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CYP3A5基因SNP检测特异性引物、液相芯片和检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及CYP3A5基因SNP检测特异性引物、液相芯片和检测方法。
技术背景
细胞色素P450酶系(cytochrome P450 enzyme system，CYPs)是参与外源化合物解毒和内源化合物代谢的重要酶系，主要有CYP1、CYP2、CYP3三大家族。CYP3A5是CYP3A亚族中重要的一种同工酶。其遗传多态性影响着许多经CYP3A介导的药物，如地尔硫、阿芬太尼等在肝微粒体中的氧化代谢，该酶的活性存在明显的个体差异，对不同个体的药物治疗作用和不良反应及药物毒性产生重要影响，是引起个体及种族间对同一底物代谢能力不同的原因之一。其在药物的相互作用中发挥至关重要的作用，并与肿瘤化疗耐药密切相关。
CYP3A5野生型定义为CYP3A5*1，同时存在位点6986A和31611C，只有携带至少一个CYP3A5*1等位基因的个体才有CYP3A5的蛋白表达。CYP3A5突变型按发现的早晚顺序命名，迄今已发现了CYP3A5*2、CYP3A5*3、CYP3A5*4、CYP3A5*5、CYP3A5*6、CYP3A5*7、CYP3A5*8、CYP3A5*9等多个突变等位基因。其中，存在于第3内含子6986位点的SNP(A→G)最为重要，定义为CYP3A5*3。该突变引起可变剪切缺失，产生不稳定蛋白质，从而使突变型纯合子个体，即基因型为CYP3A5*3/*3的携带者不表达CYP3A5蛋白，使CYP3A5酶活性降低或消失。CYP3A5*3等位基因突变在各种族人群中的发生频率最高，是人群中CYP3A5基因最主要的多态性，中国人群的突变率高达71％-76％。CYP3A5第11个外显子的1280位点存在单碱基突变(C→A)，即CYP3A5*2，该位点导致第398位点上的色氨酸变为天冬酰氨，并产生Tsp509酶切位点，但在亚洲人群中几乎没有找到发生率。CYP3A5*4为发生在外显子7的14665A＞G突变，CYP3A5*5为发生在内含子5的12952T＞C突变，两者在中国人群中发生率约为1％；CYP3A5*6是发生在外显子7中的14690G＞A突变，使剪接产生改变，进而影响CYP3A5的酶活；而CYP3A5*7是发生在内含子3中的27131_27132insT，致使346位阅读框发生移动，其产生的移码突变将影响CYP3A5*3的表达，进而影响蛋白酶活，并以10％的频率在非洲和美洲人群中出现；CYP3A5*8为外显子2上的3699C＞T突变，使第28位的精氨酸突变成半胱氨酸(R28C)；CYP3A5*9为外显子10上的19386G＞A突变，使第337位的丙氨酸突变成苏氨酸(A337T)，在中国人群中发生率为2％。
目前国内外只有少量检测CYP3A5基因多态性的产品上市，主要是使用实时荧光定量PCR技术的CYP3A5，而大部分仍处于实验研究阶段。已报道检测CYP3A5多态性的方法主要有传统固相芯片和实时荧光定量PCR，其中，传统固相芯片价格昂贵，敏感性不高，检测结果的可重复性差，而实时荧光定量PCR技术存在灵敏度低，样品易污染、假阳性率高的缺点，同时由于检测通量存在局限性，不能满足检测应用的需要。
发明内容
本发明的目的之一是提供CYP3A5基因SNP检测液相芯片。该液相芯片可用于检测CYP3A5基因的正常基因型以及五种常见等位基因型CYP3A5*3、CYP3A5*6、CYP3A5*7、CYP3A5*8、CYP3A5*9的变异。
实现上述目的的技术方案如下：
一种CYP3A5基因SNP检测液相芯片，主要包括有：
(A).针对CYP3A5基因的SNP位点分别设计的ASPE引物对：每种ASPE引物由5’端的tag序列和3’端针对目的基因SNP位点的特异性引物序列组成，所述特异性引物序列分别为：针对A6986G位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12、针对G14690A位点的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14、针对27131_27132insT位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16、针对C3699T位点的SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18、和/或针对G19386A位点的SEQ ID NO.19及SEQ IDNO.20，所述tag序列选自SEQ ID NO.1-10中的序列；
(B).分别包被有特异的anti-tag序列的微球，上述每种微球具有不同颜色编码；所述anti-tag序列选自SEQ ID NO.21～SEQ ID NO.30中的序列，且所述anti-tag序列能相应地与(A)中所选的tag序列互补配对；
