技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及检测NHP2基因第4号全外显子序列突变的引物、方法和试剂盒。
背景技术
先天性角化不良症(dskeratosis eongenita，DC)是一种具有遗传异质性的骨髓衰竭综合征，发病率约为1/100万。典型的DC患者约80％～90％具有皮肤黏膜异常三联征，表现为皮肤网状色素沉着、指(趾)甲萎缩、口腔黏膜白斑。目前文献报道可引起DC的突变基因主要有CTC1，DKC1，TERC，TERT，TINF2，NOP10，NHP2及WRAP53。文献报道，这些基因有3种遗传方式，分别为X-连锁隐性遗传、常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传。但目前仍约50％患者遗传特征不明确。X-连锁隐性遗传包括DKC1，常染色体显性遗传包括TERC及TINF2，常染色体隐性遗传包括CTC1，WRAP53，NOP10，NHP2，既可以作为常染色体显性遗传又可以作为隐性遗传的有TERT。NHP2位于5q35.3位点负责编码端粒酶相关蛋白复合体组分蛋白的基因。NHP2蛋白是端粒酶相关蛋白复合体的核心蛋白之一，与dyskerin、NOP10、GAR1蛋白共同参与了真核生物核糖体的合成，前体mRNA剪接和端粒的维持。Vulliamy等在先天性角化不良症患者中发现NHP2存在突变，该突变缩短了端粒酶的长度，并降低了TERC的表达量水平。
近年来，通过全基因组测序，发现NHP2基因突变在先天性角化不良症患者中非常常见。文献报道NHP2基因突变存在3个突变热点，集中在第4外显子中。突变热点V126M(G376A)，能引起该基因第126密码子缬氨酸到蛋氨酸的改变；突变热点Y139H(T415C)，能引起该基因第139密码子酪氨酸到组氨酸的改变；突变热点X154R(T460A)，该位点突变使终止密码子变成精氨酸，并使得氨基酸链的C端增长55个氨基酸。这些位点的变异能引起端粒酶RNA水平减低及端粒长度明显缩短，并降低了TERC的表达量水平。目前国内文献报道的DC病例绝大多数为30岁左右皮肤受累的临床病例，病例数较少，且较少进行基因检测。因此有必要进行相关基因的突变检测，有必要先对患者进行V126M、Y139H、X154R突变进行筛选，有助于对先天性角化不良症的早期诊断，减少误诊、漏诊，并进行治疗。
本发明采用Touch-down PCR扩增和Sanger测序法检测NHP2基因第4号全外显子序列的突变，并且设计的引物可以扩展整个第4号全外显子序列，包括待检测的所有突变位点。Touch-down PCR扩增可确保正、反向扩增引物与样本DNA模板的结合发生在最互补的序列之间，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异性扩增产物在此时已经有一个几何数的起始优势，丰度较高，在剩余的扩增反应中，特异性扩增产物与非特异扩增产物产生竞争，但是因非特异性扩增产物丰度较低，特异性扩增产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。而Sanger测序法是检测基因突变的金标准，检测结果准确性高，并且很大程度上地节省了检测成本。
发明内容
本发明的目的在于提供检测NHP2基因第4号全外显子序列的引物，其特征在于，包括：扩增NHP2基因第4号全外显子序列的正、反向引物；其碱基序列为：
NHP2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTAGGCTGGTGGGTCATCAGTTG
NHP2-R：AACAGCTATGACCATGAGGAGGACAGCCAGTCGTCCTG。
进一步地，所述引物还包括一对测序引物，为通用引物M13，其碱基序列为
M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13-R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，所述正、反向引物的使用浓度比为：NHP2-F:NHP2-R＝1:1。
进一步地，所述一对测序引物的使用浓度比为：M13-F:M13-R＝1:1。
进一步地，所述正、反向扩增引物的扩增反应条件为：第一阶段，95℃预变性10min；第二阶段，变性温度94℃30sec，退火温度64℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度94℃30sec，退火温度58℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。
本发明的目的还在于提供一种检测NHP2基因第4号全外显子序列的方法，其包括如下步骤：
(1)提取样本DNA；
(2)利用一对扩增引物NHP2-F和NHP2-R对(1)中的DNA进行扩增，获得扩增产物；
(3)利用一对测序引物M13-F和M13-R对(2)中的扩增产物进行测序，获得所述扩增产物的基因序列；
(4)将(3)中的基因序列与NHP2基因野生型参考序列NHP2-ref进行比较，确定突变位点是否存在，其特征在于，
NHP2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTAGGCTGGTGGGTCATCAGTTG
NHP2-R：AACAGCTATGACCATGAGGAGGACAGCCAGTCGTCCTG
