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1、(10)申请公布号 CN 102533744 A (43)申请公布日 2012.07.04 CN 102533744 A *CN102533744A* (21)申请号 201110451711.7 (22)申请日 2011.12.29 C12N 15/11(2006.01) C12N 15/63(2006.01) (71)申请人 中国科学院深圳先进技术研究院 地址 518055 广东省深圳市南山区西丽大学 城学苑大道 1068 号 (72)发明人 罗振 潘建青 王立平 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理 有限公司 44224 代理人 吴平 (54) 发明名称 基因表达盒及含有该基因。
2、表达盒的重组表达 载体 (57) 摘要 本发明涉及一种基因表达盒及其应用， 该基 因表达盒包括依次连接的无细胞特异性的启动 子、 LoxP 位点、 终止子、 细胞特异性启动子、 Cre 重组酶基因、 终止子、 LoxP 位点、 目的基因及终止 子， 其中， 两个 LoxP 位点是同向的。与传统技术 相比， 该基因表达盒无需使用转基因动物就能实 现目的基因的高效表达， 同时保证细胞的选择性 ； 且无需使用多个表达载体， 只要按要求将基因表 达盒克隆到实验所需的表达载体就可以达到实验 目的， 节省了实验步骤和时间。 (51)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 。
3、6 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 6 页 1/1 页 2 1. 一种基因表达盒， 其特征在于， 包括依次相连的无细胞特异性的启动子、 LoxP 位点、 终止子、 细胞特异性启动子、 Cre 重组酶基因、 终止子、 LoxP 位点、 目的基因及终止子， 其中， 两个 LoxP 位点同向设计。 2.如权利要求1所述的基因表达盒， 其特征在于， 所述无细胞特异性的启动子为CMV启 动子、 EF1-a 启动子或 PGK 启动子。 3.如权利要求2所述的基因表达盒， 其特征在于， 所述CMV启动子的基因序列为序列。
4、表 中的 SEQ ID NO ： 1。 4. 如权利要求 1 所述的基因表达盒， 其特征在于， 所述 LoxP 位点的基因序列为序列表 中的 SEQ ID NO ： 2。 5. 如权利要求 1 所述的基因表达盒， 其特征在于， 所述终止子为 SV40 poly A 终止子。 6.如权利要求5所述的基因表达盒， 其特征在于， 所述SV40 poly A终止子的序列为序 列表中的 SEQ ID NO ： 3。 7.如权利要求1所述的基因表达盒， 其特征在于， 所述Cre重组酶基因序列为序列表中 的 SEQ ID NO ： 4。 8. 含有权利要求 1-7 中任一项所述基因表达盒的重组表达载体。 9。
5、. 如权利要求 8 所述的重组表达载体， 其特征在于， 所述载体为质粒或病毒。 权 利 要 求 书 CN 102533744 A 2 1/5 页 3 基因表达盒及含有该基因表达盒的重组表达载体 【技术领域】 0001 本发明涉及基因工程领域， 尤其涉及一种基因表达盒及含有该基因表达盒的重组 表达载体。 【背景技术】 0002 传统的转基因方法主要采用病毒携带特异性的启动子来实现目的基因在靶细胞 类型中的表达， 其主要方法是克隆出在某一类群细胞中特异性表达的蛋白质的启动子序 列， 然后亚克隆到携带有目的基因的病毒转移载体上实现基因的特异性表达。该方法在某 些情况下能够取得较好的效果， 但是多数情。
