一种基于量子点和PCR技术的DNA碱基数目检测的方法 【技术领域】
一种基于量子点和PCR技术的DNA碱基数目检测的方法，本发明是DNA碱基数目即长度检测的一种新方法，属于纳米生物技术领域。
背景技术
随着纳米技术向生命科学领域的不断渗透，利用纳米生物技术研究和解决其中的重大问题，推动纳米生物技术的发展，正成为当前一个重要的前沿领域之一。胶状的金纳米粒子(AuNPs)，由于其特殊的物理、化学性质和生物相容性，在生物电化学、材料学及生物医学等领域有很广泛的应用。
聚合酶链反应(PCR)是一种体外特定核酸序列扩增技术，是现代分子生物学的实验工作基础之一，在生命科学、遗传学和医学等领域发挥着重要作用。本发明是基于量子点荧光强度与DNA长度之间的关系，进行DNA碱基数目检测的新方法。本发明研究了基于纳米金与量子点表面的PCR，在PCR体系中，采用质粒λDNA作为模板，连接在金纳米粒子表面上的引物及连接在量子点表面的引物与变性后的模板DNA杂交，在dNTP和聚合酶的作用下，引物充分延伸，生成一条一端连有金纳米粒子，另一端连有荧光量子点的PCR产物DNA。经过多次的变性，退火，延伸后，生成一定浓度的同时连有金纳米粒子和荧光量子点的DNA。由于引物扩增片段的长度不同，纳米金与量子点之间的距离不同，使得量子点的荧光被金纳米粒子淬灭程度不同，从而建立DNA长度与量子点荧光强度之间的关系，进而进行DNA碱基数目的检测。实验结果表明：把F，R分别连接在金纳米粒子，量子点表面，可以进行PCR，而且，随着PCR扩增片段长度的变化，金纳米粒子对量子点的荧光淬灭程度也不同。
【发明内容】
本发明的目的是提供一种基于量子点荧光强度与DNA长度之间关系的DNA碱基数目检测的新方法。
本发明的技术方案：一种基于量子点和PCR技术的DNA碱基数目检测的方法，利用PCR扩增不同长度的DNA片段和量子点荧光强度之间的关系，进行DNA碱基数目检测，方法：(1)胶体金的制备；(2)胶体金分别与不同长度上游引物的偶联；(3)量子点分别与不同长度下游引物的偶联；(4)利用所制得的连金引物的偶联物及量子点与引物的偶联物进行PCR；(5)PCR产物进行琼脂糖电泳确证PCR扩增；(6)对PCR产物进行荧光测定；(7)DNA碱基数目检测；操作为：
(1)胶体金的制备：利用Frens法制备20nm的胶体金：
所用的玻璃仪器都强酸浸泡，双蒸水清洗，烘箱烘干备用；制备时，向洁净的三角烧瓶中加入100mL质量浓度为0.01％的氯金酸和洁净的搅拌子，中速搅拌，加热至沸腾，保持7～8min，一次性加入质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液2.5mL，边加热维持沸腾边搅拌，溶液颜色从淡黄色依次变成浅蓝黑色，至深蓝黑色，最后变成酒红色，当颜色不再变化后再继续加热15min使反应充分完全；最后，在搅拌的条件下，溶液冷却至室温，定容到100mL，制得胶体金，4℃保藏；
(2)胶体金分别与不同长度上游引物的偶联：将所制备的胶体金与引物F进行连接，得金纳米粒子-引物复合物，即AuNP-F-Primer，处理后备用；
所用不同扩增长度的上游引物分别为：
152bp-F：5’(SH)-GGAGGGCGTAACCGACAA-3’
297bp-F：5’(SH)-GCAGTTGCCGTTTATCTCACC-3’
594bp-F：5’(SH)-TGAGCGGATACGGCGTGAAC-3’
1003bp-F：5’(SH)-GGCCATAAAAGGTCTTGAGC-3’
将所制得的胶体金于10000rpm离心20min，弃上清，用灭菌水恢复至原体积的1/10，记为V，分别用上述4个引物进行如下操作：将上游引物浓度稀释至10μmol/L，以胶体金V：上游引物F体积比1∶1地比例混合，超声10s，使之混合均匀，室温静置24h，向其中加入2mol/L的NaCl溶液，使体系中的NaCl浓度达到0.05mol/L，继续室温静置24h，反应完毕，用7000rpm离心15min，弃上清，除去未连接在金纳米粒子表面的引物；滤饼用灭菌水定容至胶体金相等的体积V待用，将引物连接在金纳米粒子表面，构成金纳米粒子-引物复合物，即得到4种AuNP-F-Primer，4℃保藏备用；
