还包括对所获得的读序进行长度选择， 选取读长为80-220bp，较佳地90-200bp，更佳地100-190bp的读序。
在另一优选例中，所述的匹配的读序是与动物全基因组DNA基因组标准序列 的匹配度(或同一性)为95％～100％的所有读序(即允许错配率为≤5％)。
在另一优选例中，所述的比对率是所有匹配的读序的碱基长度占所述样品测 序读序碱基总长度的百分比。
数据处理可以用本领域采用的方法或软件进行，包括市售的软件、公开的软 件(尤其是全部开源的软件)进行。
检测结果判定标准
样品设3个重复，阳性对照设2个重复，分别以全基因组上读序的比对率 平均值对应的质量值作为最终定量的结果。
其中，阳性对照组中，根据标准曲线计算的质量含量百分率>95％,若全基 因组上读序的比对率<10％，则可作为有效的阳性对照。
本发明的优点包括
1)定量检测；
2)准确、快速，误差在10％以内；
3)通量高，一次上机可检测数十个样本。；
4)价格低廉，有效降低了成本。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方 法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork: ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂 商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例
1.肉类取样方法
肉类样品取样按照GB/T9695.19-2008采样，将样品去除筋膜后剪碎，研 磨均匀后待用。
2.肉类DNA样品的制备
取其中1g试验样品，用PBS溶液冲洗干净，加入3mL的组织裂解液(0.1MEDTA 0.25MTris-HCl)，20uL的蛋白酶K(50mg/mL)，200uL的SDS(20％)，混匀后56 ℃水浴1小时，中间轻柔混合数次。室温冷却后，加入等体积的酚\氯仿\异戊 醇(25:24:1)，轻柔颠倒混匀至浑浊乳滴状，至无明显分界；6000rpm离心10min， 转移上清至新的15ml离心管；按照体积2:3的比例加入-20℃预冷的异丙醇，颠 倒混匀，放入-20℃冰箱1-2小时。在4℃下，6000rpm离心10min，收集沉淀， 去除残留液体；加入1mL4℃预冷的70％的乙醇洗涤并将沉淀转移到新的1.5mL的 离心管中，重悬沉淀，12000rpm离心5min；倒出上清，加入500uL4℃预冷的乙 醇，轻弹重悬沉淀，12000rpm离心5min；缓慢倒出上清，去除管口残留液体， 室温干燥10-20min。
所制备的样品加入适量TEbuffer溶解DNA；加入2-10uL的RNaseA(10mg/mL), 37℃酶解作用30min；0.6％的琼脂糖凝胶检测无误后，置于-20℃冰箱保存待用。
3.DNA含量的判定
DNA:1.6<OD260/OD280<2.0，则表明DNA总量>5ug。
实施例1
构建高通量测序的PCR-free文库
1.1打断
将提取的DNA于室温解冻，抽取5ug，使用市售超声打断仪CovarisLE220 将其打断为200bp左右片段。
1.2修复
将打断后的DNA片段的混合物转移至1.5mLEP管进行末端修复。修复反应 体系组成如下表1。
表1DNA片段修复反应体系组成
在1.5mLEP管中，加入表1中所示的各组分后，吹打混匀，室温孵育20min。 加入360uL室温平衡好的纯化磁珠,吹打混匀，室温孵育5min。将离心管置于磁 力架上3min，至液体澄清，移去上清。加入500uL新配的70％乙醇，反复颠倒 离心管多次，静置30s，至液体澄清，移去上清。加入纯化磁珠,重复一次。打 开管盖，室温干燥5min。从磁力架上取下，加入25uLTE重悬磁珠，反复吹打， 并涡旋震荡10s。瞬时离心后将离心管置于磁力架上2min，至液体澄清。用移 液器将含DNA的上清转移至0.2mLPCR管中。
1.3连接接头、缺口平移及纯化
