技术领域
本发明涉及在酵母中的蛋白质的高分泌生产方法。
背景技术
治疗用蛋白质、抗体药物等蛋白质性医药品由于基因重组技术的发展而急速地扩展市场，作为使这些蛋白质性医药品生产的宿主使用了CHO、NS0等动物细胞；蚕等昆虫或SF9等昆虫细胞；大肠杆菌、酵母等微生物等。其中，酵母能够高密度培养，因此被广泛用作在比较廉价的培养基中可以分泌生产有用蛋白质的体系。
然而，当分泌蛋白质的存在于N末端的信号序列氨基酸区域被信号识别颗粒(SRP：signal recognition particle)识别时，该分泌蛋白质通过易位子而进入内质网，当该分泌蛋白质通过易位子时其高级结构被解开，并在内质网内进行折叠(folding)。该分泌蛋白质的折叠能够自然地发生，但各种的分子伴侣协助折叠。在内质网内所形成的天然的立体结构的形成对于分泌是重要的，错折叠的蛋白质无法进入位于下游的分泌途径，使高级结构异常的蛋白质蓄积。这种在内质网内引起的修饰(糖链、二硫键的添加)的障碍，成为从内质网的输送降低的原因，引起被称为“内质网应激”的状态。作为对应于该内质网应激的手段，真核生物的细胞诱导被称为“解折叠蛋白应答(Unfolded Protein Response, UPR)”的应激反应。UPR中的转录诱导、翻译调节是要对已蓄积的异常蛋白质进行修复的反应，但也是分解、排除异常蛋白质以维持内质网内的恒定性(恒定)的所谓内质网相关降解(ERAD：ER-associated degradation)的机制。另外，已知分子伴侣不仅有助于内质网内的蛋白质折叠，而且可以将已凝集的蛋白质解开(解链)以用于折叠。例如，HSP104与HSP70协同可以进行从凝集体可溶化蛋白质的其它伴侣不可能的反应(非专利文献1)。
另一方面，在观察蛋白质的立体结构内部时，氢键、静电相互作用、疏水性相互作用等多数相互作用在氨基酸之间发挥作用。其中，被称为二硫键的两个半胱氨酸通过接受双电子氧化而形成的硫原子之间的共价键，由于其坚固的性质在使蛋白质的立体结构稳定化方面变得非常重要。实际上，分泌到细胞外的多数分泌蛋白质具有二硫键，这推定：与膜所包围的细胞内部相比，在作为物理性、化学性更严酷的环境的细胞外发挥作用时，需要使蛋白质的结构更牢固。在酵母等真核细胞中，基于蛋白质的氧化性折叠的二硫键的导入，在内质网内通过氧化型PDI (蛋白质二硫键异构酶，Protein disulfide isomerase)来进行(非专利文献2)。将成为底物的蛋白质氧化而形成的还原型的PDI，通过局部存在于膜附近的氧化型ERO1进行再氧化(非专利文献3、4)。在酵母的内质网中，存在5种类(PDI1、EUG1、MPD1、MPD2、EPS1)的PDI家族(非专利文献5)。在这些PDI家族之中，确认到与ERO1形成分子间二硫键的是PDI1和MPD2。另外还报道了：在蛋白质的氧化性折叠中，通过将BiP/Kar2与PDI协同来提高效率(非专利文献6)。BiP/Kar2还参与与上述UPR相关的基于各种基因的活性型HAC1的诱导。活性型HAC1通过作为跨膜激酶/核酸酶(kinase/nucleas)的IRE1而使HAC1剪接，从而被活化。关于BiP/Kar2所结合的IRE1，当BiP/Kar2作用于内质网内的具有异常结构的蛋白质时发生解离，通过形成2聚体而显示核酸酶活性，将HAC1剪接而生成活性型HAC1 (非专利文献7、8)。另外，Bip/Kar2与存在于内质网的SCJ1协同，也参与在内质网内的蛋白质的折叠(非专利文献9)。
如上所述，已经明确了各种的分子伴侣参与分泌蛋白质的正确折叠，报道了：通过在酵母中使编码上述PDI1、ERO1和Kar2等分子伴侣蛋白的基因的1种或2种以上与作为表达对象的目标蛋白质基因共表达，以使具有复杂的立体结构的目标蛋白质的分泌生产性提高(专利文献1)。
但是，即使通过使这种编码PDI1、ERO1和Kar2等伴侣蛋白的基因共表达来提高目标蛋白质向培养基中的分泌生产能力，也有某些目标蛋白质在培养基中快速分解的情形。报道了：特别是存在于作为酵母的蛋白质分解细胞器而已知的液泡的蛋白酶也参与分泌蛋白质的分解(非专利文献10)。在液泡中，除了蛋白酶A、蛋白酶B、羧肽酶Y之外，还存在液泡海藻糖酶、氨基肽酶I、液泡碱性磷酸酶、液泡RNase等多数蛋白质分解酶，但其活性被控制于在液泡内发挥，特别是蛋白酶A、蛋白酶B，作为将本身或羧肽酶Y等进行活化的蛋白酶发挥作用，在蛋白质分解体系中担负着重要的作用(非专利文献11、12)。报道了：作为酸性蛋白酶之一的蛋白酶A，在酸性条件下显示出较强的活性，而伴随着pH值上升活性减弱(非专利文献13)。因此，通过调节待培养的培养基的pH值，研究抑制蛋白酶活性的培养方法，但该方法可能对宿主细胞的增殖产生影响。
在甲醇营养型酵母中，甲醇代谢通过基于醇氧化酶(AOX)的甲醇氧化而开始，已产生的甲醛通过二羟基丙酮合酶(DAS)与木糖5-磷酸固定，在糖酵解体系(解糖系経由)中用作细胞构成成分，同时在细胞质中通过谷胱甘肽依赖性甲醛脱氢酶(FLD)和甲酸脱氢酶(FDH)被氧化成CO2 (非专利文献14)。作为通过甲醇使表达得到控制的基因启动子，除了醇氧化酶(aox1、aox2)启动子、二羟基丙酮合酶(das1)启动子、甲酸脱氢酶(fdh1)启动子、甲醇氧化酶(mox)启动子之外，还已知pmp20-、pmp47-启动子等与甲醇代谢等相关的编码酶的多数基因的启动子(非专利文献15)。控制与甲醇代谢相关的酶的表达的启动子非常强，因此这些启动子通常被用于实现使各种目标蛋白质在该甲醇营养型酵母中进行分泌生产。特别是，巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)的aox1启动子作为通过甲醇诱导的非常强的启动子而已知。
另一方面，在控制与甲醇代谢相关的酶的表达的启动子的控制下使目标蛋白质分泌生产时，被认为必需进行通过甲醇的诱导。甲醇是可燃液体区分2的有害物质，指定数量以上的操作受消防法限制，需要防爆对应的工厂、设备。因此，只要用尽可能少量的甲醇可以获得与用大量甲醇进行表达诱导时同等程度的目标蛋白质的分泌生产性，则其工业上的价值巨大。另外，用于甲醇营养型酵母的甲醇代谢酶启动子的各种正向转录因子，不仅表达新规导入的目标蛋白质，也用于菌本来(固有)的甲醇代谢酶的诱导。实际上，报道了：在作为甲醇营养型酵母的伊丁假丝酵母(Candida boidinii)中，使用破坏了菌本来具有的aox1基因的株，在aox1启动子控制下，进行了使菌体内的D-氨基酸氧化酶、果糖基氨基酸氧化酶、过氧化物酶体/乙酰基亚精胺氧化酶等各种氧化酶以及B型肝炎表面抗原基因表达的尝试，破坏了菌本来具有的aox1基因的株与原母株相比，已导入的目标蛋白质的表达量提高(专利文献2、非专利文献16、17、18)。
如上所述，关于酵母中的蛋白质的高分泌生产，虽然提示了各种的方法，但通常通过基因导入、基因破坏等转化宿主细胞时，细胞会受到某种应激，因此仅通过将几种现有的方法组合，未必能够获得协同或累加的效果。另外，通过将上述各种方法与上述各种伴侣组合而使目标蛋白质高分泌生产的报道仍属未知。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2009/057813
专利文献2：日本特开昭62-104585
非专利文献
非专利文献1：Glover JR, Lindquist S, Hsp104, Hsp70, and Hsp40: A novel chaperone system that rescues previously aggregated proteins. Cell (1998) 94: 73-82
非专利文献2：Benjamin P. Tu and Jonathan S. Weissman, Oxidative protein folding in eukaryotes: mechanisms and consequences. J. Cell Biol. (2004) 164: 341-346
非专利文献3：Mezghrani, A., Fassio, A., Benham, A., Simmen, T., Braakman, I., and Sitia, R., Manipulation of oxidative proteinfolding and PDI redox state in mammalian cells. EMBO. J. (2001) 20: 6288-6296
非专利文献4：Frand, A. R. and C. A. Kaiser, Ero1p oxidizes protein disulfide isomerase in a pathway for disulfide bond formation in the endoplasmic reticulum. Mol. Cell (1999) 4: 469-477
非专利文献5：Per Norgaard, Vibeke Westphal, Christine Tachibana, Lene Alsoe, Bjorn Holst, Jakob R. Winther, Functional Differences in Yeast Protein Disulfide Isomerases. J. Cell Biology (2001) 152 (3): 553-562
非专利文献6：Marcus Mayer, Ursula Kies, Robert Kammermeier, and Johannes Buchner, BiP and PDI Cooperate in the Oxidative Folding of Antibodies in Vitro, J. Biol. Chem. (2000) 275 (38): 29421-29425.
非专利文献7：Cox JS., Shamu CE., Walter P., Transcriptional induction of genes encoding endoplasmic reticulum resident proteins requires a transmembrane protein kinase. Cell (1993) 73: 1197-1206
非专利文献8：Sidrauski C. and Walter P., The transmembrane kinase Ire1p is a site-specific endonuclease that initiates mRNA splicing in the unfolded protein response. Cell (1997) 90 (6): 1031-1039
非专利文献9：Susana Silberstein, Gabriel Schlenstedt, Pam A. Silver, and Reid Gilmore, A Role for the DnaJ Homologue Scj1p in Protein Folding in the Yeast Endoplasmic Reticulum. J. Cell Biol. (1998) 143 (4): 921-933
非专利文献10：Morozkina EV, Marchenko AN, Keruchenko JS, Keruchenko ID, Khotchenkov VP, Popov VO, and Benevolensky SV, Proteinase B disruption is required for high level production of human mechano-growth factor in Saccharomyces cerevisiae. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. (2010) 18 (3): 188-194
非专利文献11：H. Bart van den HAZEL, Morten C. KIELLAND-BRANDT, and Jakob R. WINTHER, Autoactivation of proteinase A initiates activation of yeast vacuolar zymogens. Eur. J. Biochem. (1992) 207:277-283
非专利文献12：Vicki L. Nebes and Elizabeth W. Jones, Activation of the proteinase B precursor of the yeast Saccharomyces cerevisiae by autocatalysis and by an internal sequence. J. Biol. Chem. (1991) 266 (34): 22851-22857
非专利文献13：Susanne O. SORENSEN, H. Bart VAN DEN HAZEL, Morten C. KIELLAND-BRANDT, and Jakob R. WINTHER, pH-dependent processing of yeast procarboxypeptidase Y by proteinase A in vivo and in vitro. Eur. J. Biochem. (1994) 220: 19-27
非专利文献14：Ida J. van der Kleia, Yurimotob H, Sakaib Y, Venhuisa M, The significance of peroxisomes in methanol metabolism in methylotrophic yeast. Biochim. Biophys. Acta. (2006) 1763: 1453-1462
非专利文献15：Yurimoto H, Komeda T, Lim CR, Nakagawa T, Kato N, Sakai Y, Regulation and evaluation of five methanol-inducible promoters in methylotrophic yeast Candida boidinii. Biochim. Biophys. Acta. (2000) 1493 (1-2): 56-63
非专利文献16：Yurimoto H, Hasegawa T, Sakai Y, Kato N, Characterization and High-level production of D-amino acid oxidase in Candida boidinii. Biosci. Biotechnol. Biochem. (2001) 65 (3), 627-633
非专利文献17：Sakai Y, Yoshida H, Yurimoto H, Yoshida N, Fukuya H, Takabe K, Kato N, Production of fungal fructosyl amino acid oxidase useful for diabetic diagnosis in the peroxisome of Candida boidnii. FEBS Lett. (1999) 459, 233-237
非专利文献18：Nishikawa M, Hagishita T, Yurimoto H, Kato N, Sakai Y, Hatanaka T, Primary structure and expression of peroxisomal acetylspermidine oxidase in the methylotrophic yeast Candida boidinii. FEBS Lett. (2000) 476, 150-154。
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的课题在于提供：在酵母等宿主细胞中，高分泌生产蛋白质、特别是S-S键等结构复杂的蛋白质，且安全性高、无需防爆设备的适合于工业生产的生产体系。
用于解决课题的手段