M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13-R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，步骤(2)中的扩增反应条件为：第一阶段，95℃预变性10min；第二阶段，变性温度94℃30sec，退火温度64℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环16次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度94℃30sec，退火温度58℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。
本发明的目的还在于提供一种检测NHP2基因第4号全外显子序列突变位点的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括样本DNA抽提试剂；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中检测体系PCR反应液包括一对扩增产物NHP2-F和NHP2-R，测序体系反应液包括一对测序引物M13-F和M13-R，其特征在于：
NHP2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTAGGCTGGTGGGTCATCAGTTG
NHP2-R：AACAGCTATGACCATGAGGAGGACAGCCAGTCGTCCTG
M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13-R：AACAGCTATGACCATG。
进一步地，所述试剂盒包括NHP2基因野生型参考序列NHP2-ref。
进一步地，所述测序纯化液包括由虾碱性磷酸酶和核酸外切酶I组成的测序纯化液。
本发明的有益效果：本发明设计了扩增NHP2基因第4号全外显子序列的正，反向引物，构建了稳定的Touch-down PCR扩增体系，对整个第4号全外显子序列进行扩增，包含待检测的所有突变位点，同时在扩增时，富集正、反向引物与模板正确配对的特异性扩增产物，提高扩增特异性。此外，通过调整正、反向扩增引物的浓度、退火温度等反应条件，可使扩增效率达到最佳，并采用Sanger测序法，对PCR扩增产物进行测序反应扩增、纯化后变性、直接测序检测NHP2基因第4号全外显子序列中各突变位点的突变情况，具有灵敏度高、操作简单和成本低等优点。
附图说明
图1 NHP2基因PCR扩增电泳结果图。M为TAKARA DL2000。
图2样本1 NHP2基因V126M检测结果图。
图3样本2 NHP2基因V126M检测结果图。
图4样本3 NHP2基因V126M检测结果图。
图5样本1 NHP2基因Y139H检测结果图。
图6样本2 NHP2基因Y139H检测结果图。
图7样本3 NHP2基因Y139H检测结果图。
图8样本1 NHP2基因X154R检测结果图。
图9样本2 NHP2基因X154R检测结果图。
图10样本3 NHP2基因X154R检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
检测NHP2基因第4号全外显子序列的引物，包括：扩增NHP2基因第4号全外显子序列的正、反向引物；其碱基序列为：
NHP2-F：TGTAAAACGACGGCCAGTATTAGGCTGGTGGGTCATCAGTTG
NHP2-R：AACAGCTATGACCATGAGGAGGACAGCCAGTCGTCCTG。
优选地，所述引物还包括一对测序引物，为通用引物M13，其碱基序列为
M13-F：TGTAAAACGACGGCCAGT
M13-R：AACAGCTATGACCATG。
在检测中，先利用上述正、反向引物对NHP2基因第4号全外显子序列进行扩增，获得扩增产物，然后利用上述一对测序引物对扩增产物进行测序，获得扩增产物的基因序列。
检测NHP2基因第4号全外显子序列的试剂盒，包括：样本DNA抽提试剂(例如使用天根生物的试剂盒来抽提样本DNA)；无水乙醇；检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，其中
检测体系PCR反应液包括：2×PCR Buffer；2mM dNTPs；KOD FX DNA Polymerase(1U/μl)；扩增NHP2基因第4号全外显子序列突变位点的正、反向引物NHP2-F(10μm)、NHP2-R(10μm)。
测序体系反应液包括：测序纯化液、EDTA(125mmol)、无水乙醇、75％乙醇、HIDI(高度去离子甲酰胺)、测序引物：NHP2-F(3.2μm)、NHP2-R(3.2μm)，以及Bigdye Terminator V3.1(购买自美国Applied Biosystems公司)，其中测序纯化液包括虾碱性磷酸酶(SAP)0.6U和核酸外切酶I(EXONI)1.2U。
检测体系PCR反应液试剂配制如下：
其中，NHP2-F和NHP2-R的碱基序列为：
阳性对照品：含有NHP2序列的溶液。
阴性对照品：无NHP2序列的溶液。
空白对照品：2μl生理盐水或不加任何物质。
优选地，该试剂盒还包括NHP2基因野生型参考序列NHP2-ref，其碱基序列如下所示：
ATTAGGCTGGTGGGTCATCAGTTGGTGACTTCCTGGCATACAGGTTGTACAGCTTTTTTCCAAACAGCACTTCTTTCCCCTCTGTAGGACCTGGGTGCAGCCGCAGGCTCCAAGCGCCCCACCTGTGTGATAATGGTCAAGCCCCATGAGGAGTACCAGGAGGCTTACGATGAGTGCCTGGAGGAGGTGCAGTCCCTGCCCCTACCCCTATGAGGGGCTCCGGTAGCACCTGGGCACCTGCCGCTGGAAGCTATTGGGCTGGCAGCAGGACGACTGGCTGTCCTCCT。
