CN201280076706.5
2012.09.05
CN104781402A
2015.07.15
实审
审中
实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/113申请日:20120905|||公开
C12N15/113; A61K31/713; A61P27/06
C12N15/113
西伦蒂斯私人股份公司
安娜·伊萨贝尔·希门尼斯安东; 维多利亚·冈萨雷斯法哈多; 韦罗妮卡·鲁斯帕洛马尔
西班牙马德里
中科专利商标代理有限责任公司11021
张国梁
本发明涉及降低眼睛的IOP的方法、组合物和剂量,其包括19个核苷酸的双链RNA分子。
1. 治疗以升高的眼内压(IOP)为特征的眼部病症的方法,所述方法包 括向有此需要的患者的眼睛角膜表面局部施用剂量为约0.3mg-约0.9mg 的短干扰核酸分子(siNA),所述短干扰核酸分子包含SEQ ID NO:3的核 苷酸序列。 2. 治疗以升高的眼内压(IOP)为特征的眼部病症的方法,所述方法包 括向有此需要的患者的眼睛角膜表面局部施用组合物,所述组合物包含在 磷酸缓冲盐水(PBS)中的约0.3mg-0.9mg的SYL040012。 3. 权利要求1的方法,其中所述siNA每天施用一次。 4. 权利要求1的方法,其中所述siNA以约30μl-约40μl的体积递 送。 5. 权利要求1的方法,其中所述siNA用点眼药器递送到眼睛。 6. 权利要求1的方法,其中与所述患者在施用所述siNA之前的IOP 相比,所述患者的IOP减少了约25%-约30%。 7. 权利要求1的方法,其中所述siNA提供持久的IOP降低,其在施 用所述siNA后持续大于24小时。 8. 权利要求1的方法,其中IOP的降低存在至少8小时。 9. 权利要求1的方法,其中降低的IOP持续至少2天。 10. 权利要求1的方法,其中所述siNA是短干扰核糖核酸(siRNA)。 11. 权利要求10的方法,其中所述siRNA是双链的(dsRNA)。 12. 权利要求10的方法,其中所述siRNA是短发夹(shRNA)。 13. 权利要求1的方法,其中所述siNA包含至少一种修饰的寡核苷 酸。 14. 权利要求1的方法,其中所述siNA包含至少一个不是磷酸二酯 键的两个核苷酸之间的键。 15. 权利要求1的方法,其中所述眼部病症选自由开角型青光眼、闭 角型青光眼和先天性青光眼组成的组。 16. 权利要求1的方法,其中所述siNA是40个核苷酸以下。 17. 权利要求10的方法,其中所述siNA与其互补物杂交形成dsRNA。 18. 权利要求10的方法,其中所述dsRNA具有二核苷酸3’突出端。 19. 权利要求18的方法,其中二核苷酸突出端由胸苷核苷酸构成。 20. 权利要求1的方法,其中向所述患者施用多于一种类型的siNA。 21. 权利要求20的方法,其中所述多于一种类型的siNA减少或抑制 相同基因的表达。 22. 权利要求1的方法,其中所述siNA分子是未修饰的。 23. 用于分配液体形式的药物剂量的分配器,所述分配器包括用于容 纳所述液体的填装的容器和用于分配预定大小的所述液体的小滴的孔,其 中所述液体包含约0.3mg-约0.9mg的siNA和任选地包含一种或多种药 用稀释剂和任选地包含一种或多种赋形剂,其中所述siNA包含SEQ ID NO.3。 24. 用于分配液体形式的药物剂量的分配器,所述分配器包括用于容 纳所述液体的填装的容器和用于分配预定大小的所述液体的小滴的孔,其 中所述液体包含在含有磷酸缓冲盐水的溶液中浓度为约7.5mg/ml-约22.5 mg/ml的约0,3mg-约0.9mg的SYL040012。 25. 一种试剂盒,所述试剂盒包括: (a)用于分配液体形式的药物剂量的分配器,所述分配器包括用于容 纳所述液体的填装的容器和用于分配预定大小的所述液体的小滴的孔;和 (b)书面的使用说明,其指明向每只眼睛中施用一小滴形式的约0.3 mg-约0.9mg的siNA,所述siNA包含SEQ ID NO:1。 26. 一种试剂盒,所述试剂盒包括: (a)用于分配液体形式的药物剂量的分配器,所述分配器包括用于容 纳所述液体的填装的容器和用于分配预定大小的所述液体的小滴的孔;和 (b)书面的使用说明,其指明向每只眼睛中施用一小滴形式的在PBS 中终浓度为约7.5mg/ml-约22.5mg/ml的约0.3mg-约0.9mg的 SYL040012。 27. 包含SEQ ID NO:3的核苷酸序列的短干扰核酸分子(siNA)在制 备用于治疗以升高的眼内压(IOP)为特征的眼部病症的药物中的应用,其 中所述siRNA以约0.3mg-约0.9mg的剂量局部施用到有此需要的患者的 眼睛角膜表面。