(C).用于扩增具有A6986G、G14690A、27131_27132insT、C3699T、和/或G19386A SNP位点的CYP3A5基因目标序列的扩增引物。
优选地，所述扩增引物为：针对A6986G位点的SEQ ID NO.31及SEQ ID NO.32、针对G14690A位点的SEQ ID NO.33及SEQ ID NO.34、针对27131_27132insT位点的SEQ ID NO.35及SEQ ID NO.36、针对C3699T位点的SEQ ID NO.37及SEQ ID NO.38、和/或针对G19386A位点的SEQ ID NO.39及SEQ ID NO.40。
优选地，所述ASPE引物对为：由SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.11组成的序列及由SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.12组成的序列、由SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.13组成的序列及由SEQ IDNO.4和SEQ ID NO.14组成的序列、由SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.15组成的序列及由SEQ IDNO.6和SEQ ID NO.16组成的序列、由SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.17组成的序列及由SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.18组成的序列、和/或由SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.19组成的序列及由SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.20组成的序列。
优选地，所述anti-tag序列与微球连接中间还设有间隔臂序列。
本发明的另一目的是提供使用上述液相芯片对CYP3A5基因SNP进行检测的方法。
具体技术方案如下：
一种使用上述液相芯片对CYP3A5基因SNP检测的方法，主要包括以下步骤：
(一)PCR扩增待测样品DNA；
(二)PCR反应产物用ExoSAP-IT试剂盒进行酶切处理；
(三)用所述ASPE引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记；
(四)将对应ASPE引物的包被有特异的anti-tag序列的微球与上述延伸反应后的产物进行杂交反应；
(五)杂交反应后的产物与链霉亲和素-藻红蛋白进行反应；
(六)通过荧光检测仪检测。
本发明的另一目的是提供一种用于CYP3A5基因SNP检测的特异性引物。
具体技术方案如下：
一种用于CYP3A5基因SNP检测的特异性引物，包括有：针对A6986G位点的SEQ ID NO.11及SEQ ID NO.12、针对G14690A位点的SEQ ID NO.13及SEQ ID NO.14、针对27131_27132insT位点的SEQ ID NO.15及SEQ ID NO.16、针对C3699T位点的SEQ ID NO.17及SEQ ID NO.18、和/或针对G19386A位点的SEQ ID NO.19及SEQ ID NO.20。
本发明的主要优点在于：
1.本发明所提供的检测方法与测序法的吻合率高达100％。所制备的CYP3A5基因SNP检测液相芯片具有非常好的信号-噪声比，并且所设计的探针以及anti-tag序列之间基本上不存在交叉反应，可实现多个SNP位点的并行检测。
2.本发明设计的ASPE特异性引物具有非常好的特异性，能准确区分各种型别的基因型，能够在均一的反应条件下进行杂交反应，且各种引物、探针之间基本不存在非特异性结合。
3.本发明的检测方法步骤简单，一步多重PCR即可完成五个具有SNP位点的目标序列的扩增，避免了反复多次PCR等复杂操作过程中存在的诸多不确定因素，因而可大大提高检测准确率，体现了精确的同时定性、定量分析特征，从而使检测的灵敏度进一步得到提高，检测结果更加准确可靠。同时，多种ASPE特异性引物的组合使用使液相芯片和检测方法形成一个检测效果完好的系统。
具体实施方式
实施例1CYP3A5基因SNP检测液相芯片，主要包括有：
一、ASPE引物
针对CYP3A5的五种常见SNP位点：A6986G、G14690A、27131_27132insT、C3699T、G19386A，分别设计特异性的引物序列。ASPE引物由“Tag+特异性引物序列”组成。ASPE引物序列如下表所示：
表1ASPE引物序列(Tag+特异性引物序列)