于是，本发明人为了解决上述课题而进行反复深入的研究，结果发现了：通过使用导入有伴侣基因、且编码醇氧化酶的aox1基因被破坏的酵母，即使通过低浓度的甲醇诱导，在aox1启动子的控制下，也可以高分泌生产目标蛋白质。另外，本发明人发现了：蛋白酶B (PRB1)和蛋白酶A (PEP4)等酸性蛋白酶大大参与了在酵母中表达的目标蛋白质的分解，通过将酵母的编码蛋白酶B的prb1基因破坏和/或控制培养基中的pH值以抑制蛋白酶A等酸性蛋白酶的活性，确认了目标蛋白质的分泌生产量大大提高。
将这些组合的蛋白质的高分泌生产体系可使所添加的甲醇量大幅度减少，因此可用作安全性高、适合于工业生产的生产体系。本发明是基于所述的知见而完成的。
即，本发明包含以下的发明。
(1) 转化酵母，该转化酵母导入有伴侣基因、且aox1基因被破坏。
(2) (1)所述的转化酵母，其中，伴侣基因是选自下述的(a)～(d)所示基因的1种或2种以上的组合：
(a) Ogataea minuta (O. minuta)来源的编码PDI1、ERO1、Kar2、MPD1、SCJ1、EUG1、或HSP104的基因；
(b) 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) (S. cerevisia)来源的编码PDI1、MPD1、SCJ1、ERO1、FKB2、JEM1、LHS1、MPD2、ERJ5、或EUG1的基因；
(c) 人来源的编码PDI、ERO1-Lα、ERO1-Lβ、或GRP78的基因；
(d) 对于(a)～(c)中任一项的基因的核苷酸序列(碱基序列)具有95％以上的序列同源性的基因。
(3) (1)所述的转化酵母，其中，伴侣基因是选自下述的(a)～(g)所示基因的1种或2种以上的组合：
(a) O. minuta来源的编码PDI1的基因；
(b) O. minuta来源的编码ERO1的基因；
(c) O. minuta来源的编码Kar2的基因；
(d) S. cerevisiae来源的编码PDI1的基因；
(e) 人来源的编码PDI的基因；
(f) 人来源的编码ERO1的基因；
(g) 对于(a)～(f)中任一项的基因的核苷酸序列具有95％以上的序列同源性的基因。
(4) (1)所述的转化酵母，其中，伴侣基因是下述(a)～(g)中任一项的伴侣基因：
(a) O. minuta来源的编码PDI1的基因、编码ERO1的基因和编码Kar2的基因的组合；
(b) O. minuta来源的编码PDI1的基因和编码Kar2的基因的组合；
(c) 人来源的编码PDI的基因和O. minuta来源的编码ERO1的基因的组合；
(d) O. minuta来源的编码PDI1的基因和编码ERO1的基因的组合；
(e) 人来源的编码PDI的基因、人来源的编码ERO1-Lβ的基因和人来源的编码GRP78的基因的组合；
(f) 人来源的编码PDI的基因、O. minuta来源的编码ERO1的基因和人来源的编码GRP78的基因的组合；
(g) 对于(a)～(f)中任一项的基因的核苷酸序列具有95％以上的序列同源性的基因。
(5) (1)～(4)的任一项中所述的转化酵母，其中，蛋白酶基因被破坏。
(6) (5)所述的转化酵母，其中，蛋白酶基因是prb1基因。
(7) 转化酵母，该转化酵母导入有伴侣基因、且蛋白酶基因被破坏。
(8) (7)所述的转化酵母，其中，蛋白酶基因是prb1基因。
(9) (1)～(8)所述的转化酵母，其中，酵母是甲醇营养型酵母。
(10) (1)～(9)的任一项中所述的转化酵母，其中，该转化酵母导入有编码目标蛋白质的基因。
(11) (1)～(10)的任一项中所述的转化酵母在用于制备目标蛋白质中的应用。
(12) 蛋白质的制备方法，其特征在于，将(10)所述的转化酵母在培养基中培养，从培养物中采取目标蛋白质。
(13) (12)所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，在抑制蛋白酶活性的条件下进行培养。
(14) (12)或(13)所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，在pH值为6.0～7.5的培养基中进行培养。
(15) (12)～(14)的任一项中所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，向培养基中添加氮源。
(16) (12)～(15)的任一项中所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，培养基中的甲醇添加量为2％(v/v)以下。
(17) 通过(12)～(16)的任一项中所述的方法制备的目标蛋白质。
(18) 转化酵母的制备方法，该制备方法包含以下的(i)的工序、和(ii)或(iii)的至少1个工序：
(i) 对于酵母，导入伴侣基因的工序；
(ii) 对于酵母，破坏aox1基因的工序；
(iii) 对于酵母，破坏prb1基因的工序。
(19) (18)所述的制备方法，其中，进一步包含导入编码目标蛋白质的基因的工序。
发明效果
根据本发明，通过进行了伴侣基因的导入、aox1基因的破坏和/或蛋白酶基因的破坏的转化酵母，能够以正确折叠的形态在酵母内高分泌生产不仅通常的蛋白质而且具有S-S键等的结构复杂的蛋白质。而且，通过将上述转化酵母在抑制蛋白酶活性的条件下进行培养，使长期培养(大量生产)成为可能。在本发明的使用转化酵母的蛋白质生产体系中，由于可使所使用的甲醇量大幅度减少，因此可用作安全性高、适合于工业生产(大量生产)的蛋白质生产体系。
本申请要求2014年7月30日申请的日本国专利申请2014-155272号的优先权，包含该专利申请的说明书中所记载的内容。
附图说明
图1：是显示ura3基因破坏株的制作方法的图。
图2：是显示aox1基因破坏株的制作方法的图。
图3：是显示伴侣基因表达载体的结构的图(onaP11007：OmPDI1+OmERO1+OmKar2表达载体)。
图4：是显示prb1基因间断(分断)株的制作方法的图。
图5：是显示kex2表达质粒的制作方法的图(kex2表达质粒：pOMEA-Z1-KEX2、kex2表达盒)。
图6-1：是显示通过甲醇诱导的KEX2蛋白质的分泌生产量的比较的图(1：导入有伴侣(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)的NBRC10746株(NBRC10746+PEK株来源的KEX2产生株)、2：导入有伴侣(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)的aox1基因破坏株(Δaox1+PEK株来源的KEX2产生株)、3：导入有伴侣(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)的prb1基因间断株(NBRC10746+PEK dprb1株来源的KEX2产生株)、4：将prb1基因进行间断同时导入有伴侣(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)的aox1基因破坏株(Δaox1+PEK dprb1株来源的KEX2产生株))。
图6-2：是比较KEX2蛋白质的酶活性的图(1：导入有伴侣(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)的NBRC10746株(NBRC10746+PEK株来源的KEX2产生株)、2：导入有伴侣(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)的aox1基因破坏株(Δaox1+PEK株来源的KEX2产生株)、3：导入有伴侣(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)的prb1基因间断株(NBRC10746+PEK dprb1株来源的KEX2产生株)、4：将prb1基因进行间断同时导入有伴侣(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)的aox1基因破坏株(Δaox1+PEK dprb1株来源的KEX2产生株)、白色棒：第3四分位数-中央值、黑色棒：中央值-第1四分位数)。
图7：是显示hsa表达质粒的制作方法的图(hsa表达质粒：pOMEA-Z1-HSA、hsa基因表达盒)。
图8：是显示通过甲醇诱导的HSA蛋白质的分泌生产量(deep well plate scale，深孔板规模)的图(1：导入有伴侣(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)的NBRC10746株(NBRC10746+PEK株来源的HSA产生株)、2：导入有伴侣(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)的aox1基因破坏株(Δaox1+PEK株来源的HSA产生株)、3：导入有伴侣(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)的prb1基因间断株(NBRC10746+PEK dprb1株来源的HSA产生株)、4：将prb1基因进行间断同时导入有伴侣(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)的aox1基因破坏株(Δaox1+PEK dprb1株来源的HSA产生株))。
图9：是显示通过甲醇诱导培养的HSA蛋白质的分泌生产量(3L Jar scale)的图[Jar1：导入有伴侣(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)的NBRC10746株(NBRC10746+PEK株来源的HSA产生株)、Jar2：导入有伴侣(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)的NBRC10746株(NBRC10746+PEK株来源的HSA产生株) (氮源流加培养、pH7控制)、Jar3：将prb1基因进行间断同时导入有伴侣(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)的aox1基因破坏株(Δaox1+PEK dprb1株来源的HSA产生株) (氮源流加培养、pH7控制)]。
图10：是显示通过碳源饥饿诱导培养的HSA蛋白质的分泌生产量(3L Jar scale)的图[Jar1：将prb1基因进行间断同时导入有伴侣(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)的aox1基因破坏株(Δaox1+PEK dprb1株来源的HSA产生株) (低甲醇诱导培养)、Jar2：将prb1基因进行间断同时导入有伴侣(OmPDI1/OmERO1/OmKar2)的aox1基因破坏株(Δaox1+PEK dprb1株来源的HSA产生株) (碳源的饥饿诱导培养)]。
具体实施方式
1. 转化酵母
本发明的转化酵母是进行了伴侣基因的导入、aox1基因的破坏和/或蛋白酶基因的破坏的转化酵母。即，本发明的转化酵母包含：导入有伴侣基因、且aox1基因被破坏的转化酵母；导入有伴侣基因、且蛋白酶基因被破坏的转化酵母；或导入有伴侣基因、且aox1基因和蛋白酶基因被破坏的转化酵母。
(宿主细胞)
作为转化的宿主细胞，优选为酵母。作为酵母，可以举出：Ogataea minuta、Pichia lindneri、巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenulla polymorpha) (安格斯毕赤酵母(Pichia angusta))、伊丁假丝酵母(Candida boidinii)等甲醇营养型酵母株；或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、Yarowia lipolytica、粟酒裂殖酵母(Shizosaccharomyces pombe)等酵母株，但优选为甲醇营养型酵母株。更具体而言，作为Ogataea minuta株可以使用Ogataea minutaYK3株(Δoch1Δpep4Δprb1Δyps1Δura3Δade1)、作为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)可以使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) BY4741株(MATa Δhis3Δleu2Δmet15Δura3)等，但不限于这些。
(伴侣基因的导入)
作为用于本发明的伴侣基因，例如可以举出：Ogataea minuta (O. minuta)来源的编码PDI1 [SEQ ID NO: 35 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 36 (氨基酸序列)]、ERO1 [SEQ ID NO: 43(核苷酸序列)、SEQ ID NO: 44 (氨基酸序列)]、Kar2 [SEQ ID NO: 47 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 48 (氨基酸序列)]、MPD1 [SEQ ID NO: 37 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 38 (氨基酸序列)]、SCJ1 [SEQ ID NO: 39 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 40 (氨基酸序列)]、EUG1 [SEQ ID NO: 41 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 42 (氨基酸序列)]、HSP104 [SEQ ID NO: 45 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 46 (氨基酸序列)]的基因等。
另外，用于本发明的伴侣基因可以是其他酵母、霉、人等其他生物种来源的伴侣基因。
作为其他酵母来源的伴侣基因，例如可以使用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的伴侣基因，具体而言，可以举出：编码PDI1 [Primary (初级) SGDID：S000000548；SEQ ID NO: 49 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 50 (氨基酸序列)]、MPD1 [Primary SGDID：S000005814；SEQ ID NO: 51 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 52 (氨基酸序列)]、SCJ1 [Primary SGDID：S000004827；SEQ ID NO: 53 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 54 (氨基酸序列)]、ERO1 [Primary SGDID：S000004599；SEQ ID NO: 55 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 56 (氨基酸序列)]、FKB2 [Primary SGDID：S000002927；SEQ ID NO: 57 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 58 (氨基酸序列)]、JEM1 [Primary SGDID：S000003609；SEQ ID NO: 59 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 60 (氨基酸序列)]、LHS1 [Primary SGDID：S000001556；SEQ ID NO: 61 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 62 (氨基酸序列)]、MPD2 [Primary SGDID：S000005448；SEQ ID NO: 63 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 64 (氨基酸序列)]、ERJ5 [Primary SGDID：S000001937；SEQ ID NO: 65 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 66 (氨基酸序列)]、EUG1 [Primary SGDID：S000002926；SEQ ID NO: 67 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 68 (氨基酸序列)]的基因等。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的上述基因的序列信息可以从SGD (酵母基因组数据库(Saccharomyces genome database)：http://www.yeastgenome.org/)中获取。
