甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物、试剂盒及其使用方法.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201810317112.8

申请日:

20180410

公开号:

CN108315425A

公开日:

20180724

当前法律状态:

有效性:

审查中

法律详情:

IPC分类号:

C12Q1/6886,C12Q1/6869,C12N15/11

主分类号:

C12Q1/6886,C12Q1/6869,C12N15/11

申请人:

广东省人民医院(广东省医学科学院),广州奇辉生物科技有限公司

发明人:

邝建,朱瑞娟,赖水青,朱奇,王龙,郑泽鑫,陈志江

地址:

510080 广东省广州市中山二路106号

优先权:

CN201810317112A

专利代理机构:

广州华进联合专利商标代理有限公司

代理人:

林青中;万志香

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内容摘要

本发明公开了一种甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物、试剂盒及其使用方法。本发明自主研发的基于高通量测序技术的针对甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物、试剂盒及其使用方法中涉及的甲状腺癌转移相关基因已经过样本验证,可用于检测甲状腺癌转移相关基因的突变情况,该检测结果可以作为中间结果配合其他检测结果一起来判断是否有癌细胞已发生转移或者是否有转移或复发的可能,对于甲状腺癌的治疗及预后具有重要的意义。并且,本发明利用高通量基因测序技术突破传统检测技术的限制,提高了检测灵敏度,即使是低丰度的突变基因也可检测出来,进而对于辅助预测甲状腺癌细胞扩散和复发的可能性具有重要的意义。

权利要求书

1.一种甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物,其特征在于,包括如下至少一个基因检测用的扩增引物对:序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的APC基因的扩增引物对,序列如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的CDH1基因的扩增引物对,序列如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的EGFR基因的扩增引物对,序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的KIT基因的扩增引物对,序列如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的、或如SEQIDNO.11和SEQIDNO.12所示的、或如SEQIDNO.13和SEQIDNO.14所示的NOTCH1基因的扩增引物对,序列如SEQIDNO.15和SEQIDNO.16所示的、或如SEQIDNO.17和SEQIDNO.18所示的、或如SEQIDNO.19和SEQIDNO.20所示的SMAD4基因的扩增引物对,序列如SEQIDNO.21和SEQIDNO.22所示的VHL基因的扩增引物对,序列如SEQIDNO.23和SEQIDNO.24所示的MLH1基因的扩增引物对,序列如SEQIDNO.25和SEQIDNO.26所示的JAK3基因的扩增引物对,序列如SEQIDNO.27和SEQIDNO.28所示的PIK3CA基因的扩增引物对,序列如SEQIDNO.29和SEQIDNO.30所示的MAP2K1基因的扩增引物对,以及序列如SEQIDNO.31和SEQIDNO.32所示的DDR2基因的扩增引物对。 2.如权利要求1所述的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物,其特征在于,包括如下三组扩增引物对中的至少一组:第一组包括如下基因的扩增引物对:APC基因、CDH1基因、EGFR基因、KIT基因、MAP2K1基因、NOTCH1基因、SMAD4基因、VHL基因;第二组包括如下基因的扩增引物对:APC基因、CDH1基因、DDR2基因、EGFR基因、KIT基因、MLH1基因、NOTCH1基因、PIK3CA基因;第三组包括如下基因的扩增引物对:APC基因、CDH1基因、DDR2基因、EGFR基因、JAK3基因、KIT基因、MLH1基因、NOTCH1基因、PIK3CA基因、VHL基因。 3.如权利要求1或2所述的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物,其特征在于,所述扩增引物对的各引物经过硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰及5’反向dT修饰中的一种或多种修饰。 4.如权利要求1或2所述的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物,其特征在于,所述扩增引物对的Tm值为60±2℃。 5.如权利要求1或2所述的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物,其特征在于,所述扩增引物对的两条引物的5’端分别连接有长度为50bp~70bp的用于与通用引物对的相应引物完全互补的序列片段或与通用引物对的相应引物的3’端的部分序列互补的序列片段。 6.如权利要求5所述的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物,其特征在于,所述通用引物对的两条引物的序列如SEQIDNO.33和SEQIDNO.34所示。 7.一种甲状腺癌转移相关基因检测用的试剂盒,其特征在于,包括如权利要求1~6中任一项所述的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物。 8.如权利要求7所述的甲状腺癌转移相关基因检测用的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括DNA提取试剂、PCR扩增缓冲液、通用引物对、DNA聚合酶及无核酸水中的至少一种。 9.如权利要求8所述的甲状腺癌转移相关基因检测用的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括人正常基因组DNA的质控品。 10.一种如权利要求7~9中任一项所述的甲状腺癌转移相关基因检测用的试剂盒的使用方法,其特征在于,包括如下步骤:提取待测甲状腺癌样本的DNA;使用所述试剂盒中的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物对提取的DNA样本进行PCR扩增;对PCR扩增的产物进行测序分析。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域,尤其是涉及一种甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物、试剂盒及其使用方法。

背景技术

甲状腺是人体最大的内分泌器官,甲状腺癌是常见的内分泌肿瘤。甲状腺肿瘤分为良性和恶性,其中,甲状腺恶性肿瘤包括乳头状癌、滤泡状癌、髓样癌以及未分化癌共四大类。分化型甲状腺癌占所有甲状腺癌的90%,未分化甲状腺癌较少见,但恶性程度高,预后差。

近30年来,包括我国在内的世界大多数地区的甲状腺癌发病率呈持续上升趋势。2010年我国甲状腺癌发病率为4.12/10万,男性1.93/10万,女性6.42/10万;同期我国甲状腺癌死亡率为0.34/10万,男性0.23/10万,女性0.46/10万。甲状腺癌已是女性中最常见的恶性肿瘤之一,在韩国,女性人群中甲状腺癌的发病率为89/10万,居于女性常见恶性肿瘤中的首位。

甲状腺癌患者的预后有一部分取决于甲状腺癌是否已扩散(转移)。虽然分化型甲状腺癌的远处转移率很低,但是转移仍是常见的致死原因,分化型甲状腺癌的复发风险很大程度上取决于有无局部或远处转移。2009年美国甲状腺学会的指南中阐述了分化型甲状腺癌患者的复发风险,其中高复发风险与低复发风险的区别为甲状腺癌发生广泛扩散,有远处转移或有其他高危因素。因此,对甲状腺癌患者的转移或复发的可能性进行准确地评估,对于甲状腺癌的治疗和预后具有重要的意义。

目前检测肿瘤转移的方法有组织连续切片HE染色观察法、免疫组织化学方法、流式细胞术、PCR/RT-PCR技术和高通量测序法等。常规连续切片HE染色法敏感性低,需要切几十甚至几百张切片,近年来已很少使用;免疫组化法操作较简单,敏感性和特异性较高,但比较费时,且容易出现假阳性、假阴性;流式细胞术优点是速度快、精度高、准确性好,但缺点是需要特异性的荧光染料且仪器和试剂成本较高;PCR/RT-PCR技术是通过扩增出肿瘤细胞标志性基因或靶RNA来检测肿瘤的转移,最大的优点是灵敏度高,但PCR的方法只能针对一个或数个已知突变的位点设计检测,无法用于检测未知突变;高通量测序法是新一代测序技术,可以多样本的进行高通量的测序,耗时短、精度高、数据量大,既可以检测已知突变位点,也可以用于检测未知突变。

虽然高通量测序技术现在已广泛应用于未知突变的检测,但受限于众多的甲状腺癌转移的相关基因以及扩增引物的设计,目前仍未有有效地、准确性高且使用方便的针对甲状腺癌转移相关基因的检测用的PCR特异性引物及与之相关的检测方法。

发明内容

基于此,有必要提供一种准确性高且使用方便的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物、试剂盒及其使用方法。

一种甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物,包括如下至少一个基因检测用的扩增引物对:序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的APC基因的扩增引物对,序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的CDH1基因的扩增引物对,序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的EGFR基因的扩增引物对,序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的KIT基因的扩增引物对,序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的、或如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的、或如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的NOTCH1基因的扩增引物对,序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的、或如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示的、或如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的SMAD4基因的扩增引物对,序列如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的VHL基因的扩增引物对,序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的MLH1基因的扩增引物对,序列如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的JAK3基因的扩增引物对,序列如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示的PIK3CA基因的扩增引物对,序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示的MAP2K1基因的扩增引物对,以及序列如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的DDR2基因的扩增引物对。

在其中一个实施例中,所述甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物包括如下三组扩增引物对中的至少一组:

第一组包括如下基因的扩增引物对:APC基因、CDH1基因、EGFR基因、KIT基因、MAP2K1基因、NOTCH1基因、SMAD4基因、VHL基因;

第二组包括如下基因的扩增引物对:APC基因、CDH1基因、DDR2基因、EGFR基因、KIT基因、MLH1基因、NOTCH1基因、PIK3CA基因;

第三组包括如下基因的扩增引物对:APC基因、CDH1基因、DDR2基因、EGFR基因、JAK3基因、KIT基因、MLH1基因、NOTCH1基因、PIK3CA基因、VHL基因。