每条ASPE引物包括两个部分，5’端为针对相应微球上anti-tag序列的特异性tag序列，3’端为突变型或野生型特异性引物序列(如上述表1所示)。所有ASPE引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
二、anti-tag序列包被的微球
根据所设计的ASPE特异性引物序列，选择tag序列，最大限度地减少各微球的anti-tag序列之间以及tag与ASPE特异性引物序列可能形成的二级结构，选择的10种微球编号与微球上相应的anti-tag序列如表2所示：
表2微球编号与微球上相应的anti-tag序列

选择的10种微球购自美国Luminex公司，将anti-tag序列包被与微球上。anti-tag序列与微球之间连接有5-10个T的间隔臂序，即在每个anti-tag序列前加上一段5-10个T的间隔臂序列，anti-tag序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。将合成的anti-tag序列用灭菌ddH₂O配成100nmol/ml的贮存液。所述间隔臂为用于将anti-tag与微球表面间隔开来或是将anti-tag置于亲水性环境中的序列。通过在anti-tag序列与微球之间设置适当长度的间隔臂序列，可减少空间位阻，提高杂交反应的效率以及杂交反应的特异性。常见的间隔臂序列包括多聚dT，即poly(dT)，寡聚四聚乙二醇以及(CH2)n间隔臂(n≥3)，如(CH2)12、(CH2)18等。另外，如果存在poly(dA)干扰，还可以用poly(TTG)作为间隔臂。本发明间隔臂优选为5-10个T。
微球包被的过程如下：
分别取5×10⁶个上述编号的羧基化的微球(购自Luminex公司)悬浮于50ul 0.1mol/L的MES溶液中(pH4.5)，加入10ul合成的anti-tag分子(100nmol/ml)。配制10ng/ml的EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide)(购自Pierce Chemical公司)工作液。往微球悬液中加入2.5ul的EDC工作液，恒温孵育30分钟，再加入2.5ul的EDC工作液，再恒温孵育30分钟。反应结束后，用0.02％的Tween-20洗涤一次，再用0.1％的SDS液洗涤一次。将洗涤后的包被有anti-tag序列的微球重悬于100ul的Tris-EDTA溶液[10mmol/L Tris(pH8.0)，1mmol/LEDTA中，2-8℃避光保存。
三、扩增出具有SNP位点的目标序列的引物
目标检测CYP3A5的五种基因型的常见SNP位点：CYP3A5*3(A6986G)、CYP3A5*6(G14690A)、CYP3A5*7(27131_27132insT)、CYP3A5*8(C3699T)、CYP3A5*9(G19386A)，涉及到5个单核苷酸多态性位点。利用Primer5.0设计五对引物(见表3)，分别扩增出五条具有SNP位点的目标序列。
表3扩增出具有SNP位点的目标序列的引物


所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。合成后的每条引物分别用10mmol/L Tris Buffer配制成100pmol/mL的贮存液。
实施例2运用实施例1所述CYP3A5基因SNP检测液相芯片对样本的检测
所述各种溶液的配方如下：
50mM的MES缓冲液(pH5.0)配方(250ml)：