另外，作为人来源的伴侣基因，可以举出：编码PDI [GenBank检索号：BC010859；SEQ ID NO: 69 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 70 (氨基酸序列)]、ERO1-Lα [GenBank检索号：AF081886；SEQ ID NO: 71 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 72 (氨基酸序列)]、ERO1-Lβ[GenBank检索号：BC044573；SEQ ID NO: 73 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 74 (氨基酸序列)]、GRP78 [GenBank检索号：AL354710；SEQ ID NO: 75 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 76 (氨基酸序列)]的基因等。
用于本发明的伴侣基因只要保持促进外来蛋白质分泌的活性，可以是编码由在上述的各氨基酸序列中1或数个的氨基酸被缺失、取代、和/或添加而得的氨基酸序列构成的蛋白质的基因。在此，作为可被缺失、取代、和/或添加的氨基酸的数目，优选为1个～数个。“数个”的数目没有特别限定，例如，是指50个以下、40个以下、30个以下、25个以下、20个以下、15个以下、12个以下、10个以下、9个以下、8个以下、7个以下、6个以下、5个以下、4个以下、3个以下、2个。另外，在此言及的“变异”主要是指利用公知的变异蛋白质制作方法人工导入而得的变异，但可以是存在于天然的同样变异。需要说明的是，本说明书中“外来蛋白质”和“目标蛋白质”以相同含义使用。
另外，用于本发明的伴侣基因由对于上述的各氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列构成、且可以是编码具有外来蛋白质分泌促进活性的蛋白质的基因。具体而言，可以举出：由对于SEQ ID NO: 35、37、39、41、43、45、47、49、51、53，55，57，59、61、63、65、67、69、71、73、75所示的核苷酸序列具有80%以上的序列同源性的核苷酸序列构成、且编码具有外来蛋白质分泌促进活性的蛋白质的基因；或者，由对于SEQ ID NO: 36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76所示的氨基酸序列具有80%以上的序列同源性的氨基酸序列构成、且编码具有外来蛋白质分泌促进活性的蛋白质的基因。上述80％以上的序列同源性是指，优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、最优选99％以上的序列同源性。就蛋白质的同源性检索而言，例如，可以以日本DNA数据库(DNA Databank of JAPAN (DDBJ)等为对象，使用FASTA、BLAST等程序来进行。
用于本发明的伴侣基因可以是下述的基因：与和由上述的各核苷酸序列构成的DNA互补的核苷酸序列构成的DNA在严格的条件下杂交、且编码具有外来蛋白质分泌促进活性的蛋白质的基因。在此，严格的条件是指，使所谓的特异性的杂种(hybrid)形成、非特异性的杂种不形成的条件。例如可以举出：与序列同源性高的核酸、即与上述的各核苷酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、进一步优选95％以上、最优选99％以上的序列同源性的核苷酸序列构成的核酸的互补链杂交，与低于该序列同源性的核苷酸序列构成的核酸的互补链不杂交的条件。更具体而言，是指，钠盐浓度为15～750mM、优选为50～750mM、更优选为300～750mM，温度为25～70℃、优选为50～70℃、更优选为55～65℃，甲酰胺浓度为0～50％、优选为20～50％、更优选为35～45％的条件。并且，在严格的条件下，杂交后的滤器(滤纸)的洗涤条件通常是，钠盐浓度为15～600mM、优选为50～600mM、更优选为300～600mM，温度为50～70℃、优选为55～70℃、更优选为60～65℃。
本领域技术人员通过参照Molecular Cloning (分子克隆) (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning :a Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, NY (1989))等，可以容易地获取这种同系物基因(同源基因)。另外，上述的核苷酸序列的序列同源性同样地可以通过FASTA检索、BLAST检索确定。
上述氨基酸的变异(缺失、取代、和/或添加)的导入可以通过利用Kunkel法或Gapped duplex法等的该技术领域中公知的方法、或基于该公知方法的方法来进行，例如可以利用：利用了位点特异性诱变法的变异导入用试剂盒(例如Mutant-K (Takara Bio公司制造)或Mutant-G (Takara Bio公司制造)、Takara Bio公司的LA PCR in vitro Mutagenesis 系列试剂盒等。
另外，这些其它的生物种来源的伴侣基因可以是通过将其核苷酸序列在所用的宿主中取代成使用频率高的密码子以提高翻译效率而修饰的密码子修饰型基因。具体而言，可以举出：人来源的编码PDI的基因的密码子修饰型基因。具有修饰的核苷酸序列的DNA可以进行人工合成，但长DNA的情形，还可以预先分别合成几个片段、最终将这些片段连接来进行合成。
本发明中，将上述伴侣基因的1种或2种以上组合使用。组合2种以上时，可以是相同生物种来源的基因，也可以是不同生物种来源的基因。
作为本发明中使用的上述的伴侣基因的优选例子，可以举出：O. minuta来源的pdi1基因；O. minuta来源的ero1基因；O. minuta来源的kar2基因；S. cerevisiae来源的pdi1基因；人来源的pdi基因；人来源的ero1基因；或者由对于上述各伴侣的氨基酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90%以上、进一步优选95％以上、最优选99％以上的序列同源性的氨基酸序列构成、且编码具有外来蛋白质分泌促进活性的蛋白质的基因。
另外，作为本发明中使用的上述伴侣基因的更优选例子，可以举出：O. minuta来源的pdi1基因与ero1基因与kar2基因的组合；O. minuta来源的pdi1基因与ero1基因的组合；O. minuta来源的pdi1基因与kar2基因的组合；人来源的pdi基因与O. minuta来源的ero1基因的组合；人来源的pdi基因与ero1-Lβ基因与grp78基因的组合；人来源的pdi基因与O. minuta来源的ero1基因与人来源的grp78基因的组合；或者由对于上述各伴侣的组合的各氨基酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90%以上、进一步优选95％以上、最优选99％以上的序列同源性的氨基酸序列构成、且编码具有外来蛋白质分泌促进活性的蛋白质的基因的组合。
另外，作为本发明中使用的上述伴侣基因的最优选例子，可以举出：O. minuta来源的pdi1基因与ero1基因与kar2基因的组合；或者由对于PDI1与ERO1与Kar2的组合的各氨基酸序列具有80％以上的序列同源性的氨基酸序列构成、且编码具有外来蛋白质分泌促进活性的蛋白质的基因的组合(例如，由与SEQ ID NO: 35、43、47所示核苷酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90%以上、进一步优选95％以上、最优选99％以上的序列同源性的核苷酸序列构成、且编码具有外来蛋白质分泌促进活性的蛋白质的基因的组合；或者由对于SEQ ID NO: 36、44、48所示氨基酸序列具有80%以上、优选85％以上、更优选90%以上、进一步优选95％以上、最优选99％以上的序列同源性的氨基酸序列构成、且编码具有外来蛋白质分泌促进活性的蛋白质的基因的组合)。需要说明的是，关于本说明书中的基因标识，例如“编码PDI1的基因”与“pdi1基因”以相同含义使用。
上述的伴侣基因使用表达载体导入作为宿主细胞的酵母中。本发明中，作为表达载体导入酵母中的方法，只要是可使导入基因在酵母宿主内稳定地存在、且适宜表达的方法即可，可以是任何的方法，关于通常使用的方法，例如可以举出：磷酸钙法(Ito et al., (1984) Agric. Biol. Chem., 48, 341)、电穿孔法(Becker, D.M. et al. (1990) Methods. Enzymol., 194, 182-187)、原生质球法(Creggh et al., Mol. Cell. Biol., 5, 3376 (1985))、乙酸锂法(Itoh, H. (1983) J. Bacteriol. 153, 163-168)、脂质转染法等。
(aox1基因的破坏和/或蛋白酶基因的破坏)
本发明的转化酵母除了上述伴侣基因的导入之外，还将宿主基因组中存在的内源性的aox1基因破坏、或将宿主基因组中存在的内源性的蛋白酶基因破坏、或将宿主基因组中存在的内源性的aox1基因和蛋白酶基因的二者破坏。
作为aox1基因，例如可以举出：O. minuta的编码AOX1 [SEQ ID NO: 27 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 28 (氨基酸序列)]的基因、巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)的编码AOX1的基因(GenBank检索号：U96967)、或伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的编码AOX1 的基因(GenBank检索号：Q00922)等，但只要是酵母来源的编码AOX1的基因即可，不限于此。
作为蛋白酶基因，可以举出：O. minuta的prb1 [SEQ ID NO: 31 (核苷酸序列)、SEQ ID NO: 32 (氨基酸序列)]基因、或pep4基因(GenBank检索号：AB236164)；伊丁假丝酵母(Candida boidinii)的prb1基因(GenBank检索号：AB060541)或pep4基因(特开2000-078978)；巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)的prb1基因或pep4基因；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的prb1基因(GenBank检索号：M18097)；或乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)的prb1基因(GenBank检索号：A75534)等，但只要是酵母来源的蛋白酶基因即可，不限于此。
因此，本发明的转化酵母优选：除了上述伴侣基因的导入之外，还将宿主基因组中存在的内源性的aox1基因破坏、或者将宿主基因组中存在的内源性的prb1基因破坏。更优选：除了上述伴侣基因的导入之外，还将宿主基因组中存在的内源性的aox1基因和prb1基因的二者破坏。最优选：除了上述伴侣基因(O. minuta来源的pdi1基因与ero1基因与kar2基因的组合；或者由对于上述PDI1与ERO1与Kar2的组合的各氨基酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90%以上、进一步优选95％以上、最优选99％以上的序列同源性的氨基酸序列构成、且编码具有外来蛋白质分泌促进活性的蛋白质的基因)的导入之外，还将宿主基因组中存在的内源性的aox1基因和prb1基因的二者破坏。
本发明中，“基因的破坏”是指，除了靶基因的全部或一部从染色体上缺失“基因的缺失”、靶基因的取代之外，还包含由于靶基因的间断、由靶基因所编码的功能性蛋白质的表达得到抑制、但作为基因未被去除的“基因的间断”。或者，在靶基因的功能破坏方面，基因的破坏可以是用于引起功能缺失的基因突变、基因的表达抑制。只要由靶基因所编码的蛋白质的表达、功能得到抑制或缺失即可，没有特别限制。
关于靶基因的破坏，代表性的是可以通过同源重组法来进行。首先，制作使靶基因间断或部分缺失、在其上插入适当的选择标记基因、在靶基因的上游部和下游部之间夹入选择标记而得的DNA结构体。其次，通过将该结构体导入酵母中，在导入片段(夹入选择标记而得的DNA结构体)的两端和染色体上的靶基因的相同部分之间引起2次重组，染色体上的靶基因被导入片段取代。此时，用于基因破坏的选择标记可以使用后述所示的营养缺陷型标记(栄養要求性マーカー，auxotrophic marker)、药物抗性标记。
以使用ura3基因作为选择标记的情形为例进行具体地说明。构建在结构基因的前后带有重复结构的具有ura3基因的质粒，用限制酶切出该基因盒，插入到质粒上的靶基因中，构建破坏了的等位基因。使用该质粒取代染色体的靶基因获得基因破坏株。由于插入到染色体的ura3基因的前后具有重复结构，因此通过在重复序列间的同源重组而使ura3基因从染色体上脱落。该脱落株的选择可以利用5-氟乳清酸(5-FOA)来进行。ura3变异株对5-FOA具有抗性(Boeke et al., mol. Gen. Genet., 197, 345-346 (1984)；Boeke et al., Methods Enzymol., 154, 165-174 (1987))，具有URA＋表现型的细胞株在5-FOA培养基中无法生长。因此，在加入了5-FOA的培养基中，如果将具有抗性性状的株分离，再次使用ura3基因标记的操作是可能的。为了破坏1个基因，通常需要1个选择标记，但利用ura3基因时，可以有效再生ura3性状。
另外，向用于引起功能缺失的基因中导入突变，例如可以使用位点特异性诱变法等的变异导入法进行修饰来实施。具体而言，用于引起位点功能缺失的基因的突变是指，例如通过对ORF进行核苷酸插入或缺失变异引起移码、活性中心的氨基酸取代等的结果，使该基因变异成编码丧失活性的蛋白质的突变。另外，基因的表达抑制是指，其基因的表达量减少或不能表达。作为抑制基因表达的方法，例如可以举出：利用反义RNA、RNAi的方法，使启动子弱化的方法等。
(表达载体)
上述伴侣基因向酵母中的导入使用表达载体。作为该表达载体，可以举出：包含上述的伴侣基因的1种的载体、包含2以上拷贝数的上述的伴侣基因的1种的载体、或包含上述的伴侣基因的2种以上的组合的载体。为了使伴侣基因在酵母内表达，可以分别使用单独包含各基因的载体进行转化，另外，可以使用包含多个基因的一个载体进行转化。另外，在同表达载体中可以包含编码以高表达分泌为目的的外来蛋白质的基因。或者，可以另外调制包含编码外来蛋白质的基因的表达载体，另外调制时，将各载体共转染(共导入)到酵母中。