在其中一个实施例中,所述扩增引物对的各引物经过硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰及5’反向dT修饰中的一种或多种修饰。

在其中一个实施例中,所述扩增引物对的Tm值为60+2℃。

在其中一个实施例中,所述扩增引物对的两条引物的5’端分别连接有长度为50bp~70bp的用于与通用引物对的相应引物完全互补的序列片段或与通用引物对的相应引物的3’端的部分序列互补的序列片段。

在其中一个实施例中,所述通用引物对的两条引物的序列如SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示。

一种甲状腺癌转移相关基因检测用的试剂盒,包括上述任一实施例所述的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物。

在其中一个实施例中,所述试剂盒还包括DNA提取试剂、PCR扩增缓冲液、通用引物对、DNA聚合酶及无核酸水中的至少一种。

在其中一个实施例中,所述试剂盒还包括人正常基因组DNA的质控品。

一种甲状腺癌转移相关基因检测用的试剂盒的使用方法,其特征在于,包括如下步骤:

提取待测甲状腺癌样本的DNA;

使用所述试剂盒中的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物对提取的DNA样本进行PCR扩增;

对PCR扩增的产物进行测序分析。

在其中一个实施例中,是使用磁珠法提取待测甲状腺癌样本的DNA。

在其中一个实施例中,还包括对提取的待测甲状腺癌样本的DNA进行浓度和纯度测定的步骤,以及对PCR扩增的产物进行纯化和浓度测定的步骤。

在其中一个实施例中,所述PCR扩增的反应体系为:

所述酶混合物包括:高保真DNA聚合酶(终浓度为1.25U/反应)、PCR缓冲液(成分为50mM KCl、1.5mM MgCl2、10mM Tris-HCl,pH为8.3,用量为1×)、dNTP混合物(用量为200μM/种/反应)等。

在其中一个实施例中,所述PCR扩增的反应程序为:

98℃,激活20min;循环1次;98℃变性15s,62℃退火60min,72℃延伸60s,共6个循环;98℃变性15s,62℃退火30s,72℃延伸60s,共2个循环;98℃变性15s,72℃延伸60s,共28个循环;72℃延伸10min。

在其中一个实施例中,PCR扩增的目标区域可来源于同一个甲状腺癌转移相关基因,也可来源于不同的甲状腺癌转移相关基因;包括但不限于甲状腺癌转移相关基因上的内部序列、基因的外部调控序列;所述基因内部序列,包括但不限于基因的内含子区域、外显子区域、同时含有内含子与外显子的区域。

进一步的,待测甲状腺癌样本可以是离体的外周血样品、细针穿刺活检样品或石蜡组织样品。

在其中一个实施例中,所述测序分析是使用Illumina公司的高通量测序平台对PCR扩增产物进行测序,再用统计学处理测序结果,对甲状腺癌转移相关基因的突变情况进行分析,分析结果可作为中间结果为临床诊断甲状腺癌是否已经转移或有转移或复发的可能提供辅助,可进一步结合其他结果验证甲状腺癌是否已经转移或有其他可能。

所述高通量测序平台可以是但不限于Illumina HiSeq/MiSeq、Life Ion Torrent/Proton平台或华大基因BGISEQ-500/50等测序平台。

本发明的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物、试剂盒及其使用方法具有以下有益效果:

本发明自主研发的基于高通量测序技术的针对甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物、试剂盒及其使用方法中涉及的甲状腺癌转移相关基因已经过样本验证,可用于检测甲状腺癌转移相关基因的突变情况,该检测结果可以作为中间结果配合其他检测结果一起来判断是否有癌细胞已发生转移或者是否有转移或复发的可能,对于甲状腺癌的辅助诊断、治疗方案的制定及预后处理具有重要的意义。

研究发现,甲状腺癌在新发现癌症中的占比约1.5%,部分甲状腺癌会发生局部浸润和远处转移。CT扫描和MR是诊断甲状腺癌转移的传统检测方法。CT扫描会使受检者暴露在离子射线下,对受检者有一定危害,限制了对部分受检者(如孕妇等)的检查。MR检测不仅费用昂贵,对体内装有金属体、体内植入心脏起搏器、电子耳蜗等受检者,以及超肥胖者都有限制要求。不仅如此,CT扫描和MR检查对早期转移敏感性不高。随着甲状腺超声检查的普及,甲状腺癌转移率会越来越高,现在还没有稳定地且高敏感性、高特异性的辅助方法解决上述问题。随着对基因检测技术的深入研究,学者发现多基因联合对疾病的检验比单一基因检测有更高的特异性和敏感性。本发明的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物,在不用进行手术的情况下,只要通过对甲状腺结节细针穿刺样品进行分析就可以实现对甲状腺癌转移的较为准确的辅助诊断,进而指导治疗方案的制定。对甲状腺癌转移的准确辅助诊断,可以实现对疾病的早发现、早干预、早治疗,减少由于漏诊导致的不可挽回的后果。同时,对于无转移的甲状腺癌,可以避免过度治疗,因此,通过本发明的PCR特异性引物不仅可以节省治疗费用,还可以在一定程度上提高患者的生活质量。

进一步,本发明通过二元回归模型来研究不同的甲状腺结节良恶性及转移相关基因与甲状腺癌转移之间的关系,充分考虑检测的敏感性和特异性,在对测序结果分析时,可以将多个不同基因的测序结果进行分组分析,来达到预测甲状腺癌转移的目的。相应地的,该PCR特异性引物需要至少含有多组基因组合中的至少一种组合所包括的扩增引物对。具体地,第一组基因组合主要考虑了甲状腺癌转移预测的高特异性和高阳性预测率,由此可以避免非甲状腺癌转移患者的过度医疗。第二组在第一组基因的基础上,替换了部分基因,目的是保证在较高特异性的情况下,提高预测的敏感性,进而减少甲状腺癌转移的漏检率。第三组加入了更多的基因,目的是均衡特异性和敏感性,提高预测准确率。同时由于不同基因突变在不同样本中的检出率不一致,本发明通过三组不完全相同的基因,可以提高样本的检出率。

本发明提供的PCR特异性引物是针对甲状腺癌转移相关基因的热点突变设计的引物,结构稳定,检测位点多,能够用一次PCR扩增反应捕获和扩增多个样本多个甲状腺癌转移相关基因,包括点突变、短片段插入缺失等体细胞突变,有效提高检测效率和准确率,同时具有降低成本、简化操作步骤等优点。

本发明通过对不同的甲状腺癌转移相关基因进行分析研究,并充分考虑检测时的敏感性和特异性,将多种不同的甲状腺癌转移相关基因进行分组分析。在保证检测高准确率的情况下,实现了适合所有人群的低成本、微创无危害的甲状腺癌转移的检测及辅助诊断,从而使所有受检者都能得到及时地检查,达到对甲状腺癌转移的早发现、早治疗的目的。本发明通过对不同的甲状腺癌转移相关基因进行分析研究的成果,可以为医生制定治疗法案提供可靠的参考。对于甲状腺癌转移患者可以减少漏诊率,使其得到及时治疗。对于无甲状腺癌无转移患者可以降低因过度医疗造成的人力、财力的浪费。由于本发明通过对不同的甲状腺癌转移相关基因进行分析研究方法的低成本、微创无危害的特性,使预后随访、检查更简单、方便,在此基础上,可以根据病情的进展和治疗效果,及时调整治疗方案。

本发明的检测方法可以进一步采用磁珠纯化核酸的方式,省去了传统建库中的离心柱式纯化,操作简单;其次,本发明针对高通量测序技术设计的引物只需要一轮PCR,通过选取温度梯度、时间梯度、循环数经过大量正交实验,优化PCR反应程序,将样品传统建库的两次扩增融合在一个PCR反应体系进行,且本发明所用的特异性引物直接在目标基因链中捕获目标区域并进行扩增,不需要对目标基因进行截断修饰等处理,节省了检测时间和成本。

并且,本发明利用高通量基因测序技术突破传统检测技术的限制,提高了检测灵敏度,即使是低丰度的突变基因也可检测出来,进而对于辅助预测甲状腺癌细胞扩散和复发的可能性具有重要的意义。

附图说明

图1为目标基因建库PCR扩增的原理示意图。

图2为检测甲状腺癌相关基因的检测方法流程示意图。

图3为引物特异性验证结果图,从左至右的各泳道中的条带依次为M、N、P、1至9,其中,M:Marker;N:阴性对照;P:阳性对照;1-3:1-3号外周血样品验证;4-6:4-6号细针穿刺样品验证;7-9:7-9号石蜡组织样品验证。

图4为引物灵敏度验证结果图,从左至右的各泳道中的条带依次为M、N、P、1至9,其中,M:Marker;N:阴性对照;P:阳性对照;1-3:1号外周血样品三种模板浓度灵敏度验证;4-6:4号细针穿刺细胞样品三种模板浓度灵敏度验证;7-9:7号石蜡组织样品三种模板浓度灵敏度验证。