  试剂  来源  终浓度 每250ml的用量  MES(2[N-Morpholino]  ethanesulfonic acid)  Sigma M-2933  0.05M 2.44g
  试剂  来源  终浓度 每250ml的用量  5MNaOH  Fisher SS256-500  --- 5滴
2×Tm杂交缓冲液
  试剂  来源  终浓度 每250ml的用量  1MTris-HCl，pH8.0  SigmaT3038  0.2M 50ml  5MNaCl  Sigma S5150  0.4M 20ml  Triton X-100  Sigma T8787  0.16％ 0.4ml
过滤后贮存于4℃。
ExoSAP-IT试剂盒购自美国USB公司。
生物素标记的dCTP购自上海生工生物工程技术服务有限公司。
一、样本的DNA提取：
参照AxyPrep全血基因组小量提取试剂盒说明，得到待检测的DNA。
二、待测样品的PCR扩增
利用Primer5.0设计五对引物，多重PCR一步扩增出CYP3A5的五条具有SNP位点的目标序列。其中，突变型CYP3A5*3(A6986G)，位于内含子3；突变型CYP3A5*6(G14690A)，位于外显子7；突变型CYP3A5*7(27131_27132insT)，位于内含子3；突变型CYP3A5*8(C3699T)，位于外显子2；突变型CYP3A5*9(G19386A)，位于外显子10；产物大小分别为309bp、448bp、388bp、468bp、373bp。引物序列(SEQ NO.31～40)见上述表3所示。
首先配制多重PCR引物工作液：分别各取SEQ NO.31～40的引物贮存液100ul于1.5ml微量离心管中，混合均匀即为多重PCR引物工作液。多重PCR反应体系如下：
10×缓冲液(含Mg²⁺)                5ul
dNTP(各2.5mmol/L)                 4ul
Taq酶(5U/ul)                      0.5ul
多重PCR引物工作液(各16.7pmol/mL)  6ul
模板DNA(10ng/ul)                  1ul
ddH₂O                             33.5ul
                                                      