作为编码外来蛋白质的基因，没有特别限定，可以举出：溶菌酶基因、α-淀粉酶基因、α-半乳糖苷酶基因等各种酶基因，特别是促红细胞生成素(EPO)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)等药物上有用的糖蛋白质生产所需的糖基转移酶基因；以及作为药物上有用的生理活性蛋白质的干扰素α、干扰素γ等各种干扰素基因；IL1、IL2等各种白介素基因；促红细胞生成素(EPO)基因、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)基因等各种细胞因子基因；生长因子基因；流感等各种疫苗抗原等。这些基因可以是通过任意方法获得的基因。
本发明特别是对于疏水性高的蛋白质、由于形成复合物而难以分泌生产的蛋白质有效，因此，上述的外来蛋白质中包含多聚体蛋白质、例如作为抗体或其功能片段的异源多聚体。
伴侣基因和编码外来蛋白质的基因可以适宜添加表达控制区以蛋白质表达单元的形式构建表达载体。蛋白质表达单元在转录的读框方向上至少具有启动子区、上述基因、转录终止子区。作为在此可使用的启动子，可以是诱导表达启动子、恒定启动子。作为诱导表达启动子，例如可以举出：参与甲醇营养型酵母中的甲醇代谢的编码醇氧化酶(AOX)的基因的启动子、编码二羟基丙酮合酶(DAS)的基因的启动子、编码甲酸脱氢酶(FDH)的基因的启动子等。另外，作为其它诱导启动子，还可以使用铜诱导(cup)启动子等。作为恒定表达启动子，例如可以举出：编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(TDH、GAP)、磷酸甘油激酶(PGK)、磷酸丙糖异构酶(TPI)、烯醇化酶(ENO)、肌动蛋白(ACT)、细胞色素c (CYC)、海藻糖合成酶(TPS)、醇脱氢酶(ADH)等的基因的启动子等。另外，转录终止子只要是对于来自启动子的转录具有引起转录结束的活性的序列即可，可以是与启动子的基因相同或不同的基因。
另外，表达载体中，可以添加编码分泌信号序列的DNA，所述分泌信号序列在酵母细胞中对编码外来蛋白质的基因发挥作用，由此可使分泌产生成为可能，且可以容易地分离纯化所期望的外来蛋白质。作为分泌信号序列，可以举出：S. cerevisiae来源的α-交配因子(αMF)的分泌信号序列、S. cerevisiae来源的转化酶(SUC2)的分泌信号序列、人来源的α-半乳糖苷酶的分泌信号序列等。
另外，表达载体中，可以包含用于选择转化体的选择标记。例如，在酵母用表达载体中，可以使用选自his1、his2、his3、his4、his5、his6、leu2、arg1、arg2、arg3、trp1、lys2、ade1、ade2、ura3、ura5基因等的营养缺陷型标记基因。
另外，作为选择标记，不仅通过使用上述的营养缺陷型标记，而且通过使用对于浅蓝菌素、金担子素、Zeocin、刀豆氨酸、环己酰亚胺、潮霉素、杀稻瘟素、四环素、卡那霉素、氨苄青霉素、四环素、新霉素等药物赋予抗性的药物抗性标记等，也可以进行转化体的选择。另外，通过将对乙醇等赋予溶剂抗性、对丙三醇或盐等赋予渗透压抗性、对铜等赋予金属离子抗性等的基因进行标记，也可进行转化体的选择。
2. 蛋白质的制备方法
本发明中的蛋白质的制备可如下进行：将1.的转化酵母利用公知方法进行培养，从其培养物中采取，再进行纯化。“培养物”是指，除了培养上清之外，还指培养细胞、培养菌体、或者细胞或菌体的破碎物的任一种。
宿主细胞为酵母时，作为待培养的培养基，只要是包含可营养酵母的碳源、氮源、无机盐类等且可有效进行酵母转化体的培养的培养基即可，可使用天然培养基、合成培养基的任一种。作为碳源，可以使用葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉等碳水化合物；乙酸、乳酸、枸橼酸、丙酸等有机酸；甲醇、乙醇、丙醇、丙三醇等醇类。作为氮源，可以使用：氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵、磷酸铵、碳酸铵等无机酸或有机酸的铵盐；尿素等其它含氮化合物；氨基酸类、酵母提取物、蛋白胨、肉提取物(肉汁)、玉米浆、酪蛋白水解物、大豆粕和大豆粕水解物等氮性有机物质等。作为无机盐类，可以使用：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、碳酸钙等。另外，宿主细胞为显示营养缺陷型的酵母时，可以向培养基中添加其生长所必需的营养物质。作为该营养物质，可以举出：氨基酸类、维生素类、核酸类、盐类等。另外，在培养基中，根据选择标记的种类，可以适宜添加金担子素、氨苄青霉素、四环素等抗生素，或者可以去除通过求补营养缺陷型的基因(leu、ura、trp等)而能够供给的氨基酸。
另外，培养用使用诱导性启动子作为启动子的表达载体转化而得的酵母时，根据需要可以向培养基中添加诱导物。例如，培养用使用甲醇诱导性启动子(aox、das、mox等)的表达载体转化而得的酵母时，向培养基中添加甲醇，培养用使用GAL启动子的表达载体转化而得的酵母时，向培养基中添加半乳糖。
另外，关于上述培养，为了抑制在酵母中特有的O型糖链添加，可以向培养基中添加PMT活性抑制剂。作为PMT活性抑制剂，例如可以举出：罗丹宁-3-乙酸衍生物(5-[[3,4-(1-苯基甲氧基)苯基]亚甲基]-4-氧代-2-硫氧代-3-噻唑烷乙酸(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 14, 3975页, (2004)中的化合物(1c))或{(5Z)-4-氧代-5-[3-(1-苯基乙氧基)-4-(2-苯基乙氧基)亚苄基]-2-硫氧代-1,3-噻唑烷-3-基}乙酸(Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 14, 3975页, (2004)中的化合物(5a))。
培养在20～30℃左右下进行24小时～1000小时左右。培养可以通过静止、振荡、搅拌、通气下的批次培养或连续培养等进行实施。
本发明的转化酵母为用使用甲醇诱导性启动子的表达载体转化而得的酵母时，其培养在添加有甲醇的培养基中进行。关于向培养基中添加甲醇，只要监测酵母的增殖同时使用泵等进行即可，可连续地或间断地进行，但没有必要在培养的整个期间进行。例如，培养转化酵母(aox1基因破坏株)时，在含有优选0.3～2％(v/v)、更优选0.5～1％(v/v)的甲醇的培养基中开始甲醇诱导培养，每天在甲醇浓度降低至0.2～0.3％(v/v)左右的时间点，只要可间断流加优选最终浓度0.1～0.5％(v/v)、更优选最终浓度0.2～0.4％(v/v)的甲醇即可。
另外，关于上述的转化酵母，即使在增殖所利用的培养基中的碳源耗尽而处于饥饿状态下，也可以使甲醇诱导性启动子强有力地活化。因此，在碳源耗尽后通过适当调节培养基中的碳源浓度，可以无需添加甲醇，或者可在0.2％(v/v)以下的低甲醇浓度下进行培养。在此言及的“碳源”可以举出：甘油、丙氨酸、甘露糖醇、山梨糖醇、海藻糖、乳糖等，“将培养基中的碳源浓度适当地调节”是指，以本发明的转化酵母的生长和蛋白质表达的必需最小浓度向培养基中添加上述的碳源。即，可在达到目标菌体密度的同时在碳源耗尽条件(碳源饥饿条件)下进行培养。例如，培养转化酵母(aox基因破坏株)时，在达到目标菌体密度、且确认碳源耗尽的同时，可优选每天0.5～6％(w/v)、更优选每天1～4％(w/v)连续流加甘油和山梨糖醇。
另外，上述的培养优选在抑制蛋白酶活性的条件下进行。通过在抑制蛋白酶活性的条件下进行，可以抑制通过酵母分泌生产的目标蛋白质的分解，大大提高其分泌生产量。关于蛋白酶活性的抑制，虽然通过破坏上述的酵母的蛋白酶B基因可以实现，但通过控制培养基的pH值也可以进行。从抑制培养基中的蛋白酶A等酸性蛋白酶的活性、且对酵母的生长不产生影响的角度考虑，培养基的pH值优选pH6.0～7.5。pH值的调节使用无机酸或有机酸、碱溶液等来进行。
并且，上述的培养优选在连续流加氮源的条件下进行。通过进行经时培养中的氮源的补充，使蛋白质分泌生产性及其维持大幅度提高。关于每天的氮源流加最终浓度，酵母提取物(Yeast extract)优选0.1%～0.75%(w/v)、L-组氨酸盐酸盐一水合物优选0.05%～0.15%(w/v)，酵母提取物更优选0.3%～0.5%(w/v)、L-组氨酸盐酸盐一水合物更优选0.1%～0.13%(w/v)。氮源的流加可以使用酵母提取物、L-组氨酸盐酸盐一水合物的混合液。
作为本发明的转化酵母的一个方案，通过将导入有伴侣基因、且aox1基因和蛋白酶基因得到破坏的转化酵母在上述pH值范围的培养基中添加氮源进行培养，将其与仅导入伴侣基因的转化酵母进行比较，就甲醇添加量而言，可以使甲醇添加量降低至4～7％。
培养后，从上述培养物(培养液、培养细胞)中确认外来蛋白质基因的表达产物，可以通过SDS-PAGE、蛋白印迹分析、ELISA等进行。只要使用通常的蛋白质的分离、纯化法即可分离纯化已生产的蛋白质。培养后，目标蛋白质生产到细胞内时，通过超音波破碎机、法式滤压壶、Manton-Gaulin高压匀浆机、Dyno-mill等破碎细胞，采取目标蛋白质。另外，目标蛋白质生产到细胞外时，将培养液直接使用或者通过离心分离等去除细胞。然后，通过基于有机溶剂的提取等，采取目标蛋白质，根据需要可以将各种色谱(疏水性色谱、反相色谱、亲和色谱法、离子交换色谱等)、使用分子筛的凝胶过滤法、使用聚丙烯酰胺凝胶等的电泳法等的方法单独或组合使用来进行分离纯化。
上述的培养法、纯化法是一个例子，并不限于这些。需要说明的是，已纯化的基因产物所具有的氨基酸序列的确认，可以通过公知的氨基酸分析例如基于Edman分解法的自动氨基酸序列确定法等来进行。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行具体地说明。其中，这些实施例不受本发明的技术范围的任何限定。本发明的实施例中所使用的质粒、限制酶、DNA修饰酶等是市售的制品，可以按照常规方法进行使用。另外，关于用于DNA克隆、核苷酸序列的确定、酵母的转化、转化酵母的培养等的操作，也是本领域技术人员周知的操作，可以从文献中获知该操作。
[实施例1] 外来基因表达载体的构建
(1) 由以Zeocin抗性基因为选择标记的NBRC10746 (O. minuta, (Biological Resource Center, NITE)) aox1基因启动子和终止子盒(cassette)构成的外来基因导入用载体的构建
NBRC10746的AOX1 (GENBANK检索号：AB242209)由1992bp的核苷酸序列(碱基序列)所编码的663个氨基酸构成(SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28)。将通过Y-DER Yeast DNA Extraction Reagent (Y-DER酵母DNA 提取试剂) (PIERCE公司、78870)调制的NBRC10746的基因组DNA作为模板、利用引物Hd AOXp Fw (5’-GCAAGCTTTCTTTCGCAAACAGCTCTTTG-3’: SEQ ID NO: 1)和引物AOXp rv (5’-GAACCCGGGAACAGAATCTAGATTTTTTCGTAAGTCGTAAG-3’：SEQ ID NO: 2)的PCR [(98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下15秒)×30循环]、使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(Takara Bio公司、RO45A)进行，扩增了包含约2.4kbp的aox1启动子区和22bp的间隔区的aox1启动子区含有DNA片段。另外，进行将NBRC10746的DNA作为模板、利用引物AOXt fw (5’-CTGTTCCCGGGTTCCTGGATCCGAGACGGTGCCCGACTC-3’: SEQ ID NO: 3)和引物Kp AOXt Rv (5’-GCGGTACCGTTAGTGGTACGGGCAG-3’: SEQ ID NO: 4)的PCR [(98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下5秒)×30循环]，扩增了包含约0.8kbp的aox1终止子区和22bp的间隔区的aox1终止子区含有DNA片段。进行将这些DNA片段作为模板、利用引物Hd AOXp Fw和引物Kp AOXt Rv的PCR [(98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下15秒)×30循环]，连接扩增了约2.4kbp的aox1启动子区和约0.8kbp的终止子区。对于已连接的DNA片段，琼脂糖电泳后进行回收，将其克隆到pCR-Blunt II-TOPO中。将已克隆的质粒用限制酶HindIII和限制酶KpnI双重消化，获得了包含aox1基因启动子和终止子盒的DNA片段。
将WO2009/057813中记载的质粒pOMexGP1Z (基于以Zeocin抗性基因为选择标记的gap基因启动子和终止子的外来基因表达载体)用限制酶HindIII和限制酶KpnI双重消化，获得了包含Zeocin抗性基因标记的DNA片段。向所得片段中导入上述包含aox1基因启动子和终止子盒的DNA片段，获得了质粒pOMEA-Z1。
[实施例2] ura3基因破坏株的制作
(1) ura3基因破坏用DNA片段的制作
将利用了ura3 ORF的启动子和终止子的DNA片段的基因破坏模式示于图1。NBRC10746的URA3 (GENBANK检索号：AB242207)由798bp的核苷酸序列所编码的265个氨基酸序列构成(SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30)。将通过Y-DER Yeast DNA Extraction Reagent (PIERCE公司、78870)调制的NBRC10746的基因组DNA作为模板、利用引物dURA Fw (5’-GGTACCAGTACTGGAAA-3’: SEQ ID NO: 5)和引物dURA rv (5’-CAGATAAACAGGCGACT TTTCGGGTCACGTGACT-3’: SEQ ID NO: 6)的PCR [(98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下5秒)×30循环]使用PrimeSTAR Max DNA聚合酶(Takara Bio公司、RO45A)进行，扩增了包含约0.5kbp的ura3终止子区和17bp的ura3启动子区的ura3终止子区含有DNA片段。另外，进行将NBRC10746的DNA作为模板、利用引物dURA fw (5’-AGTCACGTGACCCGAAA AGTCGCCTGTTTATCTG-3’: SEQ ID NO: 7)和引物dURA Rv (5’-CCAAGGAGGAAGAAATT-3’: SEQ ID NO: 8)的PCR [(98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下5秒)×30循环]，扩增了包含约1.2kbp的ura3启动子区和17bp的ura3终止子区的ura3启动子区含有DNA片段。进行将这些DNA片段作为模板、利用引物dURA Fw和引物dURA Rv的PCR [(98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下5秒)×30循环]，连接扩增了约1.2kbp的ura3启动子区和约0.5kbp的终止子区。对于已连接的DNA片段，琼脂糖电泳后进行回收，将其作为ura3基因破坏用片段。
(2) ura3基因破坏株的制作