图5为引物重复性验证结果,从左至右的各泳道中的条带依次为M、N、P、1至6,其中,M:Marker;N:阴性对照;P:阳性对照;1-3:实验员A检测2号外周血样品、5号细针穿刺组织样品、8号石蜡组织样品验证结果;4-6:实验员B检测2号外周血样品、5号细针穿刺组织样品、8号石蜡组织样品验证结果。

图6为引物浓度优化验证结果,从左至右的各泳道中的条带依次为M、N、P、1至18,其中,M:Marker;N:阴性对照;P:阳性对照;1-18:3号外周血样品、6号细针穿刺细胞样品、9号石蜡组织样品分别检测引物0.2μM/0.2nM、0.2μM/1nM、0.2μM/2nM、0.4μM/0.2nM、0.4μM/1nM、0.4μM/2nM六组组合共18个验证结果。

图7为PCR反应条件优化验证结果,从左至右的各泳道中的条带依次为M、N、P、1至9,其中,M:Marker;N:阴性对照;P:阳性对照;1-9:3号外周血样品、6号细针穿刺细胞样品、9号石蜡组织样品分别检测退火温度58℃、62℃、66℃三组组合共9个验证结果。

图8为甲状腺结节良恶性相关基因的检测试剂盒适用样品验证中所用样品的基因组电泳图,从左至右的各泳道中的条带依次为M、1、2、3、4、5、6、7、8、9,其中,M:Marker;1-3:10-12号外周血样品基因组条带;4-6:13-15号细针穿刺组织样品基因组条带;7-9:16-18号石蜡组织样品基因组条带。

图9为甲状腺结节良恶性相关基因的检测试剂盒适用样品验证结果,从左至右的各泳道中的条带依次为M、N、P、1、2、3、4、5、6、7、8、9,其中,M:Marker;N:阴性对照;P:阳性对照;1-3:10-12号外周血样品验证结果;4-6:13-15号细针穿刺组织样品验证结果;7-9:16-18号石蜡组织样品验证结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明,下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。

实施例1一种基于高通量测序技术的甲状腺癌转移相关基因检测用的多重PCR特异性引物、试剂盒及检测方法

1、引物的设计

本实施例涉及的甲状腺癌转移相关基因序列选自于UCSC(University of California Santa Cruz,加州大学圣克鲁兹分校)数据库,依据相关基因序列进行热点突变引物设计,设计范围包含了甲状腺癌转移相关基因中的突变热点。

如图1所示,本实施例对甲状腺癌转移相关基因的热点突变进行的引物设计共16对,每对PCR特异性引物扩增目标区域大小为100-150bp,扩增产物大小为250-300bp,覆盖范围广、结构稳定、检测位点多。

具体地,16对扩增引物对为如下表1中12个基因的扩增引物对:

表1

在本实施例中,扩增引物对的两条引物的5’端分别连接有长度为50~70bp的用于与通用引物完全互补的序列片段或与通用引物的3’端的部分序列互补的序列片段。通用引物对的两条引物的序列如SEQ ID NO.33(5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’)和SEQ ID NO.34(5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’)所示。

本实施例的PCR特异引物设计时引进特异性修饰,修饰后的引物不易被核酸酶降解,且具有相对均一的Tm值,统一设计为60℃左右(±2℃)。本实施例的特异性引物在多重扩增时表现出很好的特异性、稳定性及均一性,同时不存在非特异扩增。具体地,引物特异修饰方法为硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰、5’反向dT修饰中的一种或几种。硫代修饰后的引物序列寡核苷酸链上带双键的氧原子被硫原子取代的衍生物,能够抵抗核酸酶的降解,增强引物稳定性;脱氧尿嘧啶修饰后的引物寡核苷酸序列中每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧尿嘧啶替代,可以增长双链溶解温度1.7℃,从而增加双链的稳定性;5’反向dT修饰后的引物寡核苷酸序列5’末端含有反向dT,从而形成交联,形成的交联可以抑制在DNA聚合酶延伸过程中的外切核酸酶的降解作用。

进一步,本实施例的PCR特异性引物在确保PCR扩增特异性的同时还能保证其扩增效率。

2、甲状腺癌转移相关基因检测用的试剂盒

本实施例的试剂盒,主要包括:

上述PCR特异性引物:用于扩增待测样品核酸中的多个目标区域,扩增范围至少覆盖目标基因的热点突变区域。优选的,多种扩增引物对混合在一起构成引物混合物。

通用引物:用于在文库构建过程中,对特异引物扩增目标区域的扩增产物进行再次扩增,对不同待测样品的测序文库进行标记,进而区分不同样品,序列如SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示。

PCR反应液:包括酶混合物、无核酸酶水。其中,酶混合物包括高保真DNA聚合酶(用量为1.25U/反应)、PCR Buffer(成分为50mM KCl、1.5mM MgCl2、10mM Tris-HCl,pH为8.3,用量为1×)、dNTP混合物(用量为200μM/种/反应)。

质控品:人正常基因组DNA,来源于正常人全血样本。

3、基于高通量测序技术甲状腺癌转移相关基因的检测方法

如图2所示,本实施例的检测方法包括以下步骤:

步骤S11:利用纳米级超顺磁性羧基磁珠在不同盐浓度及疏水环境下与核酸分子可逆吸附的原理,特异吸附核酸分子,通过后续地洗涤及洗脱步骤,获得高纯度的核酸样本,使用Qubit或NanoDrop进行浓度及纯度的测定,根据测定的核酸样本浓度结果,使用10mM Tris将核酸样本稀释至50-250ng/μL,优选的50-100ng/μL作为扩增建库的起始浓度。使用1%琼脂糖凝胶电泳40min,对稀释后核酸的质量进行评估,根据琼脂糖凝胶电泳结果的均一性及完整性判断提取核酸的质量,核酸完整性好或发生轻微降解不影响建库效果。所提取的核酸浓度、纯度测定及1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后入组并分别进行标记。所述样本合格的标准为核酸浓度>50ng/μL,OD260/OD280=1.7-2.0,1%琼脂糖凝胶电泳检测样品条带完整、均一,无明显拖尾。

步骤S12:用本实施例的PCR特异性引物或试剂盒对S11中待测样品核酸中的易感基因目标区域进行一次PCR扩增,收集扩增产物,扩增产物片段长度为特异引物扩增片段与通用引物之和。

PCR扩增的反应体系为:特异引物混合物2μL、通用引物2μL、模板/质控品200ng、酶混合物12.5μL、无核酸酶水将体积补足至25μL。

PCR扩增的反应程序为:

98℃,激活20min;循环1次;98℃变性15s,62℃退火60min,72℃延伸60s,共6个循环;98℃变性15s,62℃退火30s,72℃延伸60s,共2个循环;98℃变性15s,72℃延伸60s,共28个循环;72℃延伸10min。

当待测甲状腺癌转移相关基因有多个时,同一待测样品的不同甲状腺癌转移相关基因的扩增可同时进行或部分同时进行。在具体的实验过程中,可根据需要选用上述任一种基因组合的方案进行。若分别进行扩增时,需要保证用于构建测序文库的扩增产物的量是一致的。当待测样品有多个时,不同样品的甲状腺癌转移相关基因的扩增必须分别进行。

步骤S13:利用纯化磁珠分别对各样品的建库产物进行纯化,去除PCR产物中剩余的引物及dNTP等,回收扩增产物,进行浓度、纯度测定及1%琼脂糖凝胶电泳检测样品质量,所述样本合格的标准为核酸浓度>2ng/μL,OD260/OD280=1.7-2.0,1%琼脂糖凝胶电泳检测样品条带完整、均一,无明显拖尾。将所有合格核酸样品(不超过96个)浓度分别稀释至2nmol/L,并等体积混样,统一上机测序。

对照试验:

阳性对照反应体系包括:特异引物混合物2μL;通用引物2μL;酶混合物12.5μL;质控品200ng;无核酸酶水将体积补足至25μL。阳性对照用于检查反应体系的扩增能力是否正常和样本是否异常。

阴性对照反应体系包括:特异引物混合物2μL;通用引物2μL;酶混合物12.5μL;无核酸酶水将体积补足至25μL。阴性对照用于检查反应体系是否存在核酸物质污染。

阳性对照和阴性对照的反应程序同步骤S12的扩增反应程序。

实施例2引物特异性验证

利用实施例1中步骤S11方法从外周血样品(编号:1-3)、细针穿刺样品(编号:4-6)、石蜡组织样品(编号:7-9)中提取核酸,进行浓度、纯度测定后,取合格样品使用10mM Tris将每例样品稀释至100ng/μL,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测每例样品质量(合格标准同实施例1中步骤S11),合格后入组并分别进行标记。利用实施例1中步骤S12方法对上述9例合格样本进行扩增,上样量为各2μL,扩增后产物纯化后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测(合格标准同实施例1中步骤S13步骤),9例样本使用甲状腺癌转移相关基因特异引物扩增及检测方法进行检测。对照试验同实施例1,检测方法与样本检测方法相同。