siRNA及其在用于治疗和/或预防眼部病症的方法和组合物中的应用 发明背景 青光眼(Glaucoma)定义为由眼内压(IOP)高于其正常生理界限的持 续升高引起的眼组织破坏的过程1。在开角型青光眼(open angle glaucoma, OAG)中,由于视网膜神经节细胞的损失,升高的IOP引起进行性视神 经病变(progressive optic neuropathy),其最终导致失明2。在闭角型青光 眼(angle-closure glaucoma)中,IOP的突发性高度升高使得眼睛失明。 青光眼是世界上失明的第二大主要原因3,并且在世界范围内流行性日益 增加4。青光眼失明是由视网膜和视神经的变性过程引起的,但是功能上 与房水(AH)分泌和流出之间的平衡的损害有关。AH由睫状体(CB)细胞分 泌,并且流出可以通过下述两个通路中的一种发生:小梁网通路和葡萄膜 巩膜通路5。 当前关于青光眼的治疗不能恢复由青光眼引起的视力丧失,而是集中 在降低IOP上6。已经表明控制IOP保护免于青光眼中对视神经的损害5,7。 目前有五类药物用于实现降低IOP:α-肾上腺素能激动剂,β-肾上腺素能 拮抗剂,胆碱能激动剂,前列腺素类和碳酸酐酶抑制剂。如果使用这些药 物中的任一种没能实现降低IOP的功效,可以向小梁网施加激光治疗以 增加AH流出。最后的治疗资源是手术方法,用于产生新的AH流出通路 8。 目前用于与青光眼有关的IOP升高的治疗具有相对少的眼科副作用, 但是,如果化合物到达血流中可能具有系统性副作用9,10,11。系统更好耐 受的治疗,如前列腺素类,具有许多局部耐受问题12。这一事实连同为保 持适当的IOP水平而需要的滴注频率使得治疗依从性成为患者的挑战13。 不能遵守治疗不仅能够允许疾病进展,而且还可能具有引起IOP突然升 高的重新启动作用,这可能对视神经非常有伤害性。 前列腺素类和β-阻断剂是优选的降低IOP的药剂12,14。前列腺素类非 常好地降低IOP,并且是系统性安全的,但是具有一些相关的眼部副作用 15,即,使虹膜颜色变深,眼睫毛生长(lash growth),眼周色素沉着和充 血。该类药物的较不常见的眼部副作用是眼内炎症,囊样黄斑水肿(cystoid macular edema),和眼角膜疱疹病毒感染的再激活16。由于潜在的早产的 风险,前列腺素类似物在妊娠过程中是禁忌的。 β阻断剂的典型应用通过减少AH产生并且不通过增加其流出而降低 IOP。典型施用的β阻断剂经由结膜上皮、泪通道、鼻黏膜和胃肠道吸收 到系统循环中,诱发系统性的不利作用17-19。在眼中,肾上腺素能受体位 于流经睫状体和小梁网的血管,在此处其主要作用是血管收缩,尽管还描 述了它们参与房水分泌。之前在兔眼中的研究表明在结膜、角膜和睫状突 上皮中的高密度的β-肾上腺素能受体。在角膜内皮、晶状体上皮、脉络膜 和眼外肌中也存在β-肾上腺素能受体。在眼中检测到的大部分β-肾上腺素 能受体属于β2-型20-23。 RNA干扰(RNAi)是基于这样的原理的技术:小的特别设计的化学合 成的双链RNA片段可以调控细胞质中特异性信使RNA(mRNA)的降解, 由此选择性地抑制特定蛋白的合成。这一技术已经成为开发旨在阻断和/ 或减少限定蛋白的异常活性的新化合物的非常有力的工具24,25。可以合理 地设计基于RNA干扰的化合物来阻断任意靶基因的表达,包括不能发现 针对其的传统小分子抑制剂的基因26。RNAi成功应用于治疗的实例包括 抑制人细胞中的HIV-1复制27和敲低阿尔茨海默病动物模型中的tau和载 脂蛋白前体蛋白28。尽管RNAi只是在十几年前发现的,但是,一些化合 物已经进入了临床试验的晚期,即,用于治疗老年性黄斑退化症 (age-related macular degeneration)的RTP801(Quark Pharmaceuticals, Fremont,PA,II期)和用于治疗呼吸道合胞病毒的ALN-RSV01(Alnylam Pharmaceuticals,Cambridge,MA,II期)29,30。由于停止治疗时,必须重 新合成被沉默的蛋白,从而恢复其生物活性,因此,对于慢性病症,RNA 干扰是一种非常吸引人的方法。由此,基于RNA干扰的化合物作用通常 要比常规治疗的作用更持久24,31。 眼睛是相对独立的组织区室;这为基于siRNA的疗法的应用特别提 供了一些优点。向眼部局部递送化合物限制系统性暴露并且减少所需要的 化合物的量。这允许局部沉默某种基因并且降低眼外广泛沉默的可能性。 另外,免疫系统通向眼部的通路是有限的;由此较不可能发生针对所述化 合物的免疫应答32。 继续WO2006/021817中所描述的工作,我们已经开发了一种siRNA: SYL040012,显示为SEQ ID NO:2,其是一种化学合成的、未修饰的、 19bp双链寡核苷酸,在脱氧胸苷的3’具有二核苷酸的突出端,其能够选 择性地抑制β2-肾上腺素能受体的合成,显示其用于治疗患有高眼压、开 角型青光眼和其他相关疾病的患者中的升高的IOP。 所述化合物具有已证明的抑制其靶标在细胞培养物中的表达和降低 血压正常的兔和升高的IOP的兔模型中的IOP的功效。 附图简述 图1:SYL040012在人细胞中的体外功效。(A)人细胞中ADRB2的 时间过程抑制:BxPC3和MDA-MB-231细胞转染100nM SYL040012或 100nM混杂序列siRNA,在转染后的不同时间点提取RNA并且分析 ADRB2的表达。(B)在BxPC3细胞中,响应SYL040012的ADRB2剂量 依赖性抑制:BxPC3细胞转染增加剂量的SYL040012,并且在转染后48 小时分析ADRB2表达。