通过电穿孔法将ura3基因破坏片段导入到NBRC10746株中。向5ml的YPD培养基中进行植菌，在28℃下培养12～14小时使达到对数增殖期(OD600=0.5～4左右)。通过1400×g、5分钟的离心分离进行集菌，将菌体用10ml冰冷的灭菌水洗涤1次、接着用4ml冰冷的灭菌水洗涤1次。将菌体悬浮于2ml的LC缓冲液(100mM LiCl、50mM磷酸钾缓冲液pH7.5)中，在28℃下振荡45分钟后，添加0.05ml的1M DTT，进一步振荡了15分钟。通过1400×g、5分钟的离心分离进行集菌后，用8ml冰冷的 STM缓冲液(270mM蔗糖，10mM Tris-HCl缓冲液pH7.5、1mM MgCl2)洗涤后，进一步用1ml的STM缓冲液洗涤，悬浮于0.05ml冰冷的STM缓冲液中。基于电脉冲的转化实验使用BTX公司的ELECTRO CELL MANIPULATOR ECM 600来进行。将0.05ml菌体悬浮液和0.005ml (3μg) ura3基因破坏片段DNA试样混合后，加入到0.2cm一次性比色皿中，施加了适当条件(电压1.5kV、100-200Ω)的电脉冲。脉冲后迅速加入1ml冰冷的包含1M山梨糖醇的YPD培养基，在28℃下振荡培养了4～6小时。培养后，将菌体涂抹于包含适当量抗生素的YPD选择培养基上之后，将平板在28℃下培养，获得了转化菌落。电穿孔后，涂抹于包含最终浓度0.1%(w/v)的5-FOA (5-Fluoroorotic acid)的YPAD琼脂培养基[酵母提取物10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖20g/l、腺嘌呤-HCl 40mg/l、琼脂20g/l]上，在28℃下增殖了约3天。使已增殖的转化体再次在包含最终浓度0.1%(w/v)的5-FOA (5-Fluoroorotic acid)的YPAD琼脂培养基上进行了增殖。URA3基因得到破坏的转化体通过菌落PCR法进行了选择。将在包含最终浓度0.1%(w/v)的5-FOA的YPAD琼脂培养基上增殖的酵母的一部分悬浮于10μL的0.25%SDS溶液中，加入90μL的灭菌水之后，通过离心分离(3,100×g、4℃、5分钟)去除了菌体。将所得上清作为DNA溶液使用设计于ura3启动子上游序列的引物dURA check -1.5kbp (5’-ATCACAGGAAAGCGCAT-3’：SEQ ID NO: 9)和设计于ura3终止子下游序列的引物dURA check +1kbp (5’-ATTCGAGCATCGCCGTG-3’：SEQ ID NO: 10)，将确认到不具有ura3编码区的约2.7kbp扩增的株作为ura3基因破坏株(Δura3株)。
[实施例3] aox1基因破坏株的制作
(1) aox1基因破坏载体的制作
利用了aox1 ORF的启动子和终止子区的DNA片段的基因破坏模式示于图2。通过将实施例1中构建的pOMEA-Z1用HindIII和KpnI双重消化，获得了包含aox1基因启动子和终止子盒的DNA片段。向通过将WO2009/057813中记载的质粒onaP09007 (编码OmKar2的基因的恒定表达载体)用HindIII和KpnI双重消化而获得的DNA片段上导入上述包含aox1基因启动子和终止子盒的DNA片段，由此获得了质粒pOMEU1。
(2) aox1基因破坏株的制作
将质粒pOMEU1在实施例2记载的条件下通过电穿孔法导入到实施例2记载的ura3基因破坏株(Δura3株)中。质粒pOMEU1使用了用限制酶BglII进行消化、用乙醇沉淀而获得的3μg的DNA。电穿孔后，将其涂抹于酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基[无氨基酵母氮源6.7g/l、酪蛋白氨基酸0.5g/l、葡萄糖20g/l、L-色氨酸20mg/l、琼脂20g/l]上，在28℃下增殖了约3天。使已增殖的转化体再次在酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上增殖，将其作为aox1基因破坏质粒导入株。
其次，将aox1基因破坏质粒导入株接种于加入有5ml的YPAD培养基[酵母提取物10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖20g/l、腺嘌呤-HCl 40mg/l]的50ml容量聚丙烯制离心管(Greiner公司，227241)中，用CO2透过性板封条(Greiner公司、676051)密封了离心管上部。在搅拌速度250rpm、振幅25mm、培养温度28℃下反复振荡培养2天后，将其涂抹于包含最终浓度0.1%(w/v)的5-FOA的YPAD琼脂培养基(酵母提取物1g/l、蛋白胨2g/l、葡萄糖20g/l、腺嘌呤-HCl 40mg/l、琼脂20g/l)上，在28℃增殖了约3天。使已增殖的转化体再次在包含最终浓度0.1%(w/v)的5-FOA的YPAD琼脂培养基上进行了增殖。aox1基因得到破坏的转化体通过菌落PCR法进行了选择。将在包含最终浓度0.1%(w/v)的5-FOA的YPAD琼脂培养基上增殖的酵母的一部分悬浮于10μL的0.25%SDS溶液中，加入90μL的灭菌水之后，通过离心分离(3,100×g、4℃、5分钟)去除了菌体。以将所得上清作为DNA溶液使用设计于aox1 ORF序列内的引物AOX ORF fw (5’-ATGGCTATTCCTGACGAATT-3’：SEQ ID NO: 11)和引物AOX ORF rv (5’-TTAGAATCTAGCCAGACCCTTC-3’：SEQ ID NO: 12)未确认到DNA扩增的株作为aox1基因破坏株(Δaox1株)。
[实施例4] OmPDI1、OmERO1和OmKar2伴侣导入株的制作
使用了WO2009/057813中记载的OmPDI1、OmERO1和OmKar2的共表达载体onaP11007 (图3)。通过电穿孔法将质粒onaP11007导入到NBRC10746株中。质粒onaP11007使用了用限制酶NotI进行消化、用乙醇沉淀而获得的1μg的DNA。已构建的onaP11007用限制酶NotI消化之后，通过实施例2记载的电穿孔法进行了导入。电穿孔后，将其涂抹于酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基(无氨基酵母氮源6.7g/l、酪蛋白氨基酸0.5g/l、葡萄糖20g/l、L-色氨酸20mg/l、琼脂20g/L)上，在28℃下增殖了约3天。使已增殖的转化体再次在酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上增殖之后，将导入有伴侣的转化体通过菌落PCR法进行了选择。将酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上增殖的酵母的一部分悬浮于10μL的0.25%SDS溶液中，加入90μL的灭菌水之后，通过离心分离(3,100×g、4℃、5分钟)去除了菌体。将所得上清作为DNA溶液，关于pdi1基因导入，使用设计于gap启动子序列内的引物GAPpforS-F (5’-GATCTCAGGCCGAGTCAAGAC-3’：SEQ ID NO: 13)和引物OmPDI-END Rv (5’-TTACAACTCGTCGTGAGCC-3’：SEQ ID NO: 14)确认了约1.6kbp的DNA扩增，关于ero1基因导入，使用设计于gap启动子序列内的引物GAPpforS-F (5’-GATCTCAGGCCGAGTCAAGAC-3’：SEQ ID NO: 13)和引物OmERO-END Rv (5’-TTATAGCTCCAAACGATACAG-3’：SEQ ID NO: 15)确认了约1.6kbp的DNA扩增，关于kar2基因导入，使用设计于pgk启动子序列内的引物PGKp-END Fw (5’-TAAACACTAACGCCGCAT-3’：SEQ ID NO: 16)和引物OmKar-END Rv (5’-TCACAGCTCATCATGATCC-3’：SEQ ID NO: 17)确认了约2kbp的DNA扩增。PCR使用TaKaRa LA TaqTM with GC Buffer (Takara Bio公司，RR02AG)扩增了目标片段[(94℃下30秒、55℃下30秒、72℃下120秒)×30循环]。将确认了扩增的转化体作为伴侣基因导入株(ura3::pdi1/ero1/kar2、NBRC10746+PEK株)。
[实施例5] prb1基因间断株的制作
(1) prb1基因间断载体的制作
利用了prb1 ORF的内部序列的基因破坏模式示于图4。NBRC10746的PRB1由1620bp的核苷酸序列所编码的539个氨基酸残基的氨基酸序列构成(SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32)。将WO2009/057813中记载的质粒pOMexPGHy (基于将潮霉素B抗性基因作为选择标记的磷酸甘油激酶(PGK1)启动子和终止子的外来基因表达载体)用限制酶HindIII和限制酶KpnI双重消化，获得了包含潮霉素抗性基因标记的DNA片段。将通过Y-DER Yeast DNA Extraction Reagent (PIERCE公司、78870)调制的NBRC10746的基因组DNA作为模板、利用设计于PRB1 ORF内的引物Doprb1F (5’-CAAGCTTCGTTGGCAGCAGTGGAG-3’:SEQ ID NO: 18)和引物Doprb1R (5’-CGGTACCCGATGGAATCTCAGACA-3’:SEQ ID NO: 19)的PCR [(98℃下10秒、55℃下5秒、72℃下5秒)×30循环]使用PrimeStarmax聚合酶(Takara Bio公司、12344-024)进行，扩增了SEQ ID NO: 20所示的约1.4kbp的目标DNA片段，将其克隆到pCR2.1-TOPO中。通过插入DNA片段的核苷酸序列，确认了具有prb1内部序列。利用导入到引物Doprb1F的限制酶HindIII位点和导入到引物Doprb1R的限制酶KpnI位点，用HindIII-KpnI消化，从保持确认了核苷酸序列的DNA片段的质粒回收了包含prb1内部序列的DNA片段。将包含prb1内部序列的DNA片段导入到包含潮霉素抗性基因标记的DNA片段中，获得了质粒pdPRB1。
(2) prb1基因间断株的制作
通过电穿孔法将质粒pdPRB1导入到NBRC10746株中。质粒pdPRB1使用了用限制酶AgeI进行消化、用乙醇沉淀而获得的5μg的DNA。电穿孔利用实施例2记载的条件进行实施，电穿孔后，将其涂抹于包含最终浓度200μg/ml的潮霉素B的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基[无氨基酵母氮源6.7g/l、酪蛋白氨基酸0.5g/l、葡萄糖20g/l、L-色氨酸20mg/l、琼脂20g/l]上，在28℃下增殖了约3天。使已增殖的转化体再次在包含最终浓度200μg/ml的潮霉素B的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上增殖之后，导入有质粒pdPRB1的转化体通过菌落PCR法进行了选择。将在包含最终浓度200μg/ml的潮霉素B的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上增殖的酵母的一部分悬浮于10μL的0.25%(w/v)SDS溶液中，加入90μL的灭菌水之后，通过离心分离(3,100×g、4℃、5分钟)去除了菌体。以将所得上清作为DNA溶液、使用设计于PRB1 ORF序列内的引物M13 RV (5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’：SEQ ID NO: 21)和设计于pdPRB1序列内的引物dprb1 check primer rv (5’-CTAATCGAACAAATCAGCAACC-3’：SEQ ID NO: 22)确认到约1.5kbp的DNA的扩增的株以及使用设计于prb1 ORF序列内的引物dprb1 check primer fw (5’-ATGAAGTTATCCCAGTCTGCTG-3’：SEQ ID NO: 23)和设计于pdPRB1序列内的潮霉素抗性基因的引物Hyg-t (5’-CAAAGGAATAGATCCCCCAT-3’：SEQ ID NO: 24)确认到约2kbp的DNA的扩增的株作为prb1基因间断株(prb1::hyg、dprb1株)。
[实施例6] 伴侣基因导入和prb1基因间断株的制作
通过电穿孔法将质粒pdPRB1导入到实施例4记载的NBRC10746＋PEK株中。质粒pdPRB1使用了用限制酶AgeI进行消化、用乙醇沉淀而获得的5μg的DNA。电穿孔在实施例2记载的条件下实施，电穿孔后，将其涂抹于包含最终浓度200μg/ml的潮霉素B的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基[无氨基酵母氮源6.7g/l、酪蛋白氨基酸0.5g/l、葡萄糖20g/l、L-色氨酸20mg/l、琼脂20g/l]上，在28℃下增殖了约3天。使已增殖的转化体再次在包含最终浓度200μg/ml的潮霉素B的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上增殖之后，将导入有质粒pdPRB1的转化体通过菌落PCR法进行了选择。将在包含最终浓度200μg/ml的潮霉素B的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上增殖的酵母的一部分悬浮于10μL的0.25%(w/v)SDS溶液中，加入90μL的灭菌水之后，通过离心分离(3,100×g、4℃、5分钟)去除了菌体。以将所得上清作为DNA溶液、使用设计于prb1 ORF序列内的引物M13 RV (5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’：SEQ ID NO: 21)和设计于pdPRB1序列内的引物dprb1 check primer rv (5’-CTAATCGAACAAATCAGCAACC-3’：SEQ ID NO: 22)确认到约1.5kbp的DNA的扩增的株以及使用设计于prb1 ORF序列内的引物dprb1 check primer fw (5’-ATGAAGTTATCCCAGTCTGCTG-3’：SEQ ID NO: 23)和设计于pdPRB1序列内的潮霉素抗性基因的引物Hyg-t (5’-CAAAGGAATAGATCCCCCAT-3’：SEQ ID NO: 24)确认到约2kbp的DNA的扩增的株作为伴侣导入和prb1基因间断株(ura3::pdi1/ero1/kar2 prb1::hyg、NBRC10746+PEK dprb1株)。
[实施例7] aox1基因破坏和伴侣导入株的制作
通过电穿孔法将质粒onaP11007导入到实施例3记载的Δaox1株中。质粒onaP11007使用了用限制酶NotI进行消化、用乙醇沉淀而获得的1μg的DNA。电穿孔在实施例2记载的条件下实施，电穿孔后，将其涂抹于酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基[无氨基酵母氮源6.7g/l、酪蛋白氨基酸0.5g/l、葡萄糖20g/l、L-色氨酸20mg/l、琼脂20g/l]上，在28℃下增殖了约3天。使已增殖的转化体再次在酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上增殖之后，将导入有伴侣基因的转化体通过菌落PCR法进行了选择。将在酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上增殖的酵母的一部分悬浮于10μL的0.25%SDS溶液中，加入90μL的灭菌水之后，通过离心分离(3,100×g、4℃、5分钟)去除了菌体。