共                                50ul
PCR扩增程序为：95℃ 3min；94℃ 20s，56℃ 30s，72℃ 30s，30个循环；72℃ 10min；4℃保存备用。
三、PCR产物的酶切处理
参照ExoSAP-IT试剂盒说明，详细步骤如下：
1.取7.5ul PCR反应后的产物，加入3ul ExoSAP-IT酶；
2.37℃孵育15min。80℃孵育15min，使多余的酶灭活。酶切处理后的产物直接用于后续的ASPE引物延伸反应。
四、位点特异的引物延伸反应(ASPE)
利用上述设计的位点特异性引物进行引物延伸反应，在反应过程中掺入生物素标记的dCTP，从而使反应后的产物带上多个的生物素标记。
首先配制混合的ASPE引物工作液：分别各取A6986G、G14690A、2713127132insT、C3699T、G19386A相应的野生型和突变型的ASPE引物贮存液10ul于1.5ml微量离心管中，加入10mmol/LTris Buffer补至200ul，混合均匀即为ASPE混合引物工作液。ASPE反应的体系如下：
10×缓冲液                            2ul
MgCl₂(50mmol/L)                       0.5ul
Biotin-dCTP(400umol/L)                0.25ul
dATP、dGTP、dTTP混合液(各100umol/L)   1ul
Tsp酶(5U/ul)                          0.25ul
混合的ASPE引物工作液(各500nmol/L)     1ul
酶切处理的PCR扩增产物                 5ul
ddH₂O                                 10.ul
共                                20ul
PCR程序为：96℃ 2min；94℃ 30s，58℃ 1min，72℃ 2min，30个循环；4℃保存备用。
五、杂交反应
1.根据设计的ASPE引物，选择相应的最优的十种微球(微球浓度均为2.5×10⁵个/ml)。
2.分别取1ul每种编号的微球于1.5ml的微量离心管中；
3.微球于≥10000g离心1-2min；
4.弃去上清，微球重悬于100ul的2×Tm杂交缓冲液中，涡旋混匀；
5.取25ul上述微球悬液于96孔滤板相应的孔中，对照孔加25ul的ddH₂O；
6.取5-25ul的ASPE反应液于相应的孔中，用ddH₂O补足至50ul；
7.用锡箔纸包住96孔板以避光，95℃60s，37℃15min孵育杂交；
8.杂交后的微球于≥3000g离心2-5min；
9.去上清，将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中；
10.微球于≥3000g离心2-5min；
11将微球重悬于75ul的1×Tm杂交缓冲液中，加入15ul浓度为10ug/ml的链霉亲和素-藻红蛋白(SA-PE)；
12.37℃孵育15min，于Luminex仪器上检测。
六、结果检测与数据分析
反应后产物通过Luminex系列分析仪器检测。以聚苯乙烯微球作为反应的载体，以荧光检测仪作为检测平台，对核酸分子进行高通量的多指标并行检测。在微球的制造过程中，掺入不同比例的红光及红外光染色剂，从而形成多至100种不同颜色编码的微球。不同的微球共价结合了针对不同待检测物的核酸分子作为探针分子，报告分子以生物素标记，并用高灵敏的荧光染料染色。这些微球与待测物、报告分子、荧光标记物就形成完整的微球检测体系用于Luminex系统的读取。Luminex阅读系统分别激发红色激光和绿色激光用于微球体系的检测，检测结果如表4、表5和表6所示。
对荧光值(MFI)和数据处理有以下要求：
1.每个位点需至少有一个等位基因MFI大于300而且大于10×PCR阴性对照MFI；
2.NET MFI＝样品MFI-PCR阴性对照MFI(NET MFI小于0的以0表示)；
3.满足以上两个条件的数据，按下列公式计算突变比值：
突变比值＝突变型NET MFI÷(突变型NET MFI+野生型NET MFI)
4.根据经验对每个检测位点的突变比值确定阈值(cut-off值)，以划分野生型纯合子、杂合子和突变型纯合子。
使用本方法检测大量样本的CYP3A5基因多态性，实验数据符合上述要求，因此可计算得它们的突变比值。阈值(cut-off值)的设置如下：突变比值范围在0％-20％视为野生型纯合子；30％-70％视为杂合子；80％-100％视为变异型纯合子。以测序法检测与液相芯片结果作对照，计算本发明所提供的分型方法检测结果的吻合率。本方法检测20份样本的CYP3A5基因型检测结果与测序结果吻合率达到100％。可见本发明所提供的CYP3A5基因SNP检测液相芯片能够准确地检测出CYP3A5基因的SNP类型，且结果稳定可靠。
表4样本检测结果(MFI)
  序号  NO.  A6986G  -w  A6986G  -m  G14690  A-w  G14690  A-m  27131_2  7132ins  27131_2  7132ins  C3699T-  w  C3699T-  m  G19386  A-w  G19386  A-m  T-w  T-m  阴性对  昭  12  11  12  14  12  10  17  16  11  13  1  3433  147  3453  144  3062  226  3093  222  2906  227  2  35  3148  2815  228  3350  122  2814  260  3343  136  3  2493  2755  2697  215  2572  220  2876  249  3042  218  4  1400  1996  3022  224  2557  2563  2052  226  3284  148  5  35  2494  3193  141  2033  229  3295  131  2402  2032  6  3209  140  3213  239  2362  316  2652  224  3206  232  7  1952  1336  2494  238  3455  236  3273  242  2536  123  8  2555  141  20  2102  2458  228  2969  303  2942  241  9  2335  3381  2558  231  2727  231  2559  229  2423  125
  10  2292  245  3110  244  3325  189  2380  246  2918  224  11  2410  248  3159  127  2602  275  2026  368  2058  234  12  42  3141  2610  247  3484  326  3192  228  2942  224  13  2861  3106  3343  227  2190  254  2654  189  46  2257  14  3071  2985  2132  328  2376  241  2991  245  2857  247  15  1215  1315  2900  319  2352  248  19  2910  3439  238  16  2165  231  2579  240  3224  216  3373  219  2677  247  17  3150  216  3228  318  2053  239  3144  189  3036  220  18  3117  2595  2871  127  3371  315  2404  225  3113  218  19  2750  246  2576  332  2658  218  3481  245  2511  127  20  2144  1799  2428  225  3336  241  3217  346  2425  249
表5样本CYP3A5基因多态性分析结果