(C)肾上腺素能家族受体响应SYL040012的表达。 在用100nM SYL040012、混杂序列或赋形剂(vehicle)处理的细胞中的 BxPC3和MDA-MB-231。*表示相对于时间点0,p<0.5的统计学显著性 水平。 图2:SYL040012在生物学流体中的稳定性。在兔房水和兔血清中, 通过在时间0时用在PBS中的20μM SYL040012溶液掺加两种生物学流 体的新鲜获得的样品,经由在不同时间点的天然-HPLC来评估 SYL040012的稳定性。结果表示为初始量的百分数。数据表示2次独立 的分析的平均值±S.D.。 图3:在用eGFP-siRNA处理后,睫状体中的eGFP水平减少。eGFP 转基因小鼠用三个160μg/天的剂量进行处理。最后一次给药后48小时, 将动物处死,摘出眼睛并进行处理,以用于荧光显微镜检查。左图显示 PBS处理的动物(A)和eGFP-siRNA处理的动物(B)的睫状体的Nomarski 显微照片。中间图显示PBS处理的动物(C)和eGFP-siRNA处理的动物(D) 的荧光纤维照片。右图显示Nomarski与荧光纤维照片的合并图。NPE: 非色素上皮;PE:色素上皮。 图4:SYL040012在兔中的体内功效。(A)SYL040012的降低IOP作 用:两组NZW兔在连续4天的时间期间内用SYL040012(20nmol/天)或 PBS处理。每次给药后每两小时评估IOP至第8小时,在第5-10天进行 相同的时间表但是不给予化合物。(B)SYL040012作用的特异性:两组 NZW兔用100nM混杂的siRNA或用PBS处理。如上述评估IOP。(C) SYL040012的长期降低IOP的作用:两组兔在两个彼此间隔3天的无药 物时间的四天的时间期间内给药20nmol/天的SYL040012或PBS。如上 文所述从第1-13天评估IOP。显示代表性的实验。 图5:SYL040012在通过眼部水过载诱发的高眼内压兔模型中的功 效。(A)SYL040012针对IOP的剂量反应:动物在四天的时间期间内以下 列剂量中的一种给药SYL040012:10,20,40或60nmol/只眼睛/天或PBS。 最后一次剂量后120分钟,通过眼部水过载诱发高眼压。在最后一次给药 的同时、眼部水过载之前60分钟和眼部水过载前立即、以及在眼部水过 载后间隔25分钟的总共10次测量评估IOP。数据表示为每组两只动物的 平均值±s.e.m。(B)SYL040012针对IOP的特异性:如上文提及的,对动 物给药40nmol/只眼睛/天的SYL040012、混杂的siRNA或PBS。如A中 所提及的那样进行眼部水过载和IOP测量。数据表示为用于SYL040012 的12只动物;用于PBS的11只动物和用于混杂的siRNA的2只动物的 平均值±s.e.m。(C)在用SYL040012处理的动物中的ADRB2水平的减小。 动物如B中所述进行处理,并且在最后一次IOP测量后立即将其处死, 摘下眼睛,并且分离角膜、泪腺和睫状体。提取总RNA,并通过实时PCR 分析ADRB2的表达。数据表示为每组3只动物的平均值±s.e.m。通过用 非配对斯氏t检验比较每只处理的眼睛结构与其PBS处理的副本来计算 统计学显著性,并且如下所述:***p<0.001。 图6:响应SYL040012的剂量A和B的IOP曲线。A.在12只健康 的受试者中响应重复给药的剂量A的SYL040012的IOP发展;B.在受试 者亚组中的IOP发展,其显示响应SYL040012的剂量A IOP降低超过20% (n=5)。C:在12只健康的受试者中响应重复给药的剂量B的SYL040012 的IOP发展。数据表示为A和C中12个受试者和B中5个受试者的平 均值±平均值的标准误差(s.e.m)。通过重复测量双向ANOVA计算统计学 显著性,进行Bonferroni′s校正用于后续的成对比较,并且如下所述: ***p<0.001;**p<0.01和*p<0.05。 图7:本发明的siNA分子。该图显示本发明所包括的siNA分子的寡 核苷酸序列。 发明概述 本发明涉及降低眼睛IOP的方法、组合物和剂量,其包含SYL040012, 其为在3’具有二核苷酸脱氧胸苷突出端的19个核苷酸的双链RNA分子。 本发明的组合物包含在盐溶液(如PBS)和药用赋形剂中的SYL040012, 由此允许其在眼部的滴注,即,作为滴眼液。本发明的剂量包括约30μl- 约40μl的滴眼液(包含约0.6mg-0.9mg的SYL040012)的每日滴注。 本发明涉及降低眼睛IOP的方法、组合物和剂量。本发明的组合物 包含减少肾上腺素能受体β2(ADRB2)基因的表达的短干扰核酸分子 (siNA),如之前所述,其减少前房内房水的产生。本发明的组合物可以用 于制备用于治疗表现出升高的IOP的眼部病症的药物,所述眼部病症如 青光眼、感染、炎症、葡萄膜炎(uveitis)和糖尿病性视网膜炎(diabetic retinopathy)。本发明的方法包括给有此需要的患者以有效的给药方案施 用有效量的一种或多种本发明的siNAs。 