将所得上清作为DNA溶液，关于pdi1基因导入，使用设计于gap启动子序列内的引物GAPpforS-F (5’-GATCTCAGGCCGAGTCAAGAC-3’：SEQ ID NO: 13)和引物OmPDI-END Rv (5’-TTACAACTCGTCGTGAGCC-3’：SEQ ID NO: 14)确认了约1.6kbp的DNA扩增，关于ero1基因导入，使用设计于gap启动子序列内的引物GAPpforS-F (5’-GATCTCAGGCCGAGTCAAGAC-3’：SEQ ID NO: 13)和引物OmERO-END Rv (5’-TTATAGCTCCAAACGATACAG-3’：SEQ ID NO: 15)确认了约1.6kbp的DNA扩增，关于kar2基因导入，使用设计于pgk启动子序列内的引物PGKp-END Fw (5’-TAAACACTAACGCCGCAT-3’：SEQ ID NO: 16)和引物OmKar-END Rv (5’-TCACAGCTCATCATGATCC-3’：SEQ ID NO: 17)确认了约2kbp的DNA扩增。PCR使用TaKaRa LA TaqTM with GC Buffer (Takara Bio公司、RR02AG)扩增了目标片段[(94℃下30秒、55℃下30秒、72℃下120秒)×30循环]。将确认了扩增的转化体作为aox1基因破坏和伴侣基因导入株(Δaox1、ura3::pdi1/ero1/kar2、Δaox1+PEK株)。
[实施例8] aox1基因破坏、伴侣导入和prb1基因间断株的制作
通过电穿孔法将质粒pdPRB1导入到实施例7所述的Δaox1+PEK株中。质粒pdPRB1使用了用限制酶AgeI进行消化、用乙醇沉淀而获得的5μg的DNA。电穿孔在实施例2记载的条件下实施，电穿孔后，将其涂抹于包含最终浓度200μg/ml的潮霉素B的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基[无氨基酵母氮源6.7g/l、酪蛋白氨基酸0.5g/l、葡萄糖20g/l、L-色氨酸20mg/l、琼脂20g/l]上，在28℃下增殖了约3天。使已增殖的转化体再次在包含最终浓度200μg/ml的潮霉素B的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上增殖之后，将导入有质粒pdPRB1的转化体通过菌落PCR法进行了选择。将包含最终浓度200μg/ml的潮霉素B的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上增殖的酵母的一部分悬浮于10μL的0.25%(w/v)SDS溶液中，加入90μL的灭菌水之后，通过离心分离(3,100×g、4℃、5分钟)去除了菌体。
以将所得上清作为DNA溶液、使用设计于prb1 ORF序列内的引物M13 RV (5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’：SEQ ID NO: 21)和设计于pdPRB1序列内的引物dprb1 check primer rv (5’-CTAATCGAACAAATCAGCAACC-3’：SEQ ID NO: 22)确认到约1.5kbp的DNA的扩增的株以及使用设计于prb1 ORF序列内的引物dprb1 check primer fw (5’-ATGAAGTTATCCCAGTCTGCTG-3’：SEQ ID NO: 23)和设计于pdPRB1序列内的潮霉素抗性基因的引物Hyg-t (5’-CAAAGGAATAGATCCCCCAT-3’：SEQ ID NO: 24)确认到约2kbp的DNA的扩增的株作为aox1基因破坏、伴侣导入和prb1基因间断株(Δaox1、ura3::pdi1/ero1/kar2、prb1::hyg、Δaox1+PEK dprb1株)。
[实施例9] 在deep well plate scale下的通过甲醇诱导的KEX2蛋白质的分泌量
(1) kex2表达质粒的制作
S.cerevisiae的KEX2 (GENBANK检索号：M22870.1)蛋白质由814个氨基酸残基构成(SEQ ID NO: 33)。为了使S.cerevisiae来源的α Factor前(pre)序列、α Factor原(pro)序列、KEX2 (SEQ ID NO: 33的第24位～第660位)、以及具有9个His的His9tag以融合蛋白质的形式表达，以P.pastoris的密码子使用频率通过Life technologies公司人工合成了SEQ ID NO: 25所示的核苷酸序列。将包含人工合成的核苷酸序列的载体用限制酶XbaI和限制酶BamHI进行消化，导入到实施例1中制作的pOMEA-Z1用限制酶XbaI和限制酶BamHI消化而得的片段中。将所得质粒作为kex2表达质粒(pOMEA-Z1-KEX2) (图5)。
(2) KEX2产生株的制作
(2-1) 来源于伴侣导入株的KEX2产生株的制作
通过电穿孔法将上述的kex2表达质粒导入到实施例4记载的NBRC10746+PEK株中。kex2表达质粒使用了用限制酶BglII进行消化、用乙醇沉淀而获得的1μg的DNA。电穿孔在实施例2记载的条件下实施，电穿孔后，将其涂抹于包含最终浓度200μg/ml的Zeocin的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基[无氨基酵母氮源6.7g/l、酪蛋白氨基酸0.5g/l、葡萄糖20g/l、L-色氨酸20mg/l、琼脂20g/l]上，在28℃下增殖了约3天。使已增殖的转化体再次在包含最终浓度200μg/ml的Zeocin的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上进行了增殖。
KEX2生产株如下进行培养，选择了高生产株。使用2xYP-P6-dp培养基[将20g酵母提取物和40g蛋白胨溶解于900ml纯水中，高压蒸气灭菌之后，添加另外灭菌的100ml的10x磷酸缓冲液(pH6.0) (1M KH2PO4、0.15M (NH4)2SO4、0.355N KOH)、另外灭菌的10ml的50%葡萄糖溶液、另外灭菌的6.25ml的80%甘油来调制]，向96-deep well plate (96-深孔板) (Greiner公司、780271)中加入800μl的2xYP-P6-dp培养基，用牙签接种之后，用CO2透过性板封条(Greiner公司、676051)密封了平板上部。在搅拌速度310rpm、振幅25mm、培养温度28℃下培养2天后，添加100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c和10%(v/v)甲醇的2xYP-P6-dpn培养基[将20g酵母提取物和40g蛋白胨溶解于900ml纯水中，高压蒸气灭菌之后，添加另外灭菌的100ml的10x磷酸缓冲液(pH6.0) (1M KH2PO4、0.15M (NH4)2SO4、0.355N KOH)来调制]，并且，在培养第3天添加了100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c和10%(v/v)甲醇的2xYP-P6-dpn培养基。从在培养第4天的培养结束液中通过离心分离(3,100×g、4℃、5分钟)去除菌体，调制培养上清，以此作为KEX2产生试样。已分泌生产的KEX2的定量性分析通过斑点印迹法进行了实施。添加SDS-PAGE缓冲液(SDS/β-巯基乙醇)，将1μl在100℃下反应了5分钟的培养上清滴加到硝酸纤维素膜上，使培养上清的蛋白质吸附，通过ECL SelectTMWestern Blotting Detedtion Reagent (GE Healthcare公司，RPN2235)和过氧化物酶标识penta-His特异性抗体(Penta-His HRP Conjugate Kit) (QIAGEN公司、34460)进行了发光检测。将已选择的KEX2产生株作为来源于伴侣导入株(ura3::pdi1/ero1/kar2、NBRC10746+PEK株)的KEX2产生株。
(2-2) 伴侣导入和prb1基因间断株来源的KEX2产生株的制作
通过电穿孔法将上述kex2表达质粒导入到实施例6记载的NBRC10746+PEK dprb1株中。kex2表达质粒使用了用限制酶BglII进行消化、用乙醇沉淀而获得的1μg的DNA。电穿孔在实施例2记载的条件下实施，电穿孔后，将其涂抹于包含最终浓度200μg/ml的Zeocin和最终浓度200μg/ml的潮霉素B的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上，在28℃下增殖了2-3天。使已增殖的转化体再次在包含最终浓度200μg/ml的Zeocin和最终浓度200μg/ml的潮霉素B的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上进行了增殖。
KEX2生产株如下进行培养，选择了高生产株。使用2xYP-P6-dp培养基，向96-deep well plate (Greiner公司、780271)中加入800μl的2xYP-P6-dpn培养基，用牙签接种之后，用CO2透过性板封条(Greiner公司、676051)密封了平板上部。在搅拌速度310rpm、振幅25mm、培养温度28℃下培养2天后，添加100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c和10%(v/v)甲醇的2xYP-P6-dpn培养基，并且，在培养第3天添加了包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c和10%(v/v)甲醇的2xYP-P6-dpn培养基。从在培养第4天的培养结束液中通过离心分离(3,100×g、4℃、5分钟)去除菌体，调制培养上清，以此作为KEX2产生试样。已分泌生产的KEX2的定量性分析通过斑点印迹法进行了实施。添加SDS-PAGE缓冲液(SDS/β-巯基乙醇)，将1μl在100℃下反应了5分钟的培养上清滴加到硝酸纤维素膜上，使培养上清的蛋白质吸附，通过ECL SelectTMWestern Blotting Detedtion Reagent (GE Healthcare公司，RPN2235)和过氧化物酶标识penta-His特异性抗体(Penta-His HRP Conjugate Kit) (QIAGEN公司、34460)进行了发光检测。将已选择的KEX2产生株作为伴侣导入和prb1基因间断株(ura3::pdi1/ero1/kar2、prb1::hyg、NBRC10746+PEK dprb1)来源的KEX2产生株。
(2-3) aox1基因破坏和伴侣导入株来源的KEX2产生株的制作
通过电穿孔法将上述kex2表达质粒导入到实施例7记载的Δaox1+PEK株中。kex2表达质粒使用了用限制酶BglII进行消化、用乙醇沉淀而获得的1μg的DNA。电穿孔在实施例2记载的条件下实施，电穿孔后，将其涂抹于包含最终浓度200μg/ml的Zeocin的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上，在28℃下增殖了约2-3天。使已增殖的转化体再次在包含最终浓度200μg/ml的Zeocin的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上进行了增殖。
KEX2生产株如下进行培养，选择了高生产株。使用2xYP-P6-dp培养基，向96-deep well plate (Greiner公司、780271)中加入800μl的2xYP-P6-dp培养基，用牙签接种之后，用CO2透过性板封条(Greiner公司、676051)密封了平板上部。在搅拌速度310rpm、振幅25mm、培养温度28℃下培养2天后，添加100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c、5%(w/v)甘油和5%(v/v)甲醇的2xYP-P6-dpn培养基，并且，在培养第3天添加了100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c和5%(w/v)甘油的2xYP-P6-dpn培养基。从在培养第4天的培养结束液中通过离心分离(3,100×g、4℃、5分钟)去除菌体，调制培养上清，以此作为KEX2产生试样。已分泌生产的KEX2的定量性分析通过斑点印迹法进行了实施。向5μl培养上清中添加5μl的Tris SDS b-ME样品处理液(Cosmo Bio公司、423437)，将1μl在100℃下反应了5分钟的培养上清滴加到硝酸纤维素膜上，使培养上清的蛋白质吸附，通过ECL SelectTM Western Blotting Detedtion Reagent (GE Healthcare公司，RPN2235)和过氧化物酶标识penta-His特异性抗体(Penta-His HRP Conjugate Kit) (QIAGEN公司、34460)进行了发光检测。将已选择的KEX2产生株作为aox1基因破坏、伴侣导入株(Δaox1、ura3::pdi1/ero1/kar2、Δaox1+PEK株)来源的KEX2产生株。
(2-4) aox1基因破坏、伴侣导入和prb1基因间断株来源的KEX2产生株的制作
通过电穿孔法将上述kex2表达质粒导入到实施例8记载的Δaox1+PEK dprb1株中。kex2表达质粒使用了用限制酶BglII进行消化、用乙醇沉淀而获得的1μg的DNA。电穿孔在实施例2记载的条件下实施，电穿孔后，将其涂抹于包含最终浓度200μg/ml的Zeocin和最终浓度200μg/ml的潮霉素B的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上，在28℃下增殖了约2-3天。使已增殖的转化体再次在包含最终浓度200μg/ml的Zeocin和最终浓度200μg/ml的潮霉素B的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上进行了增殖。
KEX2生产株如下进行培养，选择了高生产株。使用2xYP-P6-dp培养基，向96-deep well plate (Greiner公司、780271)中加入800μl的2xYP-P6-dp培养基，用牙签接种之后，用CO2透过性板封条(Greiner公司、676051)密封了平板上部。在搅拌速度310rpm、振幅25mm、培养温度28℃下培养2天后，添加100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c、5%(w/v)甘油和5%(v/v)甲醇的2xYP-P6-dpn培养基，并且，在培养第3天添加了100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c和5%甘油的2xYP-P6-dpn培养基。从在培养第4天的培养结束液中通过离心分离(3,100×g、4℃、5分钟)去除菌体，调制培养上清，以此作为KEX2产生试样。已分泌生产的KEX2的定量性分析通过斑点印迹法进行了实施。向5μl培养上清中添加5μl的Tris SDS b-ME样品处理液(Cosmo Bio公司、423437)，将1μl在100℃下反应了5分钟的培养上清滴加到硝酸纤维素膜上，使培养上清的蛋白质吸附，通过ECL SelectTM Western Blotting Detedtion Reagent (GE Healthcare公司，RPN2235)和过氧化物酶标识penta-His特异性抗体(Penta-His HRP Conjugate Kit) (QIAGEN公司、34460)进行了发光检测。将已选择的KEX2产生株作为aox1基因破坏、伴侣导入和prb1基因间断株(Δaox1、ura3::pdi1/ero1/kar2、prb1::hyg、Δaox1+PEK dprb1株)来源的KEX2产生株。
(3) KEX2分泌生产量的比较