检测结果见图3,检测结果表明,阴性对照除残留引物外,无任何非特异条带,说明反应体系是无污染;阳性对照条带明亮,大小正确,说明反应体系的扩增能力正常。9例样本最终扩增产物主要集中在300bp,无其他非特异性条带,与预期设计相符,同时引物二聚体含量极少,且引物二聚体大小与扩增目标片段差异明显。由此可以看出,本实施例的PCR特异性扩增引物及检测方法能突破传统方法产生大量引物二聚体的限制,增强了引物特异性。

实施例3引物检测灵敏度验证

利用实施例1中步骤S11方法从质检合格的外周血样品(编号:1)、细针穿刺样品(编号:4)、石蜡组织样品(编号:7)提取样品核酸进行引物检测灵敏度验证。每例样品起始浓度为100ng/μL,按照5倍、10倍、20倍浓度梯度稀释,稀释后每例样品浓度分别为20ng/μL、10ng/μL和5ng/μL,并分别进行样品名称及浓度标记。利用实施例1中步骤S12方法对上述9例合格稀释样本进行扩增,上样量为各2μL,9例样本使用甲状腺癌转移相关基因特异引物扩增及检测方法进行检测。对照试验同实施例1,检测方法与样本检测方法相同。

检测结果见图4,检测结果表明,阴性对照除残留引物外,无任何非特异条带,说明反应体系是无污染;阳性对照条带明亮,大小正确,说明反应体系的扩增能力正常。9例样本最终扩增产物主要集中在300bp,无其他非特异性条带,与预期设计相符,引物二聚体含量极少,且引物二聚体大小与扩增目标片段差异明显,易分辨。同时,即使模板含量低至10ng,依然能够成功扩增出目标条带,由此可以看出,本实施例的PCR特异性扩增引物及检测方法能突破传统方法的限制,提高了检测灵敏度。

实施例4引物检测重复性验证

利用实施例1中步骤S11方法从质检合格的全血样品(编号:2)、细针穿刺组织(编号:5)、石蜡组织样品(编号:8)提取样品核酸进行引物检测重复性验证。由2名不同的操作员在2个不同的实验室平台按照实施例1中步骤S12方法对上述3例样品分别进行扩增,上样量为各2μL,3例样本使用甲状腺癌转移相关基因特异引物由不同操作员在不同实验室得到的9个扩增及检测方法进行检测。对照试验同实施例1,检测方法与样本检测方法相同。

检测结果见图5,检测结果表明,阴性对照除残留引物外,无任何非特异条带,说明反应体系是无污染;阳性对照条带明亮,大小正确,说明反应体系的扩增能力正常。3例样品共6个最终扩增产物主要集中在300bp,无其他非特异性条带,与预期设计相符,同时引物二聚体含量极少,且引物二聚体大小与扩增目标片段差异明显。同时,不同的操作员及不同的实验平台检测结果无明显差异。由此可以看出,本实施例的PCR特异性扩增引物及检测方法重复性好。

实施例5引物浓度优化验证

利用实施例1中步骤S11方法从质检合格的全血样品(编号:3)、细针穿刺组织(编号:6)、石蜡组织样品(编号:9)提取样品核酸稀释至100ng/μL后进行引物浓度优化验证。利用实施例1中步骤S12方法对上述3例合格样本进行扩增,根据特异引物与通用引物在扩增体系中的循环数的不同,设置特异引物浓度为0.2nM、1nM、2nM,设置通用引物浓度为0.2μM、0.4μM。核酸样品上样量为各2μL,扩增后产物纯化后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测(合格标准同实施例1中步骤S13步骤),3例样本使用不同浓度的特异、通用引物扩增及检测方法进行检测。对照试验同实施例1,检测方法与样本检测方法相同。

检测结果见图6,检测结果表明,阴性对照除残留引物外,无任何非特异条带,说明反应体系是无污染;阳性对照条带明亮,大小正确,说明反应体系的扩增能力正常。3例样品检测结果一致,特异引物为0.2nM时,最终扩增产物主要集中在300bp,无其他非特异性条带,与预期设计相符,同时引物二聚体含量极少,而特异引物为1和2nM时,引物二聚体含量显著增加。通用引物浓度为0.4μM的扩增效果优于0.2μM。根据扩增效果,本实施例的PCR特异引物浓度优选地为0.2nM、通用引物为0.4μM。

实施例6PCR反应条件优化验证

利用实施例1中步骤S11方法从质检合格的全血样品(编号:3)、细针穿刺组织(编号:6)、石蜡组织样品(编号:9)提取样品核酸稀释至100ng/μL后进行PCR反应条件优化验证。利用实施例1中步骤S12方法对上述3例合格样本进行扩增,根据PCR退火温度对PCR效果的影响显著,设置PCR退火温度为58℃、62℃、66℃。核酸样品上样量为各2μL,扩增后产物纯化后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测(合格标准同实施例1中步骤S13步骤),3例样本使用不同PCR退火温度进行检测。对照试验同实施例1,检测方法与样本检测方法相同。

检测结果见图7,检测结果表明,阴性对照除残留引物外,无任何非特异条带,说明反应体系是无污染;阳性对照条带明亮,大小正确,说明反应体系的扩增能力正常。3例样品检测结果一致,退火温度为62℃时,最终扩增产物主要集中在300bp,无其他非特异性条带,与预期设计相符,同时引物二聚体含量极少,效果最优。而66℃的退火温度明显扩增效率低,58℃的退火温度引物特异性差。根据扩增效果,本实施例的PCR退火温度为62℃。

实施例7甲状腺癌转移相关基因的检测试剂盒适用样品验证

利用实施例1中步骤S11方法从外周血样本(编号:10-12)、细针穿刺样本(编号:13-15)、石蜡组织样本(编号:16-18)中提取核酸,进行浓度、纯度测定后,利用1%琼脂糖凝胶电泳检测每例样本质量,电泳结果见图8,电泳显示外周血样本(编号:10-12)基因组条带完好,细针穿刺样本(编号:13-15)基因组条带显示有部分降解,而石蜡组织样本(编号:16-18)基因组条带显示均有严重的降解。利用实施例1中步骤S12方法对上述9例样本进行扩增,上样量为各2μL,扩增后产物纯化后进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。9例样本使用甲状腺癌转移相关基因特异引物扩增及检测方法进行检测。对照试验同实施例1,检测方法与样本检测方法相同。

检测结果见图9,电泳检测结果显明,阴性对照除残留引物外,无任何非特异条带,说明反应体系是无污染;阳性对照条带明亮,大小正确,说明反应体系的扩增能力正常。9例样本最终扩增产物主要集中在300bp,其中外周血样本和细针穿刺样本的扩增产物无其他非特异性条带,与预期设计相符,同时,基因组严重降解的石蜡组织样本也可以扩增出条带,尽管扩增产物有部分拖尾。由此可以看出,本实施例的甲状腺癌转移相关基因的检测试剂盒可检测的样本类型广,对于降解严重的石蜡组织样本也可以扩增出目标条带,这主要是我们考虑到了样本的降解情况,将引物扩增目标区域大小设计为100-150bp,这有利于引物捕获短片段,提高样本的建库成功率,能充分利用珍贵的样本或保存较长时间的石蜡组织样本中的基因组信息。

实施例8甲状腺癌转移相关基因的验证

步骤S81:临床样本收集和临床资料整理

选择2016年1月至2017年8月于广东省人民医院进行淋巴结清扫手术的97例甲状腺癌患者(本研究经广东省人民医院伦理委员会批准,且征得所有患者知情同意),共有106枚结节,记录这些患者的手术病理结果。其中男性34例共37结节,女性36例共69结节,年龄34-69岁,平均年龄为48岁。通过淋巴结清扫手术确定共有37例患者的甲状腺癌发生转移,共42枚结节,剩余60例患者的甲状腺癌未发生转移,共64枚结节。

步骤S82:验证样本的筛选

从步骤S81收集已确定为甲状腺癌转移的患者和未发生甲状腺癌转移的患者的甲状腺癌细针穿刺样本,使用计算机对甲状腺癌细针穿刺样本随机选取60例,整理随机选取的样本的详细病理资料,整理结果显示转移的甲状腺癌细针穿刺样本有24例,未发生转移的甲状腺癌细针穿刺样本有36例。

步骤S83:甲状腺癌细针穿刺样本的DNA提取

参照广州奇辉生物科技有限公司商品化的细胞DNA提取试剂盒(cat.no.M1603S)说明书提取各甲状腺癌细针穿刺样本中的DNA,将提取的DNA置于-20℃冰箱中保存待用。

步骤S84:测序样本文库构建

按照实施例1中基于高通量测序技术检测甲状腺癌转移相关基因的方法进行测序样本文库构建。

步骤S85:对样本文库进行测序

使用illumina公司的Hiseq X高通量测序平台对样本文库进行测序,测序读长为150bp*2,测序结果要求平均测序深度大于100达95%,对不合格样本进行重测序。

步骤S86:测序结果分析

对测序结果序列进行BWA(version 0.7.12)比对,samtools(version 0.1.19)转换sam文件为bam文件,freebayes(version 1.1.0)进行突变分析,结合甲状腺癌转移相关基因组合,判断每个甲状腺癌细针穿刺样本是否发生转移。依据判断的结果和验证样本的临床病例资料,应用统计学得出3组基因组合的敏感性和特异性分析,如表2所示,证明这三组基因组合可用于诊断甲状腺癌是否发生转移的应用中。