本发明的组合物包含减少或抑制肾上腺素能受体β2(ADRB2)(即, 与眼内流体(即,房水)的产生相关的基因)的表达的短干扰核酸分子 (siNA)。本发明包括应用短干扰核酸(siNA)的组合物和方法,所述短干扰 核酸包括,但不限于,短干扰RNA(siRNA),双链RNA(dsRNA),和短 发夹RNA(shRNA)分子,它们能够调节针对靶基因ADRB2的RNA干扰 (RNAi)。在优选的实施方案中,用于本发明的方法中的siNA是dsRNA。 本发明的siNAs可以是未修饰的或化学修饰的。 本发明的方法包括给有此需要的患者施用有效量的本发明的siNA。 在优选的实施方案中,当与由施用商购药物(如适利达(Xalatan),舒净 露(Trusopt)和Timoftol)引起的IOP降低的持续时间相比时,本发明的 方法提供持久的IOP降低。 本发明的方法还包括与一种或多种其他降低IOP的治疗剂组合施用 一种或多种本发明的siNAs,所述其他降低IOP的治疗剂包括,但不限于, 商购的药物。 本发明的方法还包括通过滴注到眼表面而施用本发明的组合物。当将 siRNA直接施用到眼睛时,通常每天施用下述量的siNA:每只眼睛每天 约0.01mg-约100mg,每只眼睛每天约0.04mg-约80mg,每只眼睛每天 约0.04mg-约20mg,每只眼睛每天约0.08mg-约10mg,每只眼睛每天 约0.08mg-约1.2mg,每只眼睛每天约0.3-约0.9mg,或每只眼睛每天约 0.08mg-约0.9mg。 发明详述 本发明涉及降低眼睛IOP的方法、组合物和剂量。本发明的组合物 包含减少肾上腺素能受体β2(ADRB2)基因的表达的短干扰核酸分子 (siNA),如之前所述,其减少前房内房水的产生。本发明的组合物可以用 于制备用于治疗表现出升高的IOP的眼部病症(如青光眼)的药物。本 发明的方法包括给有此需要的患者以有效的给药方案施用有效量的一种 或多种本发明的siNAs。 siNAs的设计 本法明的siNAs设计用来通过降低或抑制ADRB2的表达而调节活 性,由此影响IOP。在一个实施方案中,靶基因表达的减少或抑制减少眼 内流体(例如,房水)的产生。本发明的靶基因ADRB2的GenBank登 记号为NM_000024。 用于本文时,本发明的“siNAs”是指能够通过RNA干扰调节靶标 mRNA裂解的双链寡核苷酸。为避免混淆,优选术语siRNA,假定在分 子结构内包含修饰的非经典碱基,并且偶尔是脱氧核糖核苷酸,包括在双 链分末端的单链胸苷突出端,是本领域的常见实践。 例如,当siNA分子选择性减少或抑制基因的表达时,所述基因被本 发明所述的siNA“靶向”。短语“选择性减少或抑制”用在本文中包括减 少一种基因的表达的siNAs以及减少多于一种基因的表达的那些。在siNA 减少多于一种基因的表达的情形中,被靶向的基因减少至少约两倍,约三 倍,约四倍,约五倍,约十倍,约二十五倍,约五十倍,或约一百倍,与 任意其他基因减少一样多。备选地,当siNA在严格条件下与基因转录物 杂交时,所述siNA靶向该基因。siNAs可以在体外或体内检测其靶向基 因的能力。 选择靶基因mRNA序列的短片段(例如,长度为19-40个核苷酸)用于 本发明的siNA的序列。在一个实施方案中,所述siNA是siRNA。在优 选的实施方案中,从靶基因mRNA选择序列片段作为候选siRNA分子的 标准包括:1)来自靶基因mRNA的序列,所述序列来自天然mRNA分 子的5’或3’端的至少50-100个核苷酸,2)来自靶基因mRNA的序列, 所述序列具有30%-70%的G/C含量,更优选约为50%,3)来自靶基因 mRNA的序列,所述序列不含有重复序列(例如,AAA,CCC,GGG, UUU,AAAA,CCCC,GGGG,UUUU),4)来自靶基因mRNA的序列, 所述序列在所述mRNA中是可及的,和5)来自靶基因mRNA的序列, 所述序列对该靶基因是独特的。来自靶基因mRNA的序列片段可以满足 上文所述的一个或多个标准。在靶基因mRNA的片段满足不到全部如前 所述的标准的情形中,天然序列可以改变,以使siRNA与靶基因mRNA 相比,符合更多的标准。在优选的实施方案中,所述siRNA具有低于60% 的G/C含量和/或缺少重复序列。 在一个具体的实施方案中,siNA与靶标区域互补的部分与所述靶标 区域完全互补。在另一个具体的实施方案中,siNA与靶标区域互补的部 分与所述靶标区域不完全互补。相对于靶序列具有插入、缺失和点突变的 siNA也包括在本发明中。因此,可以通过本领域已知的序列比较和比对 算法来计算序列同一性(参见Gribskov和Devereux,Sequence Analysis Primer,Stockton Press 1991,以及其中引用的参考文献),并且,计算核 苷酸序列之间的差异性百分比,例如,通过在BESTFIT软件程序中使用 默认的参数运行的Smith-Waterman算法来计算(例如,威斯康辛大学遗 传计算组(University of Wisconsin Genetic Computing Group))。优选siNA 与靶基因的部分之间大于90%、95%或99%的序列同一性。备选地,siNA 与天然RNA分子之间的互补性可以通过杂交来功能性限定。