6、况下却得不到理想的效果， 主要是因为所采用 的特异性启动子在多数情况下表达效率比较低， 同时又很难找到其他可替代的特异性启动 子， 那么要提高目的基因的表达效率同时又兼顾细胞选择性成为急需解决的问题。 【发明内容】 0003 基于此， 有必要提供一种表达效率较高且细胞特异性较强的基因表达盒。 0004 一种基因表达盒， 包括依次相连的无细胞特异性的启动子、 LoxP 位点、 终止子、 细 胞特异性启动子、 Cre 重组酶基因、 终止子、 LoxP 位点、 目的基因及终止子， 其中， 两个 LoxP 位点是同向的。 0005 在优选的实施方式中， 所述无细胞特异性的启动子为 CMV 启动子、 E。
7、F1-a 启动子或 PGK 启动子。 0006 在优选的实施方式中， 所述 CMV 启动子的基因序列为序列表中的 SEQ ID NO ： 1。 0007 在优选的实施方式中， 所述 LoxP 位点的基因序列为序列表中的 SEQ ID NO ： 2。 0008 在优选的实施方式中， 所述终止子为 SV40 poly A 终止子。 0009 在优选的实施方式中， 所述 SV40 poly A 终止子的序列为序列表中的 SEQ ID NO ： 3。 0010 在优选的实施方式中， 所述 Cre 重组酶基因序列为序列表中的 SEQ ID NO ： 4。 0011 包含上述特征的基因表达盒可以用于构建重。
8、组表达载体， 从而用于疾病的诊断或 治疗等领域。优选的， 使用的表达载体可以为质粒或病毒。 0012 当该基因表达盒导入到活体动物的某个组织后， 无细胞特异性的启动子的转录被 下游终止子提前终止， 具有细胞特异性的启动子会在靶细胞中表达 Cre 重组酶， 非靶细胞 中不表达， Cre 重组酶会识别基因表达盒上的 LoxP 位点， 将两同向 LoxP 位点之间的序列剪 切掉， 从而开启了无细胞特异性的启动子的转录， 实现目的基因的高效表达。 与传统技术相 比， 该基因表达盒无需使用转基因动物就能实现目的基因的高效表达， 同时保证细胞的选 择性 ； 且无需使用多个表达载体， 只要按要求将基因表达盒。
9、克隆到实验所需的表达载体就 可以达到实验目的， 节省了实验步骤和时间。 【附图说明】 说 明 书 CN 102533744 A 3 2/5 页 4 0013 图 1 为一实施方式的基因表达盒的结构示意图 ； 0014 图 2 为具体实施例部分设计的基因表达盒的结构示意图 ； 0015 图 3 为 pMD18T-CS 载体构建的技术路线图 ； 0016 图 4 为 pMD18T-CS 载体的酶切鉴定结果图 ； 0017 图 5 为 pMD18T-CCS 载体构建的技术路线图 ； 0018 图 6 为 pMD18T-CCS 载体的酶切鉴定结果图 ； 0019 图 7 为 pMD18T-CCST 载。
10、体构建的技术路线图 ； 0020 图 8 为 pMD18T-CCST 载体的酶切鉴定结果图 ； 0021 图 9 为 pShuttle-CCS 载体构建的技术路线图 ； 0022 图 10 为 pShuttle-CCS 载体的酶切鉴定结果图 ； 0023 图 11 为 pshuttle-CCS-ChR2 载体构建的技术路线图 ； 0024 图 12 为 pshuttle-CCS-ChR2 载体的酶切鉴定结果图 ； 0025 图 13 为含有该基因表达盒的腺病毒在体内表达 ChR2 的检测结果图。 【具体实施方式】 0026 下面主要结合附图及具体实施例对基因表达盒及含有该基因表达盒的重组表达 。
11、载体作进一步详细的说明。 0027 如图 1 所示， 一实施方式的基因表达盒， 包括依次连接的无细胞特异性的启动子 (Promoter 1)、 LoxP 位点、 终止子 (stop)、 细胞特异性启动子 (Promoter2)、 Cre 重组酶基 因、 终止子 (stop)、 LoxP 位点、 目的基因 (Target gene) 及终止子 (stop)， 其中， 两个 LoxP 位点是同向的。 0028 本实施方式的无细胞特异性的启动子优选强启动子， 如 CMV 启动子、 EF1-a 启动子 或 PGK 启动子等， 其中 CMV 启动子的基因序列为序列表中的 SEQ ID NO ： 1。该强。
