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1、10申请公布号CN101955509A43申请公布日20110126CN101955509ACN101955509A21申请号201010529863X22申请日20101103C07K5/037200601C07K1/1420060171申请人温州大学地址325000浙江省温州市茶山高教园区72发明人吴祥庭74专利代理机构温州瓯越专利代理有限公司33211代理人吴继道54发明名称萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法57摘要本发明涉及一种萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法，其特征在于用双水相溶液萃取酵母菌液中的谷胱甘肽，所述的双水相溶液为PEG/NA2CO3双水相溶液，所述的PEG/NA2CO3双水相溶液的。
2、PEG质量浓度为2060，NA2CO3浓度为03MOL/L15MOL/L，萃取温度为2040，萃取PH值为610。本发明萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法具有操作简单、（常温）条件温和、选择性高、收率高、能耗较小、有机溶剂残留少,能实现快速分离、易于进行连续化操作等一系列优点。51INTCL19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页附图4页CN101955509A1/1页21一种萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法，其特征在于用双水相溶液萃取酵母菌液中的谷胱甘肽，所述的双水相溶液为PEG/NA2CO3双水相溶液，所述的PEG/NA2CO3双水相溶液的PEG质量浓度为2060，N。
3、A2CO3浓度为03MOL/L15MOL/L，萃取温度为2040，萃取PH值为610。2根据权利要求1所述的萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法，其特征在于所述的PEG/NA2CO3双水相溶液的PEG浓度39，NA2CO3浓度为06MOL/L，萃取PH值为9，温度32。3根据权利要求1或2所述的萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法，其特征在于所述的PEG分子量为600或1000或2000或4000或6000。4根据权利要求3所述的萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法，其特征在于所述的PEG分子量为6000。5根据权利要求1或2或4所述的萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法，其特征在于包括以下步骤1、将冰冻状态下的酵母菌液在常。
4、温下解冻，破碎，将酵母菌悬液于4000R/MIN，离心20MIN，沉淀，取上清液；2、将步骤1的上清液加入至PEG/NA2CO3双水相溶液，并且加入NA2HPO4与NAH2PO4溶液调整萃取PH值；3、将步骤2的溶液充分混合后，静置，得到上下相谷胱甘肽萃取溶液。权利要求书CN101955509A1/6页3萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法技术领域0001本发明涉及谷胱甘肽萃取技术领域，具体涉及一种萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法。背景技术0002谷胱甘肽（GLUTATHION，简称GSH）是由谷氨酸半胱氨酸和甘氨酸通过肽键缩合而成的三肽化合物，是一种用途广泛的活性短肽。谷胱甘肽具有抗氧化、清除自由基、解。