本发明的 siNA序列能够在严格条件下(例如,400mM NaCl,40mM PIPES pH 6.4, 1mM EDTA,50℃或70℃,杂交12-16小时;然后洗涤)杂交靶基因转 录物的部分。本发明的siNA序列还可以通过其减少或抑制靶基因的表达 的能力来功能性限定。siNA影响基因表达的能力可以在体内或体外凭经 验确定。 除了特异性靶向唯一一种基因的siNAs,简并siNA序列也可以用于 靶向多种基因的同源区域。WO2005/045037描述了靶向所述同源序列的 siNA分子的设计,例如,通过结合非经典碱基对,例如,错配和/或摇摆 碱基对,这可以提供另外的靶序列。在鉴定错配的情形中,可以利用非经 典碱基对(例如,错配和/或摇摆碱基)来产生靶向多于一种基因序列的 siNA分子。在非限制性的实例中,非经典碱基对,如UU和CC碱基对 可以用来产生能够靶向享有序列同源性的不同靶标的序列的siNA分子。 由此,使用本发明的siNAs的一个优点是可以设计单一的siNA来包括与 在同源基因中保守的核苷酸序列互补的核酸序列。以这种方法,可以使用 单一siNA而不是使用靶于不同基因的多于一种的siNA分子来抑制多于 一种基因的表达。 本发明的优选的siNA分子是双链的。在一个实施方案中,双链siNA 分子包含平端。在另一个实施方案中,双链siNA分子包含突出的核苷酸 (例如,1-5个核苷酸的突出端,优选2个核苷酸的突出端)。在一个具体 的实施方案中,所述突出的核苷酸是3’突出端。在另一个具体的实施方 案中,所述突出的核苷酸是5’突出端。任意类型的核苷酸可以是所述突 出端的一部分。在一个实施方案中,所述突出的一个或多个核苷酸是核糖 核酸。在另一个实施方案中,所述突出的一个或多个核苷酸是脱氧核糖核 酸。在优选的实施方案中,所述突出的一个或多个核苷酸是胸苷核苷酸。 在另一个实施方案中,所述突出的一个或多个核苷酸被修饰或是非经典核 苷酸。所述突出的一个或多个核苷酸可以具有非经典核苷酸间键(例如, 除磷酸二酯键之外的键)。 在优选的实施方案中,设计本发明的siNA组合物靶向SEQ ID NO:1。 其他实施方案涉及SEQ ID NO 1,2,3,4,5和6所示的siNAs。在另一 个实施方案中,本发明的优选的siNA是SEQ ID NO:2(SYL040012)。该 优选的siNA SYL040012是19个核苷酸长的未修饰的双链RNA分子,在 3’端具有包含脱氧胸苷碱基的二核苷酸突出端,如图7所示。 siNAs的合成 由上述方法设计的siNAs可以通过本领域已知的任意方法来合成。 RNAs优选用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规的DNA/RNA合成仪来 化学合成。另外,siRNAs可以从商业RNA寡聚物合成供应商获得,所 述供应商包括,但不限于,Proligo(Hamburg,德国),Dharmacon Research (Lafayette,CO,USA),Glen Research(Sterling,VA,USA),ChemGenes (Ashland,MA,USA),和Cruachem(Glasgow,UK),Qiagen(德国),Ambion (USA)和Invitrogen(苏格兰)。备选地,本发明的siNA分子可以通过用包 含在启动子控制下的反向互补siNA序列的载体转染细胞而在细胞中进行 表达。一旦表达,可以利用本领域公知的技术将所述siNA从所述细胞中 分离出来。 在siRNA是双链RNA(dsRNA)的情形中,如果获得单链RNA分子, 则退火步骤是必要的。简言之,组合30ml在100mM乙酸钾,30mM HEPES-KOH pH 7.4,2mM乙酸镁中的每种RNA寡聚物的50mM溶液。 然后,将所述溶液在90℃温育1分钟,离心15秒,并且在37℃温育1 小时。 在其中siRNA是短发夹RNA(shRNA)的实施方案中;所述siRNA分 子的两条链可以通过接头区(例如,核苷酸接头或非核苷酸接头)连接。 5.3 siNAs的化学修饰 本发明的siNAs可以包含一个或多个修饰的核苷酸和/或非磷酸二酯 键。本领域公知的化学修饰能够增加所述siNA的稳定性、可获得性和/ 或细胞摄入。技术人员明白可以结合在RNA分子中的其他类型的化学修 饰(关于修饰的类型的总结参见国际公布W0031070744 W02005/045037 或WO2008/104978)。 在一个实施方案中,修饰可以用来提供提高的降解抗性或提高的摄 入。所述修饰的实例包括硫代磷酸酯核苷酸间键,2′-O-甲基核糖核苷酸 (特别是在双链siRNA的有义链上),2′-脱氧-氟代核糖核苷酸,2′-脱氧核 糖核苷酸,“通用碱基”核苷酸,5-C-甲基核苷酸,和倒置的脱氧碱基残基 结合(通常参见GB2406568)。 在另一个实施方案中,修饰可以用来增强siRNA的稳定性或增加靶 向效率。修饰包括siRNA的两个互补链之间的化学交联,siRNA的一条 链的3′或5′末端的化学修饰,糖修饰,核碱基修饰和/或骨架修饰,2′-氟 代修饰的核糖核苷酸和2′-脱氧核糖核苷酸(通常参见国际公布 W02004/029212)。 