表2

基因组合 敏感性 特异性 阳性预测率 阴性预测率 准确性 组合1 0.52 0.98 0.90 0.89 0.90 组合2 0.73 0.95 0.92 0.82 0.85 组合3 0.86 0.84 0.76 0.91 0.85

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 广东省人民医院(广东省医学科学院)

广州奇辉生物科技有限公司

<120> 甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物、试剂盒及其使用方法

<160> 34

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgccacggaa agtactccag 20

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcattttcct gaactggagg ca 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtggctagtg ttcctggtcc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgttggtgt cagtgactgt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctgcctcct ggactatgtc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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<210> 7

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cagagacttg gcagccagaa 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcagagaatg ggtactcacg t 21

<210> 9

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctggggcaga atagtgtgca 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ccaccaccac caccacag 18

<210> 11

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcaggaagtg gaaggagctg 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctggactgtg cggagcat 18

<210> 13

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

catcagcacc accaccacc 19

<210> 14

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

acgaccagta ctgcaaggac 20

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<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aatgactttt gctggtaaag tagtatg 27

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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caacgatggc tgtccctcaa 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cccttctgga ggagatcgct 20

<210> 18

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<212> DNA

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acaccgacaa ttaagatgga gtg 23

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cgtggcagga aacatccct 19

<210> 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

agatgcaggg acacacgatg 20

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

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<212> DNA

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ctcgtgctgc tcgactttg 19

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caatcagcgg tataatcagg agt 23

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gctgagaggg tgtcacatac c 21

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctcggaggat gctggatgat g 21

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gtcgagttgg acccttgttc 20

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58

<210> 34

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacatcacga tctcgtatgc cgtcttctgc 60

ttg 63

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资源描述

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810317112.8 (22)申请日 2018.04.10 (71)申请人 广东省人民医院 (广东省医学科学 院) 地址 510080 广东省广州市中山二路106号 申请人 广州奇辉生物科技有限公司 (72)发明人 邝建朱瑞娟赖水青朱奇 王龙郑泽鑫陈志江 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理 有限公司 44224 代理人 林青中万志香 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6869(2018.01) C12N 15/11。

2、(2006.01) (54)发明名称 甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性 引物、 试剂盒及其使用方法 (57)摘要 本发明公开了一种甲状腺癌转移相关基因 检测用的PCR特异性引物、 试剂盒及其使用方法。 本发明自主研发的基于高通量测序技术的针对 甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引 物、 试剂盒及其使用方法中涉及的甲状腺癌转移 相关基因已经过样本验证, 可用于检测甲状腺癌 转移相关基因的突变情况, 该检测结果可以作为 中间结果配合其他检测结果一起来判断是否有 癌细胞已发生转移或者是否有转移或复发的可 能, 对于甲状腺癌的治疗及预后具有重要的意 义。 并且, 本发明利用高通量基因测序。

3、技术突破 传统检测技术的限制, 提高了检测灵敏度, 即使 是低丰度的突变基因也可检测出来, 进而对于辅 助预测甲状腺癌细胞扩散和复发的可能性具有 重要的意义。 权利要求书2页 说明书12页 序列表6页 附图5页 CN 108315425 A 2018.07.24 CN 108315425 A 1.一种甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物, 其特征在于, 包括如下至少一 个基因检测用的扩增引物对: 序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的APC基因的扩增引 物对, 序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的CDH1基因的扩增引物对, 序列如SEQ ID 。

4、NO.5和SEQ ID NO.6所示的EGFR基因的扩增引物对, 序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所 示的KIT基因的扩增引物对, 序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的、 或如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的、 或如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的NOTCH1基因的扩 增引物对, 序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的、 或如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示的、 或如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的SMAD4基因的扩增引物对, 序列如。

5、 SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的VHL基因的扩增引物对, 序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的MLH1基因的扩增引物对, 序列如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的JAK3 基因的扩增引物对, 序列如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示的PIK3CA基因的扩增引物 对, 序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示的MAP2K1基因的扩增引物对, 以及序列如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的DDR2基因的扩增引物对。 2.如权利要求1所述的甲状腺癌转移相关基因检测用的。

6、PCR特异性引物, 其特征在于, 包括如下三组扩增引物对中的至少一组: 第一组包括如下基因的扩增引物对: APC基因、 CDH1基因、 EGFR基因、 KIT基因、 MAP2K1基 因、 NOTCH1基因、 SMAD4基因、 VHL基因; 第二组包括如下基因的扩增引物对: APC基因、 CDH1基因、 DDR2基因、 EGFR基因、 KIT基 因、 MLH1基因、 NOTCH1基因、 PIK3CA基因; 第三组包括如下基因的扩增引物对: APC基因、 CDH1基因、 DDR2基因、 EGFR基因、 JAK3基 因、 KIT基因、 MLH1基因、 NOTCH1基因、 PIK3CA基因、 VHL基。

7、因。 3.如权利要求1或2所述的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物, 其特征在 于, 所述扩增引物对的各引物经过硫代修饰、 脱氧尿嘧啶修饰及5 反向dT修饰中的一种或 多种修饰。 4.如权利要求1或2所述的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物, 其特征在 于, 所述扩增引物对的Tm值为602。 5.如权利要求1或2所述的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物, 其特征在 于, 所述扩增引物对的两条引物的5 端分别连接有长度为50bp70bp的用于与通用引物对 的相应引物完全互补的序列片段或与通用引物对的相应引物的3 端的部分序列互补的序 列片段。 6.如权利要求5所述的。

8、甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物, 其特征在于, 所述通用引物对的两条引物的序列如SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示。 7.一种甲状腺癌转移相关基因检测用的试剂盒, 其特征在于, 包括如权利要求16中 任一项所述的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物。 8.如权利要求7所述的甲状腺癌转移相关基因检测用的试剂盒, 其特征在于, 所述试剂 盒还包括DNA提取试剂、 PCR扩增缓冲液、 通用引物对、 DNA聚合酶及无核酸水中的至少一种。 9.如权利要求8所述的甲状腺癌转移相关基因检测用的试剂盒, 其特征在于, 所述试剂 盒还包括人正常基因组DNA的质控品。 1。

9、0.一种如权利要求79中任一项所述的甲状腺癌转移相关基因检测用的试剂盒的使 权利要求书 1/2 页 2 CN 108315425 A 2 用方法, 其特征在于, 包括如下步骤: 提取待测甲状腺癌样本的DNA; 使用所述试剂盒中的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物对提取的DNA样 本进行PCR扩增; 对PCR扩增的产物进行测序分析。 权利要求书 2/2 页 3 CN 108315425 A 3 甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物、 试剂盒及其 使用方法 技术领域 0001 本发明涉及分子生物学领域, 尤其是涉及一种甲状腺癌转移相关基因检测用的 PCR特异性引物、 试剂盒及其使。

10、用方法。 背景技术 0002 甲状腺是人体最大的内分泌器官, 甲状腺癌是常见的内分泌肿瘤。 甲状腺肿瘤分 为良性和恶性, 其中, 甲状腺恶性肿瘤包括乳头状癌、 滤泡状癌、 髓样癌以及未分化癌共四 大类。 分化型甲状腺癌占所有甲状腺癌的90, 未分化甲状腺癌较少见, 但恶性程度高, 预 后差。 0003 近30年来, 包括我国在内的世界大多数地区的甲状腺癌发病率呈持续上升趋势。 2010年我国甲状腺癌发病率为4.12/10万, 男性1.93/10万, 女性6.42/10万; 同期我国甲状 腺癌死亡率为0.34/10万, 男性0.23/10万, 女性0.46/10万。 甲状腺癌已是女性中最常见的 。

11、恶性肿瘤之一, 在韩国, 女性人群中甲状腺癌的发病率为89/10万, 居于女性常见恶性肿瘤 中的首位。 0004 甲状腺癌患者的预后有一部分取决于甲状腺癌是否已扩散(转移)。 虽然分化型甲 状腺癌的远处转移率很低, 但是转移仍是常见的致死原因, 分化型甲状腺癌的复发风险很 大程度上取决于有无局部或远处转移。 2009年美国甲状腺学会的指南中阐述了分化型甲状 腺癌患者的复发风险, 其中高复发风险与低复发风险的区别为甲状腺癌发生广泛扩散, 有 远处转移或有其他高危因素。 因此, 对甲状腺癌患者的转移或复发的可能性进行准确地评 估, 对于甲状腺癌的治疗和预后具有重要的意义。 0005 目前检测肿瘤转。

12、移的方法有组织连续切片HE染色观察法、 免疫组织化学方法、 流 式细胞术、 PCR/RT-PCR技术和高通量测序法等。 常规连续切片HE染色法敏感性低, 需要切几 十甚至几百张切片, 近年来已很少使用; 免疫组化法操作较简单, 敏感性和特异性较高, 但 比较费时, 且容易出现假阳性、 假阴性; 流式细胞术优点是速度快、 精度高、 准确性好, 但缺 点是需要特异性的荧光染料且仪器和试剂成本较高; PCR/RT-PCR技术是通过扩增出肿瘤细 胞标志性基因或靶RNA来检测肿瘤的转移, 最大的优点是灵敏度高, 但PCR的方法只能针对 一个或数个已知突变的位点设计检测, 无法用于检测未知突变; 高通量测。