将上述中获得的各KEX2分泌生产株涂抹在包含最终浓度200μg/ml的Zeocin (dprb1来源株包含最终浓度200μg/ml的Zeocin和最终浓度200μg/ml的潮霉素B)的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上，使上述中获得的各KEX2产生株在28℃下增殖了约2天。使用2xYP-P6-dp培养基，向96-deep well plate (Greiner公司、780271)中加入800μl的2xYP-P6-dp培养基，用牙签接种之后，用CO2透过性板封条(Greiner公司、676051)密封了平板上部。在搅拌速度310rpm、振幅25mm、培养温度28℃下培养了2天。然后，关于NBRC10746+PEK来源株和NBRC10746+PEK dprb1来源株，添加100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c、10%(v/v)甲醇的2xYP-P6-dpn培养基，并且，在培养第3天添加了100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c和10%(v/v)甲醇的2xYP-P6-dpn培养基。另外，关于Δaox1+PEK来源株和Δaox1+PEK dprb1来源株，添加100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c、5%(w/v)甘油和5%(v/v)甲醇的2xYP-P6-dpn培养基，并且，在培养第3天添加了100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c和5%(w/v)甘油的2xYP-P6-dpn培养基。从在培养第4天的培养结束液中通过离心分离(3,100×g、4℃、5分钟)去除菌体，调制培养上清，将其作为KEX2产生试样。
KEX2产生试样，通过糖链切断酶Endo H (NEW ENGLAND Bio Labs公司，P0702S)去除加成到产生KEX2上的N结合型糖链，将试样通过基于SDS-PAGE/CBB染色的谱带强度进行了比较。关于谱带强度，利用ATTO公司制造的Light-Capture拍摄SDS-PAGE凝胶，使用分析软件Cool Saver2 (ATTO公司，Version 1.01.1058)进行了测定。如图6-1所示，显示出：对照(NBRC10746+PEK株)显示谱带强度为81178，相对于此，NBRC10746＋PEK dprb1株的谱带强度为93277提高到对照的约1.1倍的分泌生产。另一方面，确认到：在Δaox1+PEK dprb1株中，与NBRC10746+PEK株和NBRC10746+PEK dprb1株相比，通过添加低浓度的甲醇，谱带强度为143819提高到对照的约1.8倍的高分泌生产。特别是Δaox1+PEK dprb1株与对照相比，通过添加低浓度的甲醇，显示出高分泌生产性。
[实施例10] KEX2蛋白质的酶活性比较
实施例9中分泌生产的KEX2酶活性示于图6-2。通过荧光检测利用以Boc-Leu-Arg-Arg-MCA (4-methylcoumaryl-7-amide) (肽研究所、#3140-v)为底物的KEX2的反应而游离(释放)的AMC (7-amino-4-methylcoumarin)评价了酶活性。从培养上清中通过离心分离(3,100×g、4℃、5分钟)去除菌体，调制培养上清，以此作为KEX2产生试样。将试样利用100mM Tris (pH7.0)适当地稀释之后，将100μl稀释试样和100μl底物溶液[400mM Tris (pH7.0)、2mM CaCl2、0.2% lubrol、100μM BOC-Leu-Arg-Arg-MCA]混合，在28℃下反应30分钟，加入50μl反应停止液(5mM EGTA(Na))，使反应停止。反应停止后，使用荧光分析仪(fluorescence plate reader)进行了AMC的定量(激发波长355nm、测定波长460nm)。通过将AMC (肽研究所制造、#3099-v)标准样品同样地进行稀释、检测，制作校准曲线，计算出试样中的KEX2蛋白酶的活性。需要说明的是，每单位的KEX2活性被定义为在上述的反应条件下每分钟游离1pmol的AMC的KEX2含量。确认到：相对于对照(NBRC10746+PEK株)，在Δaox1+PEK dprb1株中，提高到・BR>・8倍高的酶活性。
[实施例11] 在deep well plate scale下的通过甲醇诱导的HSA蛋白质的分泌量
(1) hsa表达质粒的制作
HSA (Human serum albumin) [GENBANK检索号：NP000468]由609个氨基酸序列构成(SEQ ID NO: 34)。为了使S.cerevisiae来源的α Factor前(pre)序列、α Factor原(pro)序列、以及HAS以融合蛋白质的形式表达，以P.pastoris的密码子使用频率通过Life technologies公司人工合成了SEQ ID NO: 26所示的DNA。包含人工合成的DNA的载体用限制酶XbaI和限制酶BamHI进行消化，将pOMEA-Z1导入到用限制酶XbaI和限制酶BamHI消化而得的片段中。将所得质粒作为hsa表达质粒(pOMEA-Z1-HSA) (图7)。
(2) HSA产生株的制作
(2-1) 来源于伴侣导入株的HSA产生株的制作
通过电穿孔法将上述hsa表达质粒导入到实施例4记载的NBRC10746+PEK株中。hsa表达质粒使用了用限制酶BglII进行消化、用乙醇沉淀而获得的1μg的DNA。电穿孔在实施例2记载的条件下实施，电穿孔后，将其涂抹于包含最终浓度200μg/ml的Zeocin的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基[无氨基酵母氮源6.7g/L、酪蛋白氨基酸0.5g/L、葡萄糖20g/L、L-色氨酸20mg/L、琼脂20g/L]上，在28℃下增殖了约2-3天。使已增殖的转化体再次在包含最终浓度200μg/ml的Zeocin的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上进行了增殖。
HSA生产株如下进行培养，选择了高生产株。使用2xYP-P6-dp培养基[将20g酵母提取物和40g蛋白胨溶解于900mL纯水中，高压蒸气灭菌之后，添加100ml另外灭菌的10x磷酸缓冲液(pH6.0) (1M KH2PO4、0.15M (NH4)2SO4、0.355N KOH)、10ml另外灭菌的50%葡萄糖溶液、6.25ml另外灭菌的80%甘油来调制]，向96-deep well plate (Greiner公司、780271)中加入800μl的2xYP-P6-dp培养基，用牙签接种之后，用CO2透过性板封条(Greiner公司、676051)密封了平板上部。在搅拌速度310rpm、振幅25mm、培养温度28℃下培养2天后，添加100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c和10%(v/v)甲醇的2xYP-P6-dpn培养基[将20g酵母提取物和40g蛋白胨溶解于900ml纯水中，高压蒸气灭菌之后，添加100ml另外灭菌的10x磷酸缓冲液(pH6.0) (1M KH2PO4、0.15M (NH4)2SO4、0.355N KOH)来调制]，并且，在培养第3天添加了100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c和10%(v/v)甲醇的2xYP-P6-dpn培养基。从在培养第4天的培养结束液中通过离心分离(3,100×g、4℃、5分钟)去除菌体，调制培养上清，以此作为HSA产生试样。已分泌生产的HSA的定量性分析通过斑点印迹法进行了实施。向5μl培养上清中添加5μl的Tris SDS b-ME样品处理液(Cosmo Bio公司、423437)，将1μl在100℃下反应了5分钟的培养上清滴加到硝酸纤维素膜上，使培养上清的蛋白质吸附，通过ECL SelectTM Western Blotting Detedtion Reagent (GE Healthcare公司，RPN2235)和过氧化物酶标识人白蛋白特异性抗体(Goat anti-Human Albumin HRP Conjugated) (BETHL公司、A80-129P)进行了发光检测。将已选择的HSA产生株作为伴侣导入株(ura3::pdi1/ero1/kar2、NBRC10746+PEK株)来源的HSA产生株。
(2-2) 伴侣导入和prb1基因间断株来源的HSA产生株的制作
通过电穿孔法将上述hsa表达质粒导入到实施例6记载的NBRC10746+PEK dprb1株中。hsa表达质粒使用了用限制酶BglII进行消化、用乙醇沉淀而获得的1μg的DNA。电穿孔在实施例2记载的条件下实施，电穿孔后，将其涂抹于包含最终浓度200μg/ml的Zeocin和最终浓度200μg/ml的潮霉素B的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上，在28℃下增殖了2-3天。使已增殖的转化体再次在包含最终浓度200μg/ml的Zeocin和最终浓度200μg/ml的潮霉素B的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上进行了增殖。
HSA生产株如下进行培养，选择了高生产株。使用2xYP-P6-dp培养基，向96-deep well plate (Greiner公司、780271)中加入800μl的2xYP-P6-dpn培养基，用牙签接种之后，用CO2透过性板封条(Greiner公司、676051)密封了平板上部。在搅拌速度310rpm、振幅25mm、培养温度28℃下培养2天后，添加100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c和10%(v/v)甲醇的2xYP-P6-dpn培养基，并且，在培养第3天添加了100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c和10%(v/v)甲醇的2xYP-P6-dpn培养基。从在培养第4天的培养结束液中通过离心分离(3,100×g、4℃、5分钟)去除菌体，调制培养上清，以此作为HSA产生试样。已分泌生产的HSA的定量性分析通过斑点印迹法进行了实施。添加SDS-PAGE缓冲液(SDS/β-巯基乙醇)，将1μl在100℃下反应了5分钟的培养上清滴加到硝酸纤维素膜上，使培养上清的蛋白质吸附，通过ECL SelectTM Western Blotting Detedtion Reagent (GE Healthcare公司，RPN2235)和过氧化物酶标识人白蛋白特异性抗体(Goat anti-Human Albumin HRP Conjugated) (BETHL公司、A80-129P)进行了发光检测。将已选择的HSA产生株作为伴侣导入和prb1基因间断株(ura3::pdi1/ero1/kar2、prb1::hyg、NBRC10746+PEK dprb1)来源的HSA产生株。
(2-3) aox1基因破坏和伴侣导入株来源的HSA产生株的制作
通过电穿孔法将上述hsa表达质粒导入到实施例7记载的Δaox1+PEK株中。hsa表达质粒使用了用限制酶BglII进行消化、用乙醇沉淀而获得的1μg的DNA。电穿孔在实施例2记载的条件下实施，电穿孔后，将其涂抹于包含最终浓度200μg/ml的Zeocin的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上，在28℃下增殖了约2-3天。使已增殖的转化体再次在包含最终浓度200μg/ml的Zeocin的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上进行了增殖。
HSA生产株如下进行培养，选择了高生产株。使用2xYP-P6-dp培养基，向96-deep well plate (Greiner公司、780271)中加入800μl的2xYP-P6-dp培养基，用牙签接种之后，用CO2透过性板封条(Greiner公司、676051)密封了平板上部。在搅拌速度310rpm、振幅25mm、培养温度28℃下2天培养后，添加100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c、5%(w/v)甘油、和5%(v/v)甲醇的2xYP-P6-dpn培养基，并且，在培养的第3天添加了100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c、和5%(w/v)甘油的2xYP-P6-dpn培养基。在培养的第4天从培养结束液中通过离心分离(3,100×g、4℃、5分钟)去除菌体，调制培养上清，以此作为HSA产生试样。已分泌生产的HSA的定量性分析通过斑点印迹法进行了实施。向5μl培养上清中添加5μl的Tris SDS b-ME样品处理液(Cosmo Bio公司、423437)，使其在100℃下反应5分钟，将1μl所得培养上清滴加到硝酸纤维素膜上，使培养上清的蛋白质吸附，用ECL SelectTM Western Blotting Detedtion Reagent (GE Healthcare公司，RPN2235)和过氧化物酶标识人白蛋白特异性抗体(Goat anti-Human Albumin HRP Conjugated) (BETHL公司、A80-129P)进行了发光检测。将已选择的HSA产生株作为aox1基因破坏、伴侣导入株(Δaox1、ura3::pdi1/ero1/kar2、Δaox1+PEK株)来源的HSA产生株。
(2-4) aox1基因破坏、伴侣导入、和prb1基因间断株来源HSA产生株的制作
通过电穿孔法将上述hsa表达质粒导入到实施例8记载的Δaox1+PEK dprb1株中。hsa表达质粒使用了用限制酶BglII进行消化、用乙醇沉淀而获得的1μg的DNA。电穿孔在实施例2记载的条件下实施，电穿孔后，将其涂抹于包含最终浓度200μg/ml的Zeocin和最终浓度200μg/ml的潮霉素B的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上，在28℃下增殖了约2-3天。使已增殖的转化体再次在包含最终浓度200μg/ml的Zeocin和最终浓度200μg/ml的潮霉素B的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上进行了增殖。
HSA生产株如下进行培养，选择了高生产株。使用2xYP-P6-dp培养基，向96-deep well plate (Greiner公司、780271)中加入800μl的2xYP-P6-dp培养基，用牙签接种之后，用CO2透过性板封条(Greiner公司、676051)密封了平板上部。在搅拌速度310rpm、振幅25mm、培养温度28℃下培养2天后，添加100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c、5%(w/v)甘油和5%(v/v)甲醇的2xYP-P6-dpn培养基，并且，在培养第3天添加了100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c和5%甘油的2xYP-P6-dpn培养基。从在培养第4天的培养结束液中通过离心分离(3,100×g、4℃、5分钟)去除菌体，调制培养上清，以此作为HSA产生试样。已分泌生产的HSA的定量性分析通过斑点印迹法进行了实施。添加SDS-PAGE缓冲液(SDS/β-巯基乙醇)，将1μl在100℃下反应了5分钟的培养上清滴加到硝酸纤维素膜上，使培养上清的蛋白质吸附，通过ECL SelectTM Western Blotting Detedtion Reagent (GE Healthcare公司，RPN2235)和过氧化物酶标识人白蛋白特异性抗体(Goat anti-Human Albumin HRP Conjugated) (BETHL公司、A80-129P)进行了发光检测。将已选择的HSA产生株作为aox1基因破坏、伴侣导入和prb1基因间断株(Δaox1、ura3::pdi1/ero1/kar2、prb1::hyg、Δaox1+PEK dprb1株)来源的HSA产生株。