在另一个实施方案中,修饰可以用来增加或减少针对靶mRNA中和/ 或互补siNA链中的互补核苷酸的亲和力(通常参见国际公布 W02005/044976)。例如,未修饰的嘧啶核苷酸可以置换为2-硫代,5-炔 基,5-甲基或5-丙炔基嘧啶。另外,未修饰的嘌呤可以置换为7-脱氮,7- 烷基或7-烯基嘌呤。 在另一个实施方案中,当所述siNA是双链siRNA时,3′-端核苷酸突 出端核苷酸替换为脱氧核糖核苷酸,例如,参见Elbashir等33。 治疗应用的证明 本发明的组合物和方法优选地在用于人之前在体外检测,然后在体内 检测需要的治疗活性。例如,可以用来确定是否显示特定的治疗方案的实 施的体外测定,包括体外细胞培养测定,其中在体外向细胞(例如,兔非 色素睫状上皮细胞(NPE),人睫状上皮细胞(OMDC),或人胚肾细胞 (HEK293))施用候选siNA,并且观察所述方案对所述细胞的作用,例如, 减少或抑制靶基因的表达。 在人中检测之前,可以在适当的动物模型系统中检测用于治疗的化合 物,所述动物模型系统包括但不限于,兔、大鼠、小鼠、鸡、母牛、猴子、 仓鼠等。例如,新西兰兔是设计用于研究IOP的优选的实验平台标准。 其易于处理,并且其具有大小与人器官类似的大眼睛。另外,现有的测量 IOP的仪器不适合用于具有小眼睛的动物,如小鼠或大鼠。最后,兔具有 这样的IOP,使用局部商购降血压药物,可以使所述IOP减少至其正常(或 用药前)值的40%。因此,尽管可以产生兔青光眼模型(例如,手术封 闭episclerotic静脉或人工闭合小梁网),通常本领域技术人员优选眼结构 保持完好的模型。 治疗方法 本发明包括用于治疗、预防或管理患者(例如,哺乳动物,特别是人) 中与升高的IOP相关的眼部病症的方法,所述方法包括施用有效量的一 种或多种本发明的siNAs。在一个具体的实施方案中,要治疗、预防或管 理的病症是青光眼。利用本发明的方法可以治疗任意类型的与IOP相关 的青光眼,包括但不限于,开角型青光眼(例如,原发性开角型青光眼 (Primary Open Angle Glaucoma),色素性青光眼(Pigmentary Glaucoma), 和脱落型青光眼(Exfoliative Glaucoma),低眼压性青光眼(Low Tension Glaucoma)),闭角型青光眼(Angle Closure Glaucoma)(临床上还称为角 度闭合型青光眼(closed angle glaucoma),狭角性青光眼(narrow angle glaucoma),瞳孔阻滞性青光眼(pupillary block glaucoma),和睫状环阻 塞性青光眼(ciliary block glaucoma))(例如,急性闭角型青光限(Acute Angle Closure Glaucoma)和慢性闭角型青光眼(Chronic Angle Closure Glaucoma)),Aniridic青光眼(Aniridic Glaucoma),先天性青光眼 (Congenital Glaucoma),青少年型青光眼(Juvenile Glaucoma),透镜诱 发的青光眼(Lens-Induced Glaucoma),新生血管性青光眼(Neovascular Glaucoma),外伤后青光眼(Post-Traumatic Glaucoma),类固醇诱导性青 光眼(Steroid-Induced Glaucoma),斯特奇-韦伯综合征青光眼 (Sturge-Weber Syndrome Glaucoma),和葡萄膜炎诱导性青光眼 (Uveitis-Induced Glaucoma)。 预测使用针对特定的靶基因的siRNAs的治疗性治疗要比小分子局部 眼用滴眼液有益,其增加所观察到的作用的时间长度,由此允许较不频繁 地给药和更大的患者依从性。 在优选的实施方案中,用于本发明的治疗方法的siNAs减少或抑制引 起IOP的基因的表达,所述基因如肾上腺素能受体β2。在本发明的进一 步优选的实施方案中,用于本发明的治疗方法中的siNAs靶向SEQ ID NO: 1。在特别优选的实施方案中,所述siNA长为21-30个核苷酸,并且包含 SEQ ID NO:3。特别优选的是SYL040012,其具有SEQ ID NO:2,没有 修饰,即,不含非经典碱基,并且在两个3’端包含TT突出端。 在优选的实施方案中,本发明的方法提供持久的IOP降低,在最后 一次siNA施用后持续长于8,10,12或14小时,更优选地持续数天(例 如,2天,3天,4天或5天)。在所述实施方案中,与典型地由施用目前 商购的药物(例如,适利达,舒净露和Timoftol)引起的IOP降低的持续 时间相比,施用的本发明的siNAs的作用(即,降低的IOP)持续更久。 本发明的提供持久的IOP降低作用的siNAs可以持续降低IOP而无需每 日施用siNA的方案进行施用。在具体的实施方案中,治疗方案可以包括 连续周期的施用(例如,每天给予一剂量的siNA,持续四天)和不施用 (例如,不给予治疗3或4天),而仍然激发IOP的持续降低。 在一个实施方案中,在本发明的治疗方法中施用单一类型的siNA。 