13、序法是新一代测 序技术, 可以多样本的进行高通量的测序, 耗时短、 精度高、 数据量大, 既可以检测已知突变 位点, 也可以用于检测未知突变。 0006 虽然高通量测序技术现在已广泛应用于未知突变的检测, 但受限于众多的甲状腺 癌转移的相关基因以及扩增引物的设计, 目前仍未有有效地、 准确性高且使用方便的针对 甲状腺癌转移相关基因的检测用的PCR特异性引物及与之相关的检测方法。 发明内容 0007 基于此, 有必要提供一种准确性高且使用方便的甲状腺癌转移相关基因检测用的 说明书 1/12 页 4 CN 108315425 A 4 PCR特异性引物、 试剂盒及其使用方法。 0008 一种甲状腺癌。

14、转移相关基因检测用的PCR特异性引物, 包括如下至少一个基因检 测用的扩增引物对: 序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的APC基因的扩增引物对, 序列 如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的CDH1基因的扩增引物对, 序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的EGFR基因的扩增引物对, 序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的KIT基因 的扩增引物对, 序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的、 或如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的、 或如SEQ ID NO.13和SEQ ID 。

15、NO.14所示的NOTCH1基因的扩增引物对, 序列如 SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的、 或如SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示的、 或如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的SMAD4基因的扩增引物对, 序列如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的VHL基因的扩增引物对, 序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的MLH1基因 的扩增引物对, 序列如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的JAK3基因的扩增引物对, 序列 如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所。

16、示的PIK3CA基因的扩增引物对, 序列如SEQ ID NO.29和 SEQ ID NO.30所示的MAP2K1基因的扩增引物对, 以及序列如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32 所示的DDR2基因的扩增引物对。 0009 在其中一个实施例中, 所述甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物包括 如下三组扩增引物对中的至少一组: 0010 第一组包括如下基因的扩增引物对: APC基因、 CDH1基因、 EGFR基因、 KIT基因、 MAP2K1基因、 NOTCH1基因、 SMAD4基因、 VHL基因; 0011 第二组包括如下基因的扩增引物对: APC基因、 CDH1基因、 D。

17、DR2基因、 EGFR基因、 KIT 基因、 MLH1基因、 NOTCH1基因、 PIK3CA基因; 0012 第三组包括如下基因的扩增引物对: APC基因、 CDH1基因、 DDR2基因、 EGFR基因、 JAK3基因、 KIT基因、 MLH1基因、 NOTCH1基因、 PIK3CA基因、 VHL基因。 0013 在其中一个实施例中, 所述扩增引物对的各引物经过硫代修饰、 脱氧尿嘧啶修饰 及5 反向dT修饰中的一种或多种修饰。 0014 在其中一个实施例中, 所述扩增引物对的Tm值为60+2。 0015 在其中一个实施例中, 所述扩增引物对的两条引物的5 端分别连接有长度为50bp 70bp。

18、的用于与通用引物对的相应引物完全互补的序列片段或与通用引物对的相应引物 的3 端的部分序列互补的序列片段。 0016 在其中一个实施例中, 所述通用引物对的两条引物的序列如SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示。 0017 一种甲状腺癌转移相关基因检测用的试剂盒, 包括上述任一实施例所述的甲状腺 癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物。 0018 在其中一个实施例中, 所述试剂盒还包括DNA提取试剂、 PCR扩增缓冲液、 通用引物 对、 DNA聚合酶及无核酸水中的至少一种。 0019 在其中一个实施例中, 所述试剂盒还包括人正常基因组DNA的质控品。 0020 一种甲状腺癌转移。

19、相关基因检测用的试剂盒的使用方法, 其特征在于, 包括如下 步骤: 0021 提取待测甲状腺癌样本的DNA; 0022 使用所述试剂盒中的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物对提取的 说明书 2/12 页 5 CN 108315425 A 5 DNA样本进行PCR扩增; 0023 对PCR扩增的产物进行测序分析。 0024 在其中一个实施例中, 是使用磁珠法提取待测甲状腺癌样本的DNA。 0025 在其中一个实施例中, 还包括对提取的待测甲状腺癌样本的DNA进行浓度和纯度 测定的步骤, 以及对PCR扩增的产物进行纯化和浓度测定的步骤。 0026 在其中一个实施例中, 所述PCR扩增的反。

20、应体系为: 0027 0028 所述酶混合物包括: 高保真DNA聚合酶(终浓度为1.25U/反应)、 PCR缓冲液(成分为 50mM KCl、 1.5mM MgCl2、 10mM Tris-HCl, pH为8.3, 用量为1)、 dNTP混合物(用量为200 M/ 种/反应)等。 0029 在其中一个实施例中, 所述PCR扩增的反应程序为: 0030 98, 激活20min; 循环1次; 98变性15s, 62退火60min, 72延伸60s, 共6个循 环; 98变性15s, 62退火30s, 72延伸60s, 共2个循环; 98变性15s, 72延伸60s, 共28 个循环; 72延伸10。

21、min。 0031 在其中一个实施例中, PCR扩增的目标区域可来源于同一个甲状腺癌转移相关基 因, 也可来源于不同的甲状腺癌转移相关基因; 包括但不限于甲状腺癌转移相关基因上的 内部序列、 基因的外部调控序列; 所述基因内部序列, 包括但不限于基因的内含子区域、 外 显子区域、 同时含有内含子与外显子的区域。 0032 进一步的, 待测甲状腺癌样本可以是离体的外周血样品、 细针穿刺活检样品或石 蜡组织样品。 0033 在其中一个实施例中, 所述测序分析是使用Illumina公司的高通量测序平台对 PCR扩增产物进行测序, 再用统计学处理测序结果, 对甲状腺癌转移相关基因的突变情况进 行分析,。

22、 分析结果可作为中间结果为临床诊断甲状腺癌是否已经转移或有转移或复发的可 能提供辅助, 可进一步结合其他结果验证甲状腺癌是否已经转移或有其他可能。 0034 所述高通量测序平台可以是但不限于Illumina HiSeq/MiSeq、 Life Ion Torrent/Proton平台或华大基因BGISEQ-500/50等测序平台。 0035 本发明的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引物、 试剂盒及其使用方法 具有以下有益效果: 0036 本发明自主研发的基于高通量测序技术的针对甲状腺癌转移相关基因检测用的 PCR特异性引物、 试剂盒及其使用方法中涉及的甲状腺癌转移相关基因已经过样本验证。

23、, 可 用于检测甲状腺癌转移相关基因的突变情况, 该检测结果可以作为中间结果配合其他检测 结果一起来判断是否有癌细胞已发生转移或者是否有转移或复发的可能, 对于甲状腺癌的 辅助诊断、 治疗方案的制定及预后处理具有重要的意义。 说明书 3/12 页 6 CN 108315425 A 6 0037 研究发现, 甲状腺癌在新发现癌症中的占比约1.5, 部分甲状腺癌会发生局部浸 润和远处转移。 CT扫描和MR是诊断甲状腺癌转移的传统检测方法。 CT扫描会使受检者暴露 在离子射线下, 对受检者有一定危害, 限制了对部分受检者(如孕妇等)的检查。 MR检测不仅 费用昂贵, 对体内装有金属体、 体内植入心脏。

24、起搏器、 电子耳蜗等受检者, 以及超肥胖者都 有限制要求。 不仅如此, CT扫描和MR检查对早期转移敏感性不高。 随着甲状腺超声检查的普 及, 甲状腺癌转移率会越来越高, 现在还没有稳定地且高敏感性、 高特异性的辅助方法解决 上述问题。 随着对基因检测技术的深入研究, 学者发现多基因联合对疾病的检验比单一基 因检测有更高的特异性和敏感性。 本发明的甲状腺癌转移相关基因检测用的PCR特异性引 物, 在不用进行手术的情况下, 只要通过对甲状腺结节细针穿刺样品进行分析就可以实现 对甲状腺癌转移的较为准确的辅助诊断, 进而指导治疗方案的制定。 对甲状腺癌转移的准 确辅助诊断, 可以实现对疾病的早发现、。

25、 早干预、 早治疗, 减少由于漏诊导致的不可挽回的 后果。 同时, 对于无转移的甲状腺癌, 可以避免过度治疗, 因此, 通过本发明的PCR特异性引 物不仅可以节省治疗费用, 还可以在一定程度上提高患者的生活质量。 0038 进一步, 本发明通过二元回归模型来研究不同的甲状腺结节良恶性及转移相关基 因与甲状腺癌转移之间的关系, 充分考虑检测的敏感性和特异性, 在对测序结果分析时, 可 以将多个不同基因的测序结果进行分组分析, 来达到预测甲状腺癌转移的目的。 相应地的, 该PCR特异性引物需要至少含有多组基因组合中的至少一种组合所包括的扩增引物对。 具 体地, 第一组基因组合主要考虑了甲状腺癌转移。