表6样本CYP3A5基因多态性分析结果



实施例3不同的ASPE引物的液相芯片对CYP3A5基因SNP检测基因突变的检测
一、液相芯片制备的设计(Tag序列及Anti-Tag序列的选择)
以CYP3A5基因CYP3A5*6(G14690A)位点突变的检测液相芯片为例，针对G14690A的野生型和突变型设计ASPE引物3’端的特异性引物序列，而ASPE引物5’端的Tag序列则选自SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.10中的6条，相应的，包被于微球上的与对应tag序列互补配对的anti-tag序列选择SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.30。具体设计如下表(表7)所示。ASPE引物的合成、anti-tag序列包被微球、扩增引物、检测方法等如实施例1和实施例2所述。
表7液相芯片制备的设计

二、样品检测
采用上述设计制备的液相芯片，按实施例2所述检测过程和方法对样品21-40进行检测，检测结果如下：
表8样本检测结果(MFI)与基因多态性分析


以上是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。
序列表
<110>广州益善生物技术有限公司
<120>CYP3A5基因SNP检测特异性引物、液相芯片和检测方法
 
<160>40
<170>PatentIn version 3.1
 
<210>1
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
aatccttttac attcattac ttac                                    24
 
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
tacaaatcat caatcacttt aatc                                    24
 
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
atacttcatt cattcatcaa ttca                                    24
 
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
cttttacaat acttcaatac aatc                                    24
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
cttttcaatt acttcaaatc ttca                                    24
 
<210>6
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ttcacttttc aatcaacttt aatc                                    24
 
<210>7
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
caattcattt cattcacaat caat                                    24
 
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
ttactacaca atatactcat caat                                    24
 
<210>9
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
tcatttcaat caatcatcaa caat                                    24
 
<210>10
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
ctatctatct aactatctat atca                                        24
 
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
aagagctctt ttgtctttca a                                           21
 
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<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
aagagctctt ttgtctttca g                                           21
 
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<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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aaccaaattt taggaacttc                                             20
 
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<212>DNA
<213>人工序列
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aaccaaattt taggaacttt                                             20
 
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cttccaggca ccaccta                                            17
 
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cttccaggca ccacctt                                            17
 
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actttgtaga tatgggaccc                                         20
 
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<213>人工序列
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actttgtaga tatgggacct                                         20
 
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actgcaaaag gagattgatg                                         20
 
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actgcaaaag gagattgata                                        20
 
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gtaagtaatg aatgtaaaag gatt                                   24
 
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<213>人工序列
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gattaaagtg attgatgatt tgta                                   24
 
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<213>人工序列
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tgaattgatg aatgaatgaa gtat                                   24
 
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<212>DNA
<213>人工序列
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gattgtattg aagtattgta aaag                                   24
 
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<213>人工序列
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tgaagatttg aagtaattga aaag                                    24
 
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gattaaagtt gattgaaaag tgaa                                    24
 
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attgattgtg aatgaaatga attg                                    24
 
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attgatgagt atattgtgta gtaa                                    24
 
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attgttgatg attgattgaa atga                                    24
 
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<213>人工序列
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tgatatagat agttagatag atag                                    24
 
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cataggagat acccacgtat gta                                     23
 
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ttaggttcta gttcattagg gtg                                     23
 
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tattggatgc ttagggcagt                                         20
 
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<213>人工序列
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tcttgctgca tgtatagtgg                                         20
 
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<213>人工序列
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ggggtgagga tggtcttgaa                                            20
 
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<213>人工序列
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tgaccctttg ggaatgaata                                            20
 
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ggagcatttg aggacattta tca                                        23
 
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>38
cctcagaact ccctcccaag                                            20
 
<210>39
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<213>人工序列
<400>39
tcgcagccca gtcaataatc t                                          21
 
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>40
gtaaacaggt gaaccagggc                                            20