在另一个实施方案中,本发明的siNA与本发明的另一种siNA和/或可用 于治疗、预防或管理与升高的IOP相关的眼部病症的一种或多种其他非 -siNA治疗剂组合施用。术语“与……组合”不限于准确地同时施用治疗 剂,相反,其意指本发明的siNAs和其他试剂以某种顺序和在一定时间间 隔内施用给患者,以使组合的益处大于如果它们以另外的方式施用时的益 处。例如,每种治疗剂可以同时或以任意顺序在不同的时间点先后施用; 然而,如果不是同时施用,它们应该在时间上充分接近地施用,以提供需 要的治疗作用。每种治疗剂可以以任意适当的形式和通过适当的途径分开 施用。 剂量 用于本文时,“有效量”是指本发明的siNA充分治疗或管理与升高 的IOP相关的眼部病症的量,并且,优选地是指足以降低IOP的量。对 于人中升高的IOP的治疗,优选地降低IOP,以使IOP为约14-20mm Hg。 然而,与治疗前IOP相比的任意IOP降低都是有益的,而不管本发明的 化合物是单独递送的,还是与另一只适当的治疗剂组合递送的(例如,本 发明包括大于约5%,约10%,约25%,约30%,约35%,约40%,约 50%或约60%的治疗前IOP的IOP降低)。在一些实施方案中,本发明的 化合物可以引起这样的IOP降低:其为治疗前IOP的约1%-约99%,约 5%-约90%,约10%-约80%,约20%-约50%,或约25%-约45%。优选 地,IOP的降低为约25%-约30%。治疗有效量还可以是指足以延迟与IOP 相关的眼部病症的发作或使该发作减至最低的siNA的量。治疗有效量还 可以是指在与升高的IOP相关的眼部病症的治疗或管理中提供治疗益处 的治疗剂的量。此外,与本发明的siNA相关的治疗有效量意指在与升高 的IOP相关的眼部病症的治疗或管理中提供治疗益处的单独的治疗剂或 与其他治疗组合的治疗剂的量。与本发明的siRNA的量联系使用,该术 语可以包括改善整体疗法、减少或避免不需要的作用或增强另一种治疗剂 的治疗功效或与另一种治疗剂协同作用的量。使用单独的或组合的siNA 的治疗应该引起约14-20mm Hg的IOP。然而,与治疗前IOP相比的任 意IOP降低都是有利的(例如,与治疗前的IOP相比大于5%,10%,25%, 30%,35%,40%,50%或60%的IOP降低)。 与升高的IOP相关的眼部病症的治疗或管理中的治疗益处是由所述 治疗诱导的IOP的持续降低。所述降低越持久,当该用下一剂量时发生 IOP的突然急剧升高的可能性越小。这被认为是治疗功效的显著提高。在 一些实施方案中,使用单独的或组合的siNA的治疗可以导致持续约2天 -约7天、约2-约6天和约2天-约4天的IOP降低。在一些优选的实施方 案中,所述降低持续约2天-约3天,优选在3天期间内。 由此,在一些实施方案中,在患者对治疗时间表的依从性较差的情 形中,本发明的化合物的施用导致预防、保护免受或减少当该用下一次剂 量时由IOP的重新启动作用引起的视神经的损害。 本发明的组合物的有效量和治疗方案可以通过标准的研究技术来确 定。例如,在病症的治疗、预防或管理中有效的所述组合物的剂量可以通 过将所述组合物施用给动物模型而确定,所述动物模型诸如例如,本文公 开的动物模型,例如,新西兰白兔模型,或本领域技术人员已知的动物模 型。另外,可以任选地应用体外测定来帮助鉴定最佳剂量范围。备选地, 可以通过逐渐增加剂量直至达到有效的水平而确定用于个体的所述剂量。 用于剂量中的优选的有限量的选择可以由技术人员基于本领域普通 技术人员已知的一些因素的考虑而确定(例如,通过临床试验)。此类因 素包括待治疗或预防的病症、涉及的症状、患者的体重、患者的免疫状况 和本领域技术人已知的反映所施用的药物组合物的准确性的其他因素。 用于制剂的精确剂量还取决于施用途径和所述病症的严重性,并且 应该按照执业医师的判断和每名患者的情况来决定。 当将siRNA直接施用到眼睛时,通常每天施用约0.01mg-约100mg/ 只眼睛/天,约0.04mg-约80mg/只眼睛/天,约0.04mg-约20mg/只眼睛 /天,约0.08mg-约10mg/只眼睛/天,约0.08mg-约1.2mg/只眼睛/天,约 0.3-约0.9mg/只眼睛/天,或约0.08mg-约0.9mg/只眼睛/天的siNA。在 优选的实施方案中,本发明的siRNA以约0.08mg-约0.9mg/只眼睛/天, 约0.3mg-约0.9mg,约0.3mg-约0.6,并且最优选地约0.6mg-约0.9mg/ 只眼睛/天的量施用。在优选的实施方案中,本发明的siRNA配制在盐水 溶液,如PBS中。在特别优选的实施方案中,本发明的siRNA是 SYL040012,并且以上文定义的剂量施用。在一些优选的实施方案中,这 些剂量可以每天施用一次,每天施用两次,每天施用三次或每天施用四次, 并且对每只眼睛的施用每天发生、隔天发生、一周一次、一周两次、一周 三次、隔周发生或一月一次。在一些实施方案中,上述剂量可以每天同时 或每天在不同时间施用。鉴于以升高的IOP为特征的病状(如青光眼) 本质上是长期的,在本发明的优选的实施方案中,本发明的siNAs的施用 也是长期的。