26、预测的高特异性和高阳性预测率, 由此可 以避免非甲状腺癌转移患者的过度医疗。 第二组在第一组基因的基础上, 替换了部分基因, 目的是保证在较高特异性的情况下, 提高预测的敏感性, 进而减少甲状腺癌转移的漏检率。 第三组加入了更多的基因, 目的是均衡特异性和敏感性, 提高预测准确率。 同时由于不同基 因突变在不同样本中的检出率不一致, 本发明通过三组不完全相同的基因, 可以提高样本 的检出率。 0039 本发明提供的PCR特异性引物是针对甲状腺癌转移相关基因的热点突变设计的引 物, 结构稳定, 检测位点多, 能够用一次PCR扩增反应捕获和扩增多个样本多个甲状腺癌转 移相关基因, 包括点突变、 短。

27、片段插入缺失等体细胞突变, 有效提高检测效率和准确率, 同 时具有降低成本、 简化操作步骤等优点。 0040 本发明通过对不同的甲状腺癌转移相关基因进行分析研究, 并充分考虑检测时的 敏感性和特异性, 将多种不同的甲状腺癌转移相关基因进行分组分析。 在保证检测高准确 率的情况下, 实现了适合所有人群的低成本、 微创无危害的甲状腺癌转移的检测及辅助诊 断, 从而使所有受检者都能得到及时地检查, 达到对甲状腺癌转移的早发现、 早治疗的目 的。 本发明通过对不同的甲状腺癌转移相关基因进行分析研究的成果, 可以为医生制定治 疗法案提供可靠的参考。 对于甲状腺癌转移患者可以减少漏诊率, 使其得到及时治疗。

28、。 对于 无甲状腺癌无转移患者可以降低因过度医疗造成的人力、 财力的浪费。 由于本发明通过对 不同的甲状腺癌转移相关基因进行分析研究方法的低成本、 微创无危害的特性, 使预后随 访、 检查更简单、 方便, 在此基础上, 可以根据病情的进展和治疗效果, 及时调整治疗方案。 0041 本发明的检测方法可以进一步采用磁珠纯化核酸的方式, 省去了传统建库中的离 心柱式纯化, 操作简单; 其次, 本发明针对高通量测序技术设计的引物只需要一轮PCR, 通过 选取温度梯度、 时间梯度、 循环数经过大量正交实验, 优化PCR反应程序, 将样品传统建库的 说明书 4/12 页 7 CN 108315425 A 。

29、7 两次扩增融合在一个PCR反应体系进行, 且本发明所用的特异性引物直接在目标基因链中 捕获目标区域并进行扩增, 不需要对目标基因进行截断修饰等处理, 节省了检测时间和成 本。 0042 并且, 本发明利用高通量基因测序技术突破传统检测技术的限制, 提高了检测灵 敏度, 即使是低丰度的突变基因也可检测出来, 进而对于辅助预测甲状腺癌细胞扩散和复 发的可能性具有重要的意义。 附图说明 0043 图1为目标基因建库PCR扩增的原理示意图。 0044 图2为检测甲状腺癌相关基因的检测方法流程示意图。 0045 图3为引物特异性验证结果图, 从左至右的各泳道中的条带依次为M、 N、 P、 1至9, 其。

30、 中, M: Marker; N: 阴性对照; P: 阳性对照; 1-3: 1-3号外周血样品验证; 4-6: 4-6号细针穿刺样 品验证; 7-9: 7-9号石蜡组织样品验证。 0046 图4为引物灵敏度验证结果图, 从左至右的各泳道中的条带依次为M、 N、 P、 1至9, 其 中, M: Marker; N: 阴性对照; P: 阳性对照; 1-3: 1号外周血样品三种模板浓度灵敏度验证; 4- 6: 4号细针穿刺细胞样品三种模板浓度灵敏度验证; 7-9: 7号石蜡组织样品三种模板浓度灵 敏度验证。 0047 图5为引物重复性验证结果, 从左至右的各泳道中的条带依次为M、 N、 P、 1至6。

31、, 其 中, M: Marker; N: 阴性对照; P: 阳性对照; 1-3: 实验员A检测2号外周血样品、 5号细针穿刺组 织样品、 8号石蜡组织样品验证结果; 4-6: 实验员B检测2号外周血样品、 5号细针穿刺组织样 品、 8号石蜡组织样品验证结果。 0048 图6为引物浓度优化验证结果, 从左至右的各泳道中的条带依次为M、 N、 P、 1至18, 其中, M: Marker; N: 阴性对照; P: 阳性对照; 1-18: 3号外周血样品、 6号细针穿刺细胞样品、 9 号石蜡组织样品分别检测引物0.2 M/0.2nM、 0.2 M/1nM、 0.2 M/2nM、 0.4 M/0.2n。

32、M、 0.4 M/ 1nM、 0.4 M/2nM六组组合共18个验证结果。 0049 图7为PCR反应条件优化验证结果, 从左至右的各泳道中的条带依次为M、 N、 P、 1至 9, 其中, M: Marker; N: 阴性对照; P: 阳性对照; 1-9: 3号外周血样品、 6号细针穿刺细胞样品、 9 号石蜡组织样品分别检测退火温度58、 62、 66三组组合共9个验证结果。 0050 图8为甲状腺结节良恶性相关基因的检测试剂盒适用样品验证中所用样品的基因 组电泳图, 从左至右的各泳道中的条带依次为M、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9, 其中, M: Marker; 1-3。

33、: 10-12号外周血样品基因组条带; 4-6: 13-15号细针穿刺组织样品基因组条带; 7-9: 16-18号 石蜡组织样品基因组条带。 0051 图9为甲状腺结节良恶性相关基因的检测试剂盒适用样品验证结果, 从左至右的 各泳道中的条带依次为M、 N、 P、 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9, 其中, M: Marker; N: 阴性对照; P: 阳性对 照; 1-3: 10-12号外周血样品验证结果; 4-6: 13-15号细针穿刺组织样品验证结果; 7-9: 16- 18号石蜡组织样品验证结果。 具体实施方式 0052 为了便于理解本发明, 下面将参照相关附图对本发明。

34、进行更全面的描述。 附图中 说明书 5/12 页 8 CN 108315425 A 8 给出了本发明的较佳实施例。 但是, 本发明可以以许多不同的形式来实现, 并不限于本文所 描述的实施例。 相反地, 提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻 全面。 0053 除非另有定义, 本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的 技术人员通常理解的含义相同。 本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具 体的实施例的目的, 不是旨在于限制本发明。 0054 实施例1一种基于高通量测序技术的甲状腺癌转移相关基因检测用的多重PCR特 异性引物、 试剂盒及检测方法 0055。

35、 1、 引物的设计 0056 本实施例涉及的甲状腺癌转移相关基因序列选自于UCSC(University of California Santa Cruz, 加州大学圣克鲁兹分校)数据库, 依据相关基因序列进行热点突 变引物设计, 设计范围包含了甲状腺癌转移相关基因中的突变热点。 0057 如图1所示, 本实施例对甲状腺癌转移相关基因的热点突变进行的引物设计共16 对, 每对PCR特异性引物扩增目标区域大小为100-150bp, 扩增产物大小为250-300bp, 覆盖 范围广、 结构稳定、 检测位点多。 0058 具体地, 16对扩增引物对为如下表1中12个基因的扩增引物对: 0059 表1。

36、 说明书 6/12 页 9 CN 108315425 A 9 0060 0061 在本实施例中, 扩增引物对的两条引物的5 端分别连接有长度为5070bp的用于 与通用引物完全互补的序列片段或与通用引物的3 端的部分序列互补的序列片段。 通用引 物对的 两条 引物的 序列如SEQ ID NO .33 (5-AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 ) 和SEQ ID NO .34 (5- GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG。

37、-3 )所示。 0062 本实施例的PCR特异引物设计时引进特异性修饰, 修饰后的引物不易被核酸酶降 解, 且具有相对均一的Tm值, 统一设计为60左右(2)。 本实施例的特异性引物在多重 扩增时表现出很好的特异性、 稳定性及均一性, 同时不存在非特异扩增。 具体地, 引物特异 修饰方法为硫代修饰、 脱氧尿嘧啶修饰、 5 反向dT修饰中的一种或几种。 硫代修饰后的引物 序列寡核苷酸链上带双键的氧原子被硫原子取代的衍生物, 能够抵抗核酸酶的降解, 增强 引物稳定性; 脱氧尿嘧啶修饰后的引物寡核苷酸序列中每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧尿嘧啶替 代, 可以增长双链溶解温度1.7, 从而增加双链的稳定性; 5。

38、 反向dT修饰后的引物寡核苷 酸序列5 末端含有反向dT, 从而形成交联, 形成的交联可以抑制在DNA聚合酶延伸过程中的 说明书 7/12 页 10 CN 108315425 A 10 外切核酸酶的降解作用。 0063 进一步, 本实施例的PCR特异性引物在确保PCR扩增特异性的同时还能保证其扩增 效率。 0064 2、 甲状腺癌转移相关基因检测用的试剂盒 0065 本实施例的试剂盒, 主要包括: 0066 上述PCR特异性引物: 用于扩增待测样品核酸中的多个目标区域, 扩增范围至少覆 盖目标基因的热点突变区域。 优选的, 多种扩增引物对混合在一起构成引物混合物。 0067 通用引物: 用于在。