5、毒、增强免疫力、延缓衰老、抗癌、抗放射线危害等功能，是重要的功能因子，在食品工业、医药工业中应用非常广泛。由于谷胱甘肽本身的解毒和抗氧化能力，使得谷胱甘肽具有重要的保肝护肝作用。临床上应用还原型谷胱甘肽作为保肝的重要药物成分。自1938年发表了由酵母备制谷胱甘肽的最早专利以来，还原型谷胱甘肽在临床上有着广泛的应用，它能够防止皮肤色素沉积、改善皮肤光泽，是治疗肝病、重金属中毒、放射性损伤、肿瘤、白内障等疾病的有效药物，最近还发现谷胱甘肽可能具有抗艾滋病毒的功效。谷胱甘肽现在已广泛运用于食品加工的各个领域，在日本谷胱甘肽被认为是21世纪最有希望的保健食品之一。谷胱甘肽作为一种重要的氨基酸类生化药物。
6、，随着人们在食品添加剂、临床医学和运动营养学上对它的兴趣日益增长，市场需求量不断增加。0003随着近年来分离技术在生命科学、天然药物提纯及各类抗生素药物等方面应用的迅速发展，各种萃取技术应运而生。对于生物物质来说，分离的对象复杂，既包括可溶物，如蛋白质和核酸，也包括悬浮的小颗粒,如细胞器和整个细胞；由于生物物质极易变性和失活，给分离带来很大的难度。并且，发酵液黏度高，菌液分离困难；发酵液成分复杂，提取纯化成本高。目前适合高黏发酵液除菌的方法有高速离心法、絮凝法和微孔滤膜法等。絮凝法成本过高，且除杂不彻底；由于谷胱甘肽分子大小与菌体较为接近，微孔滤膜法较难有效实现谷胱甘肽与菌体的分离，并膜污染严。
7、重、清洗困难等问题；高速离心较难分离菌液杂蛋白，并且成本高、能耗大，难以应用于工业化生产。发明内容0004针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种操作简单、（常温）条件温和、选择性高、收率高、能耗较小、有机溶剂残留少,能实现快速分离、易于进行连续化操作的萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法。0005为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案一种萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法，其特征在于用双水相溶液萃取从酵母菌液中萃取谷胱甘肽，所述的双水相溶液为PEG/NA2CO3双水相溶液，所述的PEG/NA2CO3双水相溶液的PEG质量浓度为2060，NA2CO3浓度为03MOL/L15MOL/L，萃取温度为2。
8、040，萃取PH值为610。0006本发明进一步设置为所述的PEG/NA2CO3双水相溶液PEG浓度39，NA2CO3浓度为06MOL/L，萃取PH值为9，温度32。0007本发明PEG分子量为600或1000或2000或4000或6000。说明书CN101955509A2/6页40008本发明萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法包括以下步骤1、将冰冻状态下的酵母菌液在常温下解冻，破碎，将酵母菌悬液于4000R/MIN，离心20MIN，沉淀，取上清液；2、将步骤1的上清夜加入至PEG/NA2CO3双水相溶液，并且加入NA2HPO4与NAH2PO4溶液调整萃取PH值；3、将步骤2的溶液充分混合后，静置，。
9、得到上下相谷胱甘肽萃取溶液。0009本发明萃取酵母菌中的谷胱甘肽的方法具有操作简单、（常温）条件温和、选择性高、收率高、能耗较小、有机溶剂残留少,能实现快速分离、易于进行连续化操作等一系列优点。附图说明0010图1为本发明标准曲线的制备线性图；图2为PEG分子量对萃取率的影响曲线图；图3为PEG浓度对萃取率的影响曲线图；图4为NA2CO3浓度对萃取率的影响曲线图；图5为温度对萃取率的影响曲线图；图6为PH对萃取率的影响曲线图；图7为YFX1,X2的响应面曲面图；图8为YFX1,X3的响应面曲面图；图9为YFX2,X3的响应面曲面图。具体实施方式0011萃取率计算方式分配系数KCT/CB相比RV。
10、T/VB萃取率YRK/1RK式中CT为上相浓度，CB为下相浓度，VT为上相体积，VB为下相体积。0012谷胱甘肽浓度的测定标准曲线的制备（采用ALLOXAN试剂法测定GSH）GSH质量称取，分别取1MG，09MG，08MG，07MG，06MG，05MG，04MG，03MG，02MG，01MG，分别加入0ML，01ML，02ML，03ML，04ML，05ML，06ML，07ML，08ML，09ML的水，配制成1103，09103，08103，07103，06103，05103，04103，03103，02103，01103，0103MOL/L的GSH溶液。然后依次加入024MOL/L、PH76的。