对末端经修复的片段，进行接头连接、缺口平移及纯化。其中，在表2A所 示的体系中进行连接接头和缺口平移反应。
表2A片段连接接头，缺口平移反应体系组成
组分 体积(uL) 末端修复的DNA(上一步末端修复的全部DNA片段) 25 10×连接酶缓冲液(T4 DNA连接酶buffer) 10 不含核酶的纯水 59 P-接头(见表2B) 2 A-接头(见表2C和表2D) 2 DNA连接酶(T4 DNA连接酶) 2 总计 100
表2BP-接头序列
表2CA-接头序列
表2DA接头barcode序列
barcode SEQ ID NO.: A接头-1 CTAAGGTAAC 3 A接头-2 TAAGGAGAAC 4 A接头-3 AAGAGGATTC 5 A接头-4 TACCAAGATC 6 A接头-5 CAGAAGGAAC 7 A接头-6 CTGCAAGTTC 8 A接头-7 TTCGTGATTC 9 A接头-8 TTCCGATAAC 10 A接头-9 TGAGCGGAAC 11 A接头-10 CTGACCGAAC 12 A接头-11 TCCTCGAATC 13 A接头-12 TAGGTGGTTC 14 A接头-13 TCTAACGGAC 15 A接头-14 TTGGAGTGTC 16 A接头-15 TCTAGAGGTC 17 A接头-16 TCTGGATGAC 18 A接头-17 TCTATTCGTC 19 A接头-18 AGGCAATTGC 20 A接头-19 TTAGTCGGAC 21 A接头-20 CAGATCCATC 22
在1.5mLEP管中，加入表2A的组分后，吹打混匀，放于PCR仪上，于25℃， 保温15min；72℃，保温5min。
将反应产物转移至1.5mL离心管中，加入150uL(1.5倍体积)纯化磁珠， 使用移液器吹打混匀，室温孵育5min。将离心管置于磁力架上3min，至液体澄 清，移去上清。加入500uL新配的70％乙醇。静置30s，至液体澄清，移去 上清。重复一次后，打开管盖，室温干燥5min。加入22uLTE重悬磁珠，反复 吹打，并涡旋震荡10s。瞬时离心后将离心管置于磁力架上2min，至液体澄清。 将含DNA的上清转移至新的1.5mL离心管中。
纯化采用2.25％的琼脂糖凝胶进行电泳，回收240bp-260bp的DNA片段，即 得到PCR-free文库。
1.4PCR-free文库的测定
将构建好的文库，吸取4uL，使用市售的Agilent2100仪器进行检测。
结果表明：所述文库的插入片段大小为250bp±10％，摩尔浓度≥10nM。
1.5.样品保存
将所构建的上机DNA文库置于-20℃保存，备用。
实施例2肉类检测
2.1高通量测序上机
将实施例1所建库成功的样品文库，使用市售的TheIonProtonTMSystem 进行测序，将得到的结果进行数据分析。具体设置参照仪器说明使用。
2.1.1数据产出有效判定
用上述方法所构建的PCR-free文库,用TheIonProtonTMSystem进行测序， 所获得的用于计算读序(reads)比对率的读序应符合系列标准。
读序读长介于100—190bp,错配率≤5％，单一样品有效读序数量≥107。
阳性对照样品根据标准曲线gDNA基因组质量含量百分比≈100％。
阴性对照样品根据标准曲线gDNA基因组质量含量百分比<10％。
2.2检测数据分析
以数据库(如中已测得的或NCBI中公布的)的绵羊和鸭基因组(见表3A)，作 为参考标准，将经定性检测混合成分为绵羊和鸭肉的样品测序得到的符合2.2 标准的读序序列分别与羊和鸭全基因组序列比对，获取Mappingrate(读序碱基 的比对率)，根据拟合的曲线公式(见表3B)计算对应样品中各物种的质量含 量百分比。
表3A绵羊和鸭的基因组序列的参考数据库链接
表3B基于TheIonProtonTMSystem平台的绵羊和鸭肉的拟合曲线公式
(注：x：mappingrate；y：质量含量百分率)
2.2.1参考基因组建库