在本发明的备选实施方案中,当患者IOP的升高是暂时的 时,本发明的组合物应该在病状持续时进行施用。 配制和施用途径 本发明的siNAs可以通过本领域已知的任意常规技术(例如,参见 Alfonso,G.等,1995,在:The Science and Practice of Pharmacy(制药科 学与实践),Mack Publishing,Easton PA,第19版中)配制成药物组合物。 包含一种或多种用于本发明的方法中的siNAs的制剂可以是多种形式的, 并且可以取决于每名患者特有的各种因素(例如,病症的类型和严重性, 施用的siNA的类型、患者的年龄、体重、反应和既往病史),制剂中的 siNAs的数目和类型,组合物的形式(例如,液体、半液体或固体形式), 治疗方案(例如,所述治疗剂是否在一段时间内每天施用一次、一天施用 数次或每数天施用一次,和/或施用途径)。 在优选的实施方案中,本发明的组合物以滴眼液的形式施用,直接 递送到眼睛。所述滴眼液可以以约10μl-约100μl/滴,更优选约20μl- 约50μl/滴,并且最优选约30μl-约33μl/滴的体积递送。在另外优选的实 施方案中,滴眼液以约40μl的体积递送。在优选的实施法案中,本发明 的组合物包含在可接受的溶液如PBS中的SYL040012。在一些优选的实 施方案中,SYL040012以浓度为约7.5mg/ml-约22.5mg/ml、优选约15 mg/ml-22.5mg/ml的浓度的滴眼液每天施用一次。 这些组合物可以采用水溶液和非水溶液、混悬液、乳剂、微乳剂、 水性和非水性凝胶、膏剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等的形式。 本发明的siNAs还可以包封在递送剂(包括,但不限于,脂质体、微球体、 微粒、纳米球、纳米颗粒、可生物降解的聚合物、水凝胶、环糊精聚(乳 酸-共-乙醇酸)(PLGA))中或者与聚乙烯亚胺及其衍生物(如聚乙烯亚胺 -聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二醇-三 -N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物)复合。本发明优选的组合物 是水溶液,特别优选的是盐水溶液,如PBS,pH范围为约7.0-约7.4,优 选地pH为7.2±0.5。 药物载体、媒介物、赋形剂或稀释剂可以包括在本发明的组合物中, 其包括,但不限于,水,盐水溶液,优选缓冲的盐水溶液,油(例如,石 油、动物油、植物油或合成的油),淀粉,葡萄糖,乳糖,蔗糖,明胶, 麦芽,大米,面粉,白垩,硅胶,硬脂酸钠,甘油单硬脂酸酯,滑石,氯 化钠,脱脂奶粉,甘油,丙烯,乙二醇,乙醇,生物聚合物(例如,卡波 普(carbopol),透明质酸,聚丙烯酸等),葡萄糖(dextrose),渗透增强 剂(例如,脂肪酸,脂肪酸酯,脂肪醇和氨基酸),以及亲水聚合物(例 如,聚卡波非和聚维酮)等。所述组合物,如果需要的话,还可以包含较 少量的润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。 适当的亲脂性溶剂或媒介物包括脂肪酸,如芝麻油,或合成的脂肪 酸酯,如油酸乙酯或三甘油酯,或脂质体。任选地,所述混悬液还可以包 含适当的稳定剂或增加所述混合物的溶解性以允许制备高度浓缩的溶液 的试剂。 在优选的实施方案中,本发明的组合物配制在溶液中,优选在缓冲 的盐水溶液,如PBS中,或配制在用于局部施用至眼睛的凝胶中,诸如 例如,以滴眼液的形式。在所述实施方案中,所述制剂可以是阳离子乳液 和/或包含生物聚合物,其包括,但不限于,聚(丙交酯-共-乙交酯),卡 波普,透明质酸和聚丙烯酸。 在特别优选的实施方案中,本发明的组合物配制在溶液中,如磷酸 缓冲的盐水(PBS)中,其可以任选地还包含一种或多种药用稀释剂和或赋 形剂,如苯扎氯铵,其将允许以滴眼液的形式在角膜表面上眼部滴注,所 述滴眼液优选约30-约33μl。在所述优选的实施方案中,所施用的剂量为 约0.6mg-约0.9mg/只眼睛/天,优选每天施用一次。 本发明的siNAs还可以与其他降低IOP的治疗化合物(例如,商购 的药物)组合配制。 试剂盒 本发明的siNA化合物还可以提供在试剂盒中,所述试剂盒包括分配 器,所述分配器具有用于分配以预定体积的小滴形式的siNA化合物的特 定剂量的孔。在优选的实施方案中,本发明的siNA化合物是靶向SEQ ID NO:1的siNAs。在更优选的实施方案中,本发明的试剂盒内的分配器提 供包含SYL040012的组合物。在另一个实施方案中,所述试剂盒可以包 含一次性使用的分配器的集合,例如,用于一个月内的应用,在这种具体 的情形中,该情形将包含30个一次性使用的分配器。小滴的体积可以在 约50μl-约100μl的范围内。所述分配器可以是一次性使用的分配器,并 且包含约1mg-约2mg的本发明的siNA化合物没并且任选地还包含一种 或多种药用稀释剂,和任选地一种或多种赋形剂。分配器中所包含的组合 物可以包含浓度为约15mg/ml-约22.5mg/ml的本发明的siNA化合物。 备选地,所述分配