11、磷酸缓冲液，01MOL/L的甘氨酸溶液，及ALLOXAN试剂，反映20分钟后测吸光度，此吸光度再减去ALLOXAN试剂的校正值后作GSH标准曲线如图1。0013如图1所示，谷胱甘肽标准溶液浓度在01103MOL/L之间，吸光度测定值与浓度之间呈良好的线性关系，谷胱甘肽浓度的标准曲线方程为Y14884X00016。R209999。从图中可看出线性回归系数为09999，线性显著，所以可以作为吸光度来求谷胱甘肽浓度。0014酵母菌液的制备说明书CN101955509A3/6页5固体培养基成分蛋白胨5G/L、酵母膏5G/L、氯化钠5G/L、葡萄糖5G/L、琼脂5G/L。调整PH为7，配制成1L。再分装。
12、成10瓶，加塞，包扎。在高压蒸汽锅里灭菌。然后在无菌操作台中将酵母菌种接到已配好的培养基中。再将酵母菌种转移到液体培养基中，放入冰箱冷冻保藏。从冰箱中取出酵母菌液常温下解冻，破碎，将酵母菌悬液于4000R/MIN，离心20MIN，沉淀，取上清液。0015双水相萃取工艺采取PEG/NA2CO3系统，分别称取PEG和NA2CO3固体，溶解，充分混合，置于5支试管中，得到总体积为9ML的双水相体系，并依次编号1、2、3、4、5，振动，静置15MIN，分层后，分别量取上下相体积，并记录。取已制备好的酵母菌液1ML，加入双水相系统中，并且加入NA2HPO4与NAH2PO4溶液调整萃取PH值，混合，摇匀，。
13、静置15MIN，分别取上下相于比色皿中，测吸光度，再根据谷胱甘肽的标准工作曲线计算出谷胱甘肽的浓度。0016单因素实验1、PEG分子量对萃取率的影响PEG浓度40、NA2CO3浓度为15MOL/L、温度20、PH90，PEG分子量分别取600、1000、2000、4000、6000进行上述双水相萃取工艺操作。0017如图2所示，PEG2000到PEG6000之间萃取率相差不大，这说明PEG分子量的大小对萃取率的影响不大，五种PEG分子量不同的试验数据中，萃取率先减小后增大最后趋于稳定，但PEG相对分子量越小，成相所需的PEG浓度和NA2CO3浓度越高，成本也就越高。当PEG分子量取6000时，。
14、萃取率最大。00182、PEG浓度对萃取率的影响PEG分子量6000、NA2CO3浓度为15MOL/L、温度20、PH90，PEG浓度分别取20、30、40、50、60进行上述双水相萃取工艺操作。0019如图3所示，随着PEG6000浓度的增加，上相体积也逐渐增大，当PEG浓度取30时，上相体积最大，但下相谷胱甘肽浓度含量过高，造成萃取率不高，而且也不利于回收，给后期处理工作造成负担，在浓度逐渐增加的过程中，萃取率先增大后缓慢下降，当PEG浓度为40时萃取率最高。00203、NA2CO3浓度对萃取率的影响PEG分子量6000、PEG浓度40、温度20、PH90，NA2CO3浓度分别取03MOL。
15、/L、06MOL/L、09MOL/L、12MOL/L、15MOL/L进行上述双水相萃取工艺操作。0021如图4所示，NA2CO3浓度对萃取率的大小有很大的影响。当NA2CO3浓度取0MOL/L09MOL/L时，萃取率先减小后增大并在09MOL/L时取得最大值，当质量继续加大时，相比逐渐减小，萃取率也迅速减小继而缓慢增加趋于平衡，当NA2CO3浓度少于03MOL/L，浓度太低时容易与水和空气反应生成碳酸氢钠。00224、温度对萃取率的影响PEG分子量6000、PEG浓度40，NA2CO3浓度为09MOL/L、PH90，温度分别取20、25、30、35、40进行上述双水相萃取工艺操作。0023如图。
16、5所示，温度的变化对萃取率的大小有很大的影响。萃取率在温度2025说明书CN101955509A4/6页6之间迅速减少，在温度2530又逐渐增加，在温度3035减小继而随着温度的增加而增加，若温度低于20或温度高于40，NA2CO3容易结晶成块且不易溶解，当温度为20时，体系分相比最大有助于相的分离，萃取率最高。00245、PH对萃取率的影响PEG分子量6000、PEG浓度40、NA2CO3浓度为09MOL/L、温度20，PH分别取6、7、8、9、10进行上述双水相萃取工艺操作。0025如图6所示，体系的PH值对谷胱甘肽的分配有很大的影响，这是由于体系的PH值变化能明显的改变两相的电位差。而且。