(3)量子点QD分别与不同长度下游引物R的偶联：
所用不同扩增长度的下游引物分别为：
152bp-R：5’(NH2)-CCGCAGCAAACTCACCATT-3’
297bp-R：5’(NH2)-GGCATAGCGTCCTCACATTTC-3’
594bp-R：5’(NH2)-CGCGACCAGTCAACGTCTGA-3’
1003bp-R：5’(NH2)-CGGCATTGTAGGATTTGGTA-3’
所用量子点：为经巯基乙酸修饰的CdTe量子点，由中国科学院化学研究所提供；
首先根据EDC法活化量子点，在pH 7.4、0.05mol/L Tris-HCl体系中，按摩尔比1∶20∶100加入量子点，N-羟基琥珀酰亚胺NHS，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC·HCl，超声反应6～8min，然后分别加入上述4种不同扩增长度的下游引物，偶联反应24h，构成量子点与引物的偶联物，即得到4种相应的QD-R-Primer，4℃保藏备用；
(4)利用所制得的连金引物的偶联物及量子点与引物的偶联物进行PCR扩增：以λDNA为模板，采用分别制得的4种引物AuNP-F-Primer及4种bp长度相应的QD-R-Primer进行PCR；
PCR反应体系：dNTPs 1μL(购自上海生工)，0.5个单位的Taq DNA聚合酶(购自上海生工)，λDNA模板质粒0.5μL(购自宝成生物工程有限公司)，PCR反应缓冲液5μL(购自上海生工)，分别取bp长度相应的AuNP-F-Primer 4μL和QD-R-Primer 4μL，加灭菌水至总体积为50μL；
扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，5或10或20个循环；72℃再延伸10min；10℃保存，得PCR产物；
(5)PCR产物进行琼脂糖电泳确证PCR扩增：取5μL PCR产物，用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析，采用前染，即在溶胶前期加入溴化乙啶EB，浓度为0.5μg/mL，电压U＝100V，时间T＝50min，进行电泳，确证PCR扩增；
(6)对PCR产物进行荧光测定：利用Wallac 1420型荧光测定仪进行荧光测定，得到不同PCR扩增长度的DNA片段和量子点荧光强度之间的关系曲线；
(7)DNA碱基数目检测：对于长度在150～1000bp的一个DNA序列，其一端连上AuNPs，另一端连上QD，利用Wallac 1420型荧光测定仪进行荧光测定，测得发光强度，根据关系曲线上所对应的值，求出所测DNA序列的碱基数目。
本发明的有益效果：
根据分别连接在DNA两端的金纳米粒子与量子点之间距离不同，金纳米粒子对量子点荧光强度的淬灭程度不同，从而建立荧光强度与DNA的长度之间的关系，进而达到DNA碱基数目测定的目的。
【附图说明】
图1：20nm金纳米粒子。
图2：金纳米粒子与上游引物连接。
图3：量子点与下游引物连接。
图4：PCR产物电泳图。
图5：不同长度DNA-linker与PCR产物荧光强度的关系曲线。
【具体实施方式】
实施例1：
(1)胶体金的制备：利用Frens法制备20nm左右的胶体金。