(3) HSA分泌生产量的比较
上述中获得的各HSA分泌生产株涂抹于包含最终浓度200μg/ml的Zeocin (dprb1来源株为最终浓度200μg/ml的Zeocin和最终浓度200μg/ml的潮霉素B)的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基上，在28℃下增殖了约2天。使用2xYP-P6-dp培养基，向96-deep well plate (Greiner公司、780271)中加入800μl的2xYP-P6-dp培养基，用牙签接种之后，用CO2透过性板封条(Greiner公司、676051)密封了平板上部。在搅拌速度310rpm、振幅25mm、培养温度28℃下培养了2天。然后，关于NBRC10746+PEK来源株和NBRC10746+PEK dprb1来源株，添加100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c、10%(v/v)甲醇的2xYP-P6-dpn培养基，并且，在培养第3天添加了100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c和10%(v/v)甲醇的2xYP-P6-dpn培养基。另外，关于Δaox1+PEK来源株和Δaox1+PEK dprb1来源株，添加100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c、5%(w/v)甘油和5%(v/v)甲醇的2xYP-P6-dpn培养基，并且，在培养第3天添加了100μl包含40μM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c和5%(w/v)甘油的2xYP-P6-dpn培养基。从在培养第4天的培养结束液中通过离心分离(3,100×g、4℃、5分钟)去除菌体，调制培养上清，以此作为HSA产生试样。将试样通过基于SDS-PAGE/CBB染色的谱带强度进行了比较。关于谱带强度，利用ATTO公司制造的Light-Capture拍摄SDS-PAGE凝胶、使用分析软件Cool Saver2 (ATTO公司，Version 1.01.1058)进行了测定。如图8所示，确认到：对照(NBRC10746+PEK株)显示出谱带强度为1585061，相对于此，在NBRC10746+PEK dprb1株中谱带强度为2882752提高到对照的1.8倍、在Δaox1+PEK株中谱带强度为2111007提高到对照的1.3倍、在Δaox1+PEK dprb1株中谱带强度为3041627提高到对照的1.9倍的最高分泌生产。Δaox1+PEK株、特别是Δaox1+PEK dprb1株在低浓度的甲醇添加下显示出高于对照(NBRC10746+PEK株)的分泌生产性。
[实施例12] 在3L通气搅拌培养规模下的通过甲醇诱导的HSA蛋白质的分泌生产量
关于实施例11中获得的各HSA产生株(NBRC10746+PEK株、Δaox1+PEK dprb1株)，进行了在3L通气搅拌培养规模下的通过甲醇诱导的HSA蛋白质的分泌生产量的比较。关于3L通气搅拌培养，如下进行了实施。将实施例11中获得的各HSA产生株(NBRC10746+PEK株、Δaox1+PEK dprb1株)涂抹于包含最终浓度200μg/ml的Zeocin (dprb1来源株为最终浓度200μg/ml的Zeocin和最终浓度200μg/ml的潮霉素B)的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基(无氨基酵母氮源6.7g/l、酪蛋白氨基酸0.5g/l、葡萄糖20g/l、L-色氨酸20mg/l、琼脂20g/l)上，在28℃下增殖了约2天。将已增殖的株接种于加入了5ml包含最终浓度25μg/ml的Zeocin (dprb1来源株为最终浓度25μg/ml的Zeocin和最终浓度50μg/ml的潮霉素B)的酪蛋白氨基酸-U-A培养基(无氨基酵母氮源6.7g/l、酪蛋白氨基酸0.5g/l、葡萄糖20g/l、L-色氨酸20mg/l)的50ml容量聚丙烯制离心管(Greiner公司，227241)中，用板封条(Greiner公司、676051)密封了上部。在搅拌速度250rpm、振幅25mm、培养温度28℃下反复振荡培养24小时，将所得的培养结束液作为第1种培养液。
其次，将10ml第1种培养液接种于加入了40ml包含最终浓度25μg/ml的Zeocin (dprb1来源株是最终浓度25μg/ml的Zeocin和最终浓度50μg/ml的潮霉素B)的2x YP-P6移种培养基[将20g酵母提取物和40g蛋白胨溶解于900ml纯水中，高压蒸气灭菌之后，添加100ml另外灭菌的10x磷酸缓冲液(pH6.0) (1M KH2PO4、0.15M (NH4)2SO4、0.355N KOH)、12.5mL另外灭菌的50%葡萄糖溶液、62.5ml另外灭菌的80%甘油来调制]的500ml容量Baffle Flask (带挡板的瓶) (BD Falcon公司，355123)中，用板封条(Greiner公司、676051)密封了上部。在搅拌速度180rpm、振幅50mm、培养温度28℃下旋转振荡培养24小时，将所得培养结束液作为第2种培养液。
其次，将60ml第2种培养液接种于加入了3x YP-P6 培养基[将36g酵母提取物和72g蛋白胨溶解于1080ml纯水中，高压蒸气灭菌之后，添加120ml另外灭菌的10x磷酸缓冲液(pH6.0) (1M KH2PO4、0.15M (NH4)2SO4、0.355N KOH)、12ml另外灭菌的50%(w/v)葡萄糖溶液、60ml另外灭菌的80%(w/v)甘油、100μg消泡剂CB-442来调制(dprb1来源株是添加1.2ml的50mg/ml潮霉素B)]的3L培养罐(ABLE公司、BMS-03PI加压型和BMS-03PII加压型)中。在培养温度28℃、内压0.1MPa、DO 2ppm (通过搅拌进行自动控制)下实施了培养。培养8小时后，以每小时3ml直至培养24小时后连续流加了50%(w/v)甘油水溶液。确认培养基中的甘油耗尽后，添加了780μl的40mM罗丹宁-3-乙酸衍生物1c。
接着，通过以下所示的方法实施了甲醇诱导培养。关于对照(NBRC10746+PEK株：Jar1)，向上述的确认到甘油耗尽的培养基中，添加32ml灭菌水和12ml的100%甲醇，开始了甲醇诱导培养。自甲醇诱导培养开始起第2小时，每天连续流加了20ml灭菌水、和86ml的100%甲醇直到培养结束日。关于NBRC10746+PEK株(Jar2)和Δaox1+PEK dprb1株(Jar3)，通过以下所示的方法实施了pH值控制和通过氮源流加进行的甲醇诱导培养。关于BRC10746+PEK株(Jar2)，向上述的确认到甘油耗尽的培养基中，添加32ml的10%(w/v) L-组氨酸盐酸盐1水合物后，用14%(v/v)的氨水开始自动控制至pH6.5，添加12ml的100%甲醇，开始了甲醇诱导培养。关于Δaox1+PEK dprb1株(Jar3)，向上述的确认到甘油耗尽的培养基中，添加32ml的10%(w/v) L-组氨酸盐酸盐1水合物和1.2ml的50mg/ml潮霉素B后，用14%(v/v)的氨水开始自动控制至pH6.5，添加6.5ml的100%甲醇，开始了甲醇诱导培养。然后，关于NBRC10746+PEK株(Jar2)，控制了培养液的pH值使甲醇诱导培养第3小时为pH6.75、第6小时以后为pH7。并且，从诱导培养刚开始后，每天连续流加了20ml氮源流加液[酵母提取物300g/l、L-组氨酸盐酸盐1水合物80g/l]和86ml的100%甲醇直到培养结束日。关于Δaox1+PEK dprb1株(Jar3)，控制了培养液的pH值使甲醇诱导培养第3小时为pH6.75、第6小时以后为pH7。并且，从诱导培养刚开始后，每天连续流加了20ml氮源流加液、30ml的80%(w/v)甘油、56ml灭菌水直到培养结束日，在甲醇诱导培养24小时以后，每天间断流加了1.2ml的50mg/ml潮霉素B和最终浓度0.2-0.5%(v/v)的甲醇。需要说明的是，从甲醇诱导培养第9天起，每天允许溢流100ml的培养液。
将各培养液通过离心分离(3000×g、4℃、5分钟)去除菌体，调制培养上清，以此作为HSA产生试样。关于已分泌生产的HSA的定量性分析，将试样通过基于SDS-PAGE/CBB染色的谱带强度进行了比较。关于谱带强度，利用ATTO公司制造的Light-Capture拍摄SDS-PAGE凝胶，使用分析软件Cool Saver2 (ATTO公司，Version 1.01.1058)进行了测定。根据以Albumin Standard (Thermo scientifi公司：232209)为标准样品的谱带强度的校准曲线定量了HSA。
HAS的分泌生产量的定量结果示于图9。关于对照(NBRC10746+PEK株:Jar1)，生产性的最大值为甲醇诱导培养第4-5天。另外，在pH值控制和氮源流加培养中，关于NBRC10746+PEK株(Jar2)，生产性的最大值为甲醇诱导培养第2-3天，第4天以后明显地观察到分泌生产的HSA的分解，相对于此，关于Δaox1+PEK dprb1株(Jar3)，直到第21天仍维持生产性，且分解物的生成也几乎观察不到，确认到是可长期培养的蛋白质生产体系。关于HAS的分泌生产量，在pH值控制和氮源流加培养中，确认到：与对照(NBRC10746+PEK株:Jar1)比较，在NBRC10746+PEK株(Jar2)中约1.4倍(2486mg/L→3594mg/L)、在Δaox1+PEK dprb1株(Jar3)中约2.9倍(2486mg/L→7104mg/L)的分泌生产性的提高。另外，关于甲醇添加量，若直至甲醇诱导培养第7天进行比较，则相对于对照(NBRC10746+PEK株:Jar1)和NBRC10746+PEK株(Jar2)，Δaox1+PEK dprb1株(Jar3)降低至约1/17(5.8%)。因此，pH值控制和氮源流加培养的Δaox1+PEK dprb1株(Jar3)与对照(NBRC10746+PEK株:Jar1)和NBRC10746+PEK株(Jar2)比较，确认到：大幅度降低添加的甲醇量同时显示高的分泌生产性。
[实施例13] 在3L通气搅拌培养规模下的通过碳源饥饿诱导的HSA蛋白质的分泌生产性
关于实施例11中获得的Δaox1+PEK dprb1株来源的HSA产生株，进行了在3L通气搅拌培养规模下的通过碳源饥饿诱导和甲醇诱导的HSA蛋白质的分泌生产量的比较。关于3L通气搅拌培养，如下进行了实施。在包含最终浓度200μg/ml的Zeocin和最终浓度200μg/ml的潮霉素B的酪蛋白氨基酸-U-A琼脂培养基(无氨基酵母氮源6.7g/l、酪蛋白氨基酸0.5g/l、葡萄糖20g/l、L-色氨酸20mg/l、琼脂20g/l)上涂抹实施例11中获得的Δaox1+PEK dprb1株来源的HSA产生株，在28℃下增殖了约2天。将已增殖的株接种于加入了5ml包含最终浓度25μg/ml的Zeocin和最终浓度50μg/ml的潮霉素B的酪蛋白氨基酸-U-A培养基(无氨基酵母氮源6.7g/l、酪蛋白氨基酸0.5g/l、葡萄糖20g/l、L-色氨酸20mg/l)的50ml容量聚丙烯制离心管(Greiner公司，227241)中，用板封条(Greiner公司、676051)密封了上部。在搅拌速度250rpm、振幅25mm、培养温度28℃下反复振荡培养24小时，将所得培养结束液作为第1种培养液。
其次，将10ml第1种培养液接种于加入了40ml包含最终浓度31.25μg/ml的Zeocin和最终浓度62.5μg/ml的潮霉素B的2x YP-P6移种培养基[将20g酵母提取物和40g蛋白胨溶解于900ml纯水中，高压蒸气灭菌之后，添加100ml另外灭菌的10x磷酸缓冲液(pH6.0) (1M KH2PO4、0.15M (NH4)2SO4、0.355N KOH)、12.5mL另外灭菌的50%葡萄糖溶液、62.5ml另外灭菌的80%甘油来调制]的500ml容量Baffle Flask (BD Falcon公司，355123)中，用板封条(Greiner公司、676051)密封了上部。在搅拌速度180rpm、振幅50mm、培养温度28℃下旋转振荡培养24小时，将所得培养结束液作为第2种培养液。
其次，将75ml第2种培养液接种于加入了3x YP-P6 培养基[将45g酵母提取物和90g蛋白胨溶解于1350ml纯水中，高压蒸气灭菌之后，添加150ml另外灭菌的10x磷酸缓冲液(pH6.0) (1M KH2PO4、0.15M (NH4)2SO4、0.355N KOH)、15ml另外灭菌的50%(w/v)葡萄糖溶液、75ml另外灭菌的80%(w/v)甘油、1.5ml的50mg/ml潮霉素B、100μg消泡剂CB-442来调制]的3L培养罐(ABLE公司，BMS-03PI加压型和BMS-03PII加压型)中。在培养温度28℃、内压0.1MPa、DO 2ppm (通过搅拌进行自动控制)下实施了培养。自培养8小时后以每小时4.3ml直到培养22小时后连续流加了50%(w/v)的甘油水溶液。
确认到培养基中的甘油耗尽之后，接着，在甲醇诱导培养或碳源的饥饿条件下，通过以下所示的方法实施了来自aox启动子的诱导培养。在甲醇诱导培养(对照)中，向上述的确认到甘油耗尽的培养基中，添加54ml灭菌水、40ml的10%(w/v) L-组氨酸盐酸盐1水合物、和1.5ml的50mg/ml潮霉素B后，将培养液用14%(v/v)的氨水控制到pH6.5，添加8.5ml的100%甲醇，开始了甲醇诱导。然后，控制了培养液的pH值使甲醇诱导培养第3小时为pH6.75、第6.5小时以后为pH7。并且，从甲醇诱导培养的刚开始后，每天连续地流加12.5ml氮源流加液[酵母提取物300g/l、L-组氨酸盐酸盐1水合物80g/l]、37.5ml的80%(w/v)甘油直到培养结束日，在甲醇诱导培养24小时以后，每天间断地流加5.1-5.7ml的100%甲醇(最终浓度0.25-0.35%(v/v))。并且，在甲醇诱导培养第48、96、和144小时添加了1.5ml的50mg/ml潮霉素B。
另一方面，在使碳源耗尽的饥饿诱导培养中，向上述的确认到甘油耗尽的培养基中，添加40ml的10%(w/v) L-组氨酸盐酸盐1水合物和1.5ml的50mg/ml潮霉素B后，用14%(v/v)的氨水控制至pH6.5，开始了通过碳源耗尽状态的饥饿诱导培养(以下，称为“碳源饥饿诱导培养”)。控制了培养液的pH值使碳源饥饿诱导培养第3小时为pH6.75、第6.5小时以后为pH7。并且，从碳源饥饿诱导培养的刚开始后，每天连续流加了12.5ml氮源流加液[酵母提取物300g/l、L-组氨酸盐酸盐1水合物80g/l]、92ml的65%(w/v)山梨糖醇。在碳源饥饿诱导培养第24小时以后，每天连续流加了12.5ml氮源流加液、37.5ml 80%(w/v)甘油直到培养结束日。并且，在碳源饥饿诱导培养第48、96、和144小时，每天间断流加了1.5ml的50mg/ml潮霉素B。
各培养液通过离心分离(3000×g、4℃、5分钟)去除菌体，调制培养上清，以此作为HSA产生试样。关于已分泌生产的HAS的定量性比较，通过基于SDS-PAGE/CBB染色的染色强度比较了试样。将HAS的分泌生产量的定量结果示于图10。确认到：在碳源饥饿诱导培养中，与甲醇诱导培养比较，显示几乎同等的生产性。
产业上的可利用性
本发明可以用于抗原、抗体等医疗用蛋白质的制备领域。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均直接作为参考被纳入本说明书中。