17、谷胱甘肽分子中含有羧基和氨基，PH会影响其电荷作用而导致对其的分配影响。当PH浓度小于7时，萃取率随着PH的增加而减小，而且下相保持较高的谷胱甘肽浓度，会增加后序工序的处理负担，当PH继续逐渐升高时，萃取率迅速增大后减小然后趋于稳定，且在PH8时达到最大萃取率。0026正交分析试验影响双水相萃取酵母菌中谷胱甘肽的因素主要有PEG分子量，PEG浓度，NA2CO3浓度，PH，浓度等，在单因素试验的基础上，针对这些因素的影响规律，确定提取谷胱甘肽的正交实验的提取水平，如表1，按L934正交法设计试验。每组加入1ML的酵母菌液。以谷胱甘肽萃取率为指标，确立谷胱甘肽萃取的最佳条件。0027极差的大小反映。
18、了各因素对指标影响的程度，从表2中可以看出，因素C的极差最大，为848，因素B最小，为139，可见温度指标影响最大，NA2CO3浓度影响最小。从各因素说明书CN101955509A5/6页7的水平看，因素A以2水平为最好，因素B以1水平为最好，因素C以3水平为最好，因素D以2水平最好，因此最优水平搭配为A2B1C3D2，即PEG浓度40，NA2CO3浓度为06GMOL/L，温度30，PH8，双水相萃取率最高。正交试验结果不符合线性规律，为了更好的选取主要影响因素的条件，使条件优化，所以要进行响应面实验；而又由表3可知在影响谷胱甘肽的提取率的各因素主次关系依次是温度C、PEG浓度A、PHD、NA。
19、2CO3浓度B。综上所述，应排除NA2CO3浓度B，取温度C、PEG浓度A、PHD进行响应面实验。0028响应面试验分析如表格3与表格4，在单因素试验基础上，确定BOXBEHNKEN设计的自变量，以萃取率为响应值，运用SAS数据处理软件进行响应曲面分析RESPONSESURFACEANALYSIS,RSA，对提取条件优化。0029以提取率为响应值,根据实验结果,用SAS统计分析软件进行多元回归分析，所得的主要分析结果见图7，图8，图9。X1表示PEG浓度，X2表示温度，X3表示PH。0030对试验数据进行多项式拟合回归,以提取率Y为因变量，PEG浓度为X1、温度为X2、PH为X3为自变量建立回。
20、归方程如下Y08737000012562X10016575X20023013X30046800X120001525X2X1006142说明书CN101955509A6/6页85X220029650X3X10002175X3X20019400X32根据表5、表6响应面分析可以得出,预测值为最大值。条件是PEG浓度为3890、温度为3182、PH为884,为了更好的验证试验结果及试验方便取整值，在以上优化条件下取PEG浓度39，PH9，温度32进行验证实验，平行三次,取平均值,得到提取率为8706，与模型的预测值基本符合。0031本试验利用响应面分析法优化了主要影响提油率的主要因素PEG浓度、温度。
21、、PH，优化正交试验得到的条件。结果表明PEG/NA2CO3双水相系统萃取酵母菌中谷胱甘肽的最优工艺条件为PEG分子量6000，PEG浓度39，NA2CO3浓度为06MOL/L，PH9，温度32。0032本发明利用PEG/NA2CO3双水相系统萃取酵母菌中的谷胱甘肽。首先选用PEG分子量，PEG浓度，NA2CO3浓度，PH，温度5个因素进行单因素多水平实验，以提取率为评价标准。取PEG浓度，NA2CO3浓度，PH，温度进行正交实验，筛选出最佳萃取条件。然后再利用响应面分析法优化了主要影响因素PEG浓度，PH、温度对双水相萃取酵母菌中谷胱甘肽的条件。结果表明PEG/NA2CO3双水相系统萃取酵母菌中谷胱甘肽的最优工艺条件为PEG6000浓度39，NA2CO3浓度为06MOL/L，PH9，温度32。说明书CN101955509A1/4页9图1图2说明书附图CN101955509A2/4页10图3图4说明书附图CN101955509A3/4页11图5图6说明书附图CN101955509A4/4页12图7图8图9说明书附图。