12、启动子可 以在众多类型的细胞 ( 靶细胞或者非靶细胞 ) 中启动目的基因的表达， 用来高效的表达目 的基因。具体实施过程中可以根据需求克隆相应的强启动子序列到该位置。 0029 Cre/LoxP 位点重组酶系统是在体内外进行遗传表达的有力工具， Cre 重组酶能够 识别 DNA 序列上的 LoxP 位点， 当 DNA 序列中有两个同向的 LoxP 位点时， Cre 重组酶会将位 于 LoxP 位点之间的 DNA 序列剪切掉， 从而关闭或开启基因的表达。其中， LoxP 位点的基因 序列如序列表中的 SEQ ID NO ： 2 所示， Cre 重组酶基因序列如序列表中的 SEQ ID NO ： 。
13、4 所 示。 0030 终止子可以采用常用的SV40 polyA(简称pA)终止序列， 其序列如序列表中的SEQ ID NO ： 3 所示。 0031 细胞特异性启动子只能在特定类型的细胞 ( 简称靶细胞 ) 中表达相应的目的基 因， 在非靶细胞中则没有启动目的基因表达的功能。 一般情况下， 其在特定细胞中启动效率 较低， 其对应的目的基因的表达效率也较低。两个启动子同时使用 ( 即无细胞特异性的启 动子和细胞特异性启动子 )， 并且结合 Cre/LoxP 系统， 让细胞特异性的启动子在靶细胞内 表达 Cre 重组酶， 当 Cre 重组酶表达后， 就会在靶细胞内将表达盒中的两个同向 LoxP 。
14、位点 之间的序列剪切掉， 从而开启了强启动子的转录， 实现目的基因的高效表达。 0032 当具有图1结构的基因表达盒的表达载体进入动物特定组织后， 位于LoxP位点中 说 明 书 CN 102533744 A 4 3/5 页 5 的细胞特异性启动子就会选择性的在靶细胞类群中表达 Cre 重组酶， 而其它细胞类群中则 不表达 Cre 重组酶。尽管在细胞特异性启动子前设有无细胞特异性的启动子， 在一般情况 下其会启动下游序列的转录， 但在该启动子后面的目的基因前设计有终止子， 从而提前终 止了它的转录， 只有这段终止序列被剔除后， 无细胞特异性的启动子才能发挥作用。 当靶细 胞中表达 Cre 重组。
15、酶后， 基因表达盒中的两个同向 LoxP 位点被 Cre 酶识别， 从而将其间的 DNA 序列剪切掉， 被剪切的基因表达盒在 DNA 序列上发生重大变化， 无细胞特异性的启动子 转录被提前终止的结构被解除， 开始下游目的基因的高效表达。 0033 包含上述特征的基因表达盒可以用于构建重组表达载体， 从而用于疾病的诊断或 治疗等领域。优选的， 使用的表达载体可以为质粒或病毒。 0034 下面以具体的实施例来说明如何实现目的基因在靶细胞中高效表达 ： 0035 通常在五羟色胺能神经元细胞内表达光敏蛋白 ChR2(channelrhodopsin-2) 是选 取色氨酸羟化酶的启动子作为表达光敏蛋白 。
16、ChR2 的启动子， 因为只有这种酶特异性的表 达在五羟色胺能神经元细胞中， 但是使用该启动子后， 目的基因的表达十分微弱， 很难检测 到， 对于实验几乎是没有意义。研究发现色氨酸羟化酶在五羟色胺能神经元细胞中的表达 水平本身很低， 即是色氨酸羟化酶启动子是一个弱启动子， 自然表达效率很低。 0036 本实施例的无细胞特性的启动子选用巨细胞病毒启动子 (CMV promoter)， 细胞特 异性启动子选用色氨酸羟化酶启动子 (TPH promoter)。其具体构建方法如下 ： 0037 一、 实验材料 ： 0038 1. 质粒和菌株 ： 0039 pMD 18T-simple 及连接酶 sol。
17、ution I 购自 takara 公司 ； 0040 pshuttle 载体及腺病毒包装系统购自 Stratagene 公司 ； 0041 大肠杆菌感受态 (Escherichia coli)DH5a 购自 takara 公司。 0042 2. 分子克隆主要相关试剂 ： 0043 限制性内切酶 Bgl II、 EcoR V、 Kpn I、 Not I、 Xba I 和 Sac I 购自 takara 公司， Pac I、 Pme I、 Xma I 购自 NEB 公司。 0044 3. 细胞株及实验动物 ： 0045 人胚胎肾细胞 HEK293 购自于美国 ATCC 细胞公司 ； 0046 C。