使用公开的tmap3.4.1软件(注：本实施例中的公开软件都是指相应程序对公 众完全开源的软件)对参考基因组建库，对Proton测序所获得的下机数据进行转 换，使用命令：
tmapindex-abwtsw-freference.fa
2.2.2比对
使用公开的tmap软件进行比对，命令行如下：
tmapmapall-a2–n16–freference.fa–rinput.bam-v-Y-u–o1 stage1map4>output.bam
2.2.3读序比对率(mappingrate)统计
对output.bam进行统计，过滤长度小于100或者大于190的读序；然后计算 每个读序的错配率，取错配率小于5％的读序进行统计，得到每个样品的读序的比 对率。
2.3对照试验
在基因组提取、文库构建、IonProton测序，数据分析中用分别含绵羊、鸭 的肉样为阳性对照。用不含绵羊和鸭肉成分的样品作阴性对照。
3数据产出有效判定
3.1用上述方法所构建的PCR-free文库,用TheIonProtonTMSystem进 行测序，所获得的读序(reads)的信息如下：
总读序数量为1×108至1×109，其中读长介于100—190bp的读序占约 70-80％。
这表明，本发明方法所构建的PCR-free文库不仅质量高，而且特别适合 通过IonProtonTMSystem进行测序。
从所获得的reads中，选取读长介于100—190bp且错配率≤5％的读序， 对于单一样品，选取数量≥1×107个有效读序即可用于后续分析(选取的数量也 可多至包括所有满足上述条件的有效读序)。
阳性对照样品根据标准曲线gDNA基因组质量含量百分比≈100％。
阴性对照样品根据标准曲线gDNA基因组质量含量百分比<10％。
实施例1
样品检测试验No.1
将羊肉和鸭肉混合的的11个样品为例，经过建库、测序后分别与两者的 染色体基因组序列比对，计算比对率(Mappingrate)；
其中，在检测前，所述样品是事先已知绵羊肉与鸭肉的混合比例但试验者 未知的样品，样品质量混合的比例为0％、1％、5％、10％、30％、50％、70％、90％、 95％、99％、100％。
如下表所示。
表4各混合样品比对结果
羊拟合曲线中显示的检验位点如图1所示；鸭拟合曲线中显示的检验位点 如图2所示。误差Δ分析结果如表5所示。
表5绵羊肉和鸭肉的误差Δ分析结果
讨论：
上述图表均表明了检验数据与拟合的曲线具有良好的吻合度，并且误差控 制在10％以内。曲线能够准确反应质量含量百分率和Mappingrate之间的关系， 可以作为检测标准曲线。
以样本绵羊肉混合30％为例，样本与绵羊的染色体基因组比对，读序长度 比对率24％，基于图1的标准曲线或式I公式，得出绵羊肉含量为28.5％。
与鸭的染色体基因组比对，读序长度比对率50％，基于图2的标准曲线或式 II公式，得出鸭羊肉含量为67.8％。
两者的质量误差分别为约1.5％和约2％。
这表明，本发明方法不仅定量结果准确，而且误差较小。可以应用于一般 的定量检测。
实施例2
样品检测试验No.2
在本实施例中，检测的样品为绵羊肉与鸭肉的混合肉类样品(样品4、样品 5、样品6)，并将测序结果与鸭子、绵羊的基因组进行比对并计算比对率。其 中，在检测前，所述样品是事先已知绵羊肉与鸭肉的混合比例但试验者未知的 样品。
以样本4为例，样本4与绵羊的染色体基因组比对，读序长度比对率X4a 为7％，基于图1的标准曲线或式I公式，得出绵羊肉含量为：8％
与鸭的染色体基因组比对，读序长度比对率X4b为63％，基于图2的标准 曲线或式II公式，得出鸭绵羊肉含量为：85％。
所有样品4-6的定量检测结果汇总于下表。
表6定量检测结果
讨论：
将上述检测结果与各样品的实际构成进行比较，发现几乎完全一致。这表 明，本发明方法不仅非常准确。
并且，实验结果显示，本发明所提供的这种方法检测面广，定量结果准确， 误差小。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。