39、文库构建过程中, 对特异引物扩增目标区域的扩增产物进行再 次扩增, 对不同待测样品的测序文库进行标记, 进而区分不同样品, 序列如SEQ ID NO.33和 SEQ ID NO.34所示。 0068 PCR反应液: 包括酶混合物、 无核酸酶水。 其中, 酶混合物包括高保真DNA聚合酶(用 量为1.25U/反应)、 PCR Buffer(成分为50mM KCl、 1.5mM MgCl2、 10mM Tris-HCl, pH为8.3, 用量为1)、 dNTP混合物(用量为200 M/种/反应)。 0069 质控品: 人正常基因组DNA, 来源于正常人全血样本。 0070 3、 基于高通量测序技术甲。

40、状腺癌转移相关基因的检测方法 0071 如图2所示, 本实施例的检测方法包括以下步骤: 0072 步骤S11: 利用纳米级超顺磁性羧基磁珠在不同盐浓度及疏水环境下与核酸分子 可逆吸附的原理, 特异吸附核酸分子, 通过后续地洗涤及洗脱步骤, 获得高纯度的核酸样 本, 使用Qubit或NanoDrop进行浓度及纯度的测定, 根据测定的核酸样本浓度结果, 使用 10mM Tris将核酸样本稀释至50-250ng/ L, 优选的50-100ng/ L作为扩增建库的起始浓度。 使用1琼脂糖凝胶电泳40min, 对稀释后核酸的质量进行评估, 根据琼脂糖凝胶电泳结果 的均一性及完整性判断提取核酸的质量, 核。

41、酸完整性好或发生轻微降解不影响建库效果。 所提取的核酸浓度、 纯度测定及1琼脂糖凝胶电泳检测合格后入组并分别进行标记。 所述 样本合格的标准为核酸浓度50ng/ L, OD260/OD2801.7-2.0, 1琼脂糖凝胶电泳检测 样品条带完整、 均一, 无明显拖尾。 0073 步骤S12: 用本实施例的PCR特异性引物或试剂盒对S11中待测样品核酸中的易感 基因目标区域进行一次PCR扩增, 收集扩增产物, 扩增产物片段长度为特异引物扩增片段与 通用引物之和。 0074 PCR扩增的反应体系为: 特异引物混合物2 L、 通用引物2 L、 模板/质控品200ng、 酶 混合物12.5 L、 无核酸。

42、酶水将体积补足至25 L。 0075 PCR扩增的反应程序为: 0076 98, 激活20min; 循环1次; 98变性15s, 62退火60min, 72延伸60s, 共6个循 环; 98变性15s, 62退火30s, 72延伸60s, 共2个循环; 98变性15s, 72延伸60s, 共28 个循环; 72延伸10min。 0077 当待测甲状腺癌转移相关基因有多个时, 同一待测样品的不同甲状腺癌转移相关 基因的扩增可同时进行或部分同时进行。 在具体的实验过程中, 可根据需要选用上述任一 种基因组合的方案进行。 若分别进行扩增时, 需要保证用于构建测序文库的扩增产物的量 是一致的。 当待测。

43、样品有多个时, 不同样品的甲状腺癌转移相关基因的扩增必须分别进行。 0078 步骤S13: 利用纯化磁珠分别对各样品的建库产物进行纯化, 去除PCR产物中剩余 说明书 8/12 页 11 CN 108315425 A 11 的引物及dNTP等, 回收扩增产物, 进行浓度、 纯度测定及1琼脂糖凝胶电泳检测样品质量, 所述样本合格的标准为核酸浓度2ng/ L, OD260/OD2801.7-2.0, 1琼脂糖凝胶电泳检 测样品条带完整、 均一, 无明显拖尾。 将所有合格核酸样品(不超过96个)浓度分别稀释至 2nmol/L, 并等体积混样, 统一上机测序。 0079 对照试验: 0080 阳性对照。

44、反应体系包括: 特异引物混合物2 L; 通用引物2 L; 酶混合物12.5 L; 质 控品200ng; 无核酸酶水将体积补足至25 L。 阳性对照用于检查反应体系的扩增能力是否正 常和样本是否异常。 0081 阴性对照反应体系包括: 特异引物混合物2 L; 通用引物2 L; 酶混合物12.5 L; 无 核酸酶水将体积补足至25 L。 阴性对照用于检查反应体系是否存在核酸物质污染。 0082 阳性对照和阴性对照的反应程序同步骤S12的扩增反应程序。 0083 实施例2引物特异性验证 0084 利用实施例1中步骤S11方法从外周血样品(编号: 1-3)、 细针穿刺样品(编号: 4- 6)、 石蜡组。

45、织样品(编号: 7-9)中提取核酸, 进行浓度、 纯度测定后, 取合格样品使用10mM Tris将每例样品稀释至100ng/ L, 利用1琼脂糖凝胶电泳检测每例样品质量(合格标准同 实施例1中步骤S11), 合格后入组并分别进行标记。 利用实施例1中步骤S12方法对上述9例 合格样本进行扩增, 上样量为各2 L, 扩增后产物纯化后进行1琼脂糖凝胶电泳检测(合格 标准同实施例1中步骤S13步骤), 9例样本使用甲状腺癌转移相关基因特异引物扩增及检测 方法进行检测。 对照试验同实施例1, 检测方法与样本检测方法相同。 0085 检测结果见图3, 检测结果表明, 阴性对照除残留引物外, 无任何非特异。

46、条带, 说明 反应体系是无污染; 阳性对照条带明亮, 大小正确, 说明反应体系的扩增能力正常。 9例样本 最终扩增产物主要集中在300bp, 无其他非特异性条带, 与预期设计相符, 同时引物二聚体 含量极少, 且引物二聚体大小与扩增目标片段差异明显。 由此可以看出, 本实施例的PCR特 异性扩增引物及检测方法能突破传统方法产生大量引物二聚体的限制, 增强了引物特异 性。 0086 实施例3引物检测灵敏度验证 0087 利用实施例1中步骤S11方法从质检合格的外周血样品(编号: 1)、 细针穿刺样品 (编号: 4)、 石蜡组织样品(编号: 7)提取样品核酸进行引物检测灵敏度验证。 每例样品起始 。

47、浓度为100ng/ L, 按照5倍、 10倍、 20倍浓度梯度稀释, 稀释后每例样品浓度分别为20ng/ L、 10ng/ L和5ng/ L, 并分别进行样品名称及浓度标记。 利用实施例1中步骤S12方法对上述9 例合格稀释样本进行扩增, 上样量为各2 L, 9例样本使用甲状腺癌转移相关基因特异引物 扩增及检测方法进行检测。 对照试验同实施例1, 检测方法与样本检测方法相同。 0088 检测结果见图4, 检测结果表明, 阴性对照除残留引物外, 无任何非特异条带, 说明 反应体系是无污染; 阳性对照条带明亮, 大小正确, 说明反应体系的扩增能力正常。 9例样本 最终扩增产物主要集中在300bp,。

48、 无其他非特异性条带, 与预期设计相符, 引物二聚体含量 极少, 且引物二聚体大小与扩增目标片段差异明显, 易分辨。 同时, 即使模板含量低至10ng, 依然能够成功扩增出目标条带, 由此可以看出, 本实施例的PCR特异性扩增引物及检测方法 能突破传统方法的限制, 提高了检测灵敏度。 0089 实施例4引物检测重复性验证 说明书 9/12 页 12 CN 108315425 A 12 0090 利用实施例1中步骤S11方法从质检合格的全血样品(编号: 2)、 细针穿刺组织(编 号: 5)、 石蜡组织样品(编号: 8)提取样品核酸进行引物检测重复性验证。 由2名不同的操作 员在2个不同的实验室平。

49、台按照实施例1中步骤S12方法对上述3例样品分别进行扩增, 上样 量为各2 L, 3例样本使用甲状腺癌转移相关基因特异引物由不同操作员在不同实验室得到 的9个扩增及检测方法进行检测。 对照试验同实施例1, 检测方法与样本检测方法相同。 0091 检测结果见图5, 检测结果表明, 阴性对照除残留引物外, 无任何非特异条带, 说明 反应体系是无污染; 阳性对照条带明亮, 大小正确, 说明反应体系的扩增能力正常。 3例样品 共6个最终扩增产物主要集中在300bp, 无其他非特异性条带, 与预期设计相符, 同时引物二 聚体含量极少, 且引物二聚体大小与扩增目标片段差异明显。 同时, 不同的操作员及不同的 实验平台检测结果无明显差异。 由此可以看出, 本实施例的PCR特异性扩增引物及检测方法 重复性好。 0092 实施例5引物浓度优化验证 0093 利用实施例1中步骤S11方法从质检合格的全血样品。

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