18、57 小鼠购自于广东省医学实验动物中心。 0047 4. 腺病毒包转所需试剂 ： 0048 DMEM， 购自于 GIBCO 公司 ； 0049 胎牛血清 (FBS)， 购自于 GIBCO 公司 ； 0050 胰酶， 购自于 GIBCO 公司 ； 0051 磷酸盐缓冲液 (PBS)， 购自于 Hyclone 公司 ； 0052 转染试剂(FuGENE HD transfection reagent)、 细胞培养皿及移液管购自coming 公司。 0053 二、 实验方法及数据 ： 0054 1.LoxP、 stop、 SV40 ployA 及 Cre 重组酶基因的 DNA 序列合成及克隆 005。
19、5 利用基因合成技术合成如图 2 所示的 DNA 序列， 将该序列插入到 pMD18T-simple 载体上， 经酶切鉴定该序列确实插入到载体中， 并将该载体命名为 pMD18T-CS。 说 明 书 CN 102533744 A 5 4/5 页 6 0056 pMD18T-CS 载体构建的技术路线图如图 3 所示。pMD18T-CS 酶切鉴定 Bgl II 和 EcoR V， 酶切鉴定结果如图 4 所示， 得到大约 1.7kb 左右的片段和 2.6kb 的片段， 证明构建 成功， 其中， 鉴定过程中使用的 Marker 为 1Kb DNA ladder。 0057 2.CMV promoter。
20、 的克隆 0058 利用PCR技术， 以pCDNA3.1载体为模板， 扩增CMV promoter， 将扩增后的片段插入 到pMD18T-CS载体的Bgl II与SacI之间， 并将构建的载体命名为pMD18T-CCS， 构建过程如 图 5 所示。 0059 pMD18T-CCS酶切鉴定结果 ： 如图6所示， 经Bgl II和Sac I酶切， 得到约4.3Kb和 600bp 左右 ( 即 CMV promoter 片段的长度 ) 的片段， 经测序证实该序列正确， 其中， 鉴定过 程中使用的 Marker 为 1Kb DNA ladder。 0060 3.TPH promoter 的克隆 006。
21、1 提取小鼠神经元细胞的基因组 DNA， 以该基因组 DNA 为模板利用 PCR 技术扩增 TPH promoter， 并将该序列插入到 pMD18T-CCS 载体的 Sbf I 与 Xma I 之间， 构建过程如图 7 所 示， 将构建的载体命名为 pMD18T-CCST。 0062 pMD18T-CCST酶切鉴定结果 ： 如图8所示， 经Xma I和Sbf I酶切， 得到约4.9Kb和 1KbTPH 启动子左右的片段， 测序证实该片段正确插入， 其中， 鉴定过程中使用的 Marker 为 1Kb DNA ladder。 0063 4. 将含有 TPH promoter 的表达盒 ( 即 p。
22、MD18T-CCST) 克隆到 pshuttle 载体上 0064 利用 PCR 的方法以 pMD18T 为模板， 扩增含有 TPH promoter 的表达盒， 将该片段插 入到 pshuttle 载体的 Kpn I 与 Not I 之间， 构建过程如图 9 所示， 并将构建的载体命名为 pshuttle-CCS。 0065 pshuttle-CCS 酶切鉴定结果 ： 如图 10 所示， 经 Kpn I 和 Not I 酶切， 得到约 3.2Kb 和 6.6Kb 左右的片段， 经测序证实该序列插入正确， 其中， 鉴定过程中使用的 Marker 为 1Kb DNA ladder。 0066 5。
23、.ChR2 及 SV40polyA 克隆到 pshuttle-CCS 载体上 0067 利用 PCR 技术或者基因合成的方式获得 ChR2 与 SV40polyA 序列， 将该序列插入到 pshuttle-CCS 的 Xba I 和 EcoRV 之间， 并将构建的载体命名为 pshuttle-CCS-ChR2 构建过 程如图 11 所示。 0068 pshuttle-CCS-ChR2 酶切鉴定结果 ： 如图 12 所示， 经 Xba I 和 EcoR V 酶切， 得到 约1.3Kb和9.8Kb左右的片段， 测序证实该序列正确的插入其中， 鉴定过程中使用的Marker 为 1Kb DNA lad。