所用的玻璃仪器都强酸浸泡，双蒸水清洗，烘箱烘干备用；制备时，向洁净的三角烧瓶中加入100mL质量浓度为0.01％的氯金酸和洁净的搅拌子，中速搅拌，加热至沸腾，保持7～8min，一次性加入质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液2.5mL，边加热维持沸腾边搅拌，溶液颜色从淡黄色依次变成浅蓝黑色，至深蓝黑色，最后变成酒红色，当颜色不再变化后再继续加热15min使反应充分完全；最后，在搅拌的条件下，溶液冷却至室温，定容到100mL，制得胶体金，4℃保藏；
(2)胶体金与上游引物的偶联：
所用不同扩增长度的上游引物为：
152bp-F：5’(SH)-GGAGGGCGTAACCGACAA-3’
297bp-F：5’(SH)-GCAGTTGCCGTTTATCTCACC-3’，
594bp-F：5’(SH)-TGAGCGGATACGGCGTGAAC-3’
1003bp-F：5’(SH)-GGCCATAAAAGGTCTTGAGC-3’
将所制得的胶体金于10000rpm离心20min，弃上清，用灭菌水恢复至原体积的1/10，记为V，分别将上游引物浓度稀释至10μmol/L，以胶体金V：上游引物F体积比1∶1的比例分别混合，超声10s左右，使之混合均匀，室温静置24h，向其中加入2mol/L的NaCl，最后体系中的NaCl浓度达到0.05mol/L，继续室温静置24h，反应完毕，用7000rpm离心15min，弃上清，除去未连接在金纳米粒子表面的引物，滤饼用灭菌水定容至胶体金的体积V待用，将引物连接在纳米粒子表面，构成金纳米粒子-引物复合物即AuNP-F-Primer，4℃保藏备用；
(3)量子点与下游引物的偶联：
所用不同扩增长度的下游引物分别为：
152bp-R：5’(NH2)-CCGCAGCAAACTCACCATT-3’
297bp-R：5’(NH2)-GGCATAGCGTCCTCACATTTC-3’
594bp-R：5’(NH2)-CGCGACCAGTCAACGTCTGA-3’
1003bp-R：5’(NH2)-CGGCATTGTAGGATTTGGTA-3’
所用量子点：经巯基乙酸修饰的CdTe量子点，中国科学院化学研究所提供。
首先根据EDC法活化量子点，在Tris-Hcl(pH 7.4、0.05mol/L)体系中，按摩尔比1∶20∶100依次加入量子点，NHS，EDC·HCl，超声反应6～8min，然后分别加入上述4种不同片段长度的引物，偶联反应24h，即得QD-R-Primer。
(4)PCR：以λDNA为模板，采用制得的引物AuNP-F及QD-R进行PCR。
PCR反应体系：dNTPs 1μL(购自上海生工)，0.5个单位的Taq DNA聚合酶(购自上海生工)，λDNA模板质粒0.5μL(购自宝成生物工程有限公司)，反应缓冲液(购自上海生工)5μL，分别取AuNP-F-Primer 4μL和QD-R-Primer4μL，加灭菌水至总体积为50μL；
扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，5(10，20)个循环；72℃再延伸10min；10℃保存，得PCR产物；
(5)琼脂糖电泳
取5μL PCR产物，用3％琼脂糖凝胶电泳进行分析，采用前染，即在溶胶前期加入EB(溴化乙啶)，浓度约为0.5μg/mL，电压U＝100V，时间T＝50min，进行电泳，确证PCR扩增。
(6)对PCR产物进行荧光测定：利用Wallac 1420型荧光测定仪进行荧光测定，得到不同PCR扩增长度的DNA片段和量子点荧光强度之间的关系曲线。
实施例2
对扩增片段长度为200bp的PCR产物，其中一端连上AuNPs，另一端连上QD，利用Wallac 1420型荧光测定仪进行荧光测定，测得发光强度为475，根据关系曲线上所对应的值为200bp，所测DNA序列的碱基数目与扩增片段长度为200bp相符合。
实施例3
对于长度在150～1000bp的一个DNA序列，其中一端连上AuNPs，另一端连上QD，测得发光强度是320，根据关系曲线上相对应的值，得到DNA碱基数是482bp。