实施例2
检测流程：
(1)利用血液DNA抽提试剂盒(天根生物)提取血液样本中的基因组DNA:
1)抽取500uL血液加入1000uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混匀几次。3000rpm离心5min，吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。
2)加入20μl蛋白酶K溶液，混匀。
3)加入200μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
4)加入200μl无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。
6)向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
7)向吸附柱CB3中加入700μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
8)向吸附柱CB3中加入500μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30秒，倒掉废液。
9)将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将溶液收集到离心管中，获得血液基因组DNA溶液。
(2)试剂配置：按检测人份数配置检测体系PCR反应液各Xμl，每人份18μl分装：X＝18μl反应液×(n份样本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)n为检测样本数。
(3)加样：将2ul步骤(1)中获得的血液基因组DNA溶液加入到检测体系PCR反应液中；对阳性对照实验而言，直接加2ul阳性对照品；对阴性对照实验而言，直接加2ul阴性对照品；对空白对照实验而言，加2ul生理盐水或不加任何物质。
(4)Touch-down PCR扩增：检测在常规PCR仪上进行，获得PCR扩增产物，可用仪器包括ABI veriti(美国Applied Biosystems公司)等。反应条件如下：
(5)Sanger测序：
取9μl PCR扩增产物与2μl测序纯化液。按照以下程序进行纯化，从而获得纯化产物：
将1μl纯化产物分别与测序引物M13-F(3.2μm)和M13-R(3.2μm)按照如下体系进行混合：
测序反应程序：
沉淀环节：
向完成测序反应的产物中加入2μl 125mmol的EDTA，静置5min；加入15ml无水乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心30min；倒置离心15sec，加入50ml 70％乙醇，漩涡混匀；3700rpm离心15min；倒置离心15sec，置于95℃金属浴上；加入10μl HIDI后进行变性试验。变性程序：
变性程序结束后，上测序仪(ABI3730)测序，获得PCR扩增产物的基因序列。
(6)结果判断：将(5)中获得的基因序列与NHP2基因野生型参考序列NHP2-ref进行比对，根据实际突变情况对结果进行报告。
实施例3
采用本发明核酸检测试剂盒检测临床样本。
取送检先天性角化不良症患者抗凝血样本20例，按实施例2所述检测流程提取样本中的基因组DNA，配制试剂并检测。
将2ul按照实施例2中所述检测流程提取出的每份样本基因组DNA溶液加入检测体系PCR反应液中。同时做阳性、阴性和空白对照。用普通PCR仪检测，时间为160分钟。
电泳结果如图1所示，表明本发明所述引物NHP2-F、NHP2-R对血液样本能有效扩增，且条带单一。
样品1的NHP2基因V126M正向测序结果如图2所示，为野生型，未检测出V126M突变。
样品2的NHP2基因V126M正向测序结果如图3所示，为野生型，未检测出V126M突变。
样品3的NHP2基因V126M正向测序结果如图4所示，为野生型，未检测出V126M突变。
样品1的NHP2基因Y139H正向测序结果如图5所示，为野生型，未检测出Y139H突变。
样品2的NHP2基因Y139H正向测序结果如图6所示，为野生型，未检测出Y139H突变。
样品3的NHP2基因Y139H正向测序结果如图7所示，为野生型，未检测出Y139H突变。
样品1的NHP2基因X154R正向测序结果如图5所示，为野生型，未检测出X154R突变。
样品2的NHP2基因X154R正向测序结果如图6所示，为野生型，未检测出X154R突变。
样品3的NHP2基因X154R正向测序结果如图7所示，为野生型，未检测出X154R突变。
检测结果如下表：
样本编号 本发明检测V126M结果 本发明检测Y139H结果 本发明检测X154R结果 1 未突变 未突变 未突变 2 未突变 未突变 未突变 3 未突变 未突变 未突变 4 未突变 未突变 未突变 5 未突变 未突变 未突变 6 未突变 未突变 未突变 7 未突变 未突变 未突变 8 未突变 未突变 未突变 9 未突变 未突变 未突变 10 未突变 未突变 未突变 11 未突变 未突变 未突变 12 未突变 未突变 未突变 13 未突变 未突变 未突变 14 未突变 未突变 未突变 15 未突变 未突变 未突变 16 未突变 未突变 未突变 17 未突变 未突变 未突变 18 未突变 未突变 未突变 19 未突变 未突变 未突变 20 未突变 未突变 未突变
从检测结果可以看出，本发明所述引物已经把NHP2基因第4号外显子全序列包括在内了，并且测序结果完全准确。对阳性标本的检测表明本发明所述引物和方法及试剂盒能够检测出NHP2基因突变。