24、der。 0069 6. 将上面构建好的载体利用腺病毒包装技术， 制备腺病毒， 将包装好的病毒利用 立体定位仪注射到小鼠的实验脑区， 腺病毒会感染注射位点周围的部分区域， 在五羟色胺 能神经元细胞类群中， 色氨酸羟化酶启动子会启动 Cre 重组酶的低效率转录， Cre 重组酶 会表达在五羟色胺能神经元中， 非五羟色胺能神经元中则不能表达 Cre 重组酶， Cre 重组 酶表达后会识别表达盒结构上的 LoxP 位点， LoxP 位点中间的 DNA 序列被剪切， 同时 CMV promoter 下游的终止序列也被剪切， 从而实现了光敏蛋白 ChR2 在强启动子下的高效表达。 0070 将具有该基因。
25、表达盒并携带有 ChR2 基因的腺病毒载体构建好之后， 利用该载体 包装腺病毒， 将包装好的腺病毒利用立体定位注射方式， 注射 C57 小鼠的大脑的中缝核 说 明 书 CN 102533744 A 6 5/5 页 7 (DRN) 区域， 四天后， 取出该中缝核区域的组织提取蛋白， 免疫印迹检测 ChR2 的表达情况。 以不具有该基因表达盒的腺病毒载体为对照。检测结果如图 13 所示， 其中， Lane1 ： 未注射 病毒 C57， lane 2 ： 注射含有基因表达盒的病毒， lane3 ： 注射只含有 ChR2 基因的病毒， 证明 ChR2 基因在小鼠体内成功表达， 且 lane 2 条带亮。
26、度明显强于 lane 1 和 lane 3， 说明 ChR2 基因在小鼠体内高效表达。 0071 当该基因表达盒导入到活体动物的某个组织后， 无细胞特异性的启动子的转录被 下游终止子提前终止， 具有细胞特异性的启动子会在靶细胞中表达 Cre 重组酶， 非靶细胞 中不表达， Cre 重组酶会识别基因表达盒上的 LoxP 位点， 将两同向 LoxP 位点之间的序列剪 切掉， 从而开启了无细胞特异性的启动子的转录， 实现目的基因的高效表达。 与传统技术相 比， 该基因表达盒无需使用转基因动物就能实现目的基因的高效表达， 同时保证细胞的选 择性 ； 且无需使用多个表达载体， 只要按要求将基因表达盒克隆。
27、到实验所需的表达载体就 可以达到实验目的， 节省了实验步骤和时间。 0072 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式， 其描述较为具体和详细， 但并 不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是， 对于本领域的普通技术人员 来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干变形和改进， 这些都属于本发明的保 护范围。因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。 说 明 书 CN 102533744 A 7 1/2 页 8 0001 0002 序 列 表 CN 102533744 A 8 2/2 页 9 序 列 表 CN 102533744 A 9 1/6 页 10 图 1 图 2 图 3 说 明 书 附 图 CN 102533744 A 10 2/6 页 11 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 102533744 A 11 3/6 页 12 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 102533744 A 12 4/6 页 13 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 102533744 A 13 5/6 页 14 图 10 图 11 说 明 书 附 图 CN 102533744 A 14 6/6 页 15 图 12 图 13 说 明 书 附 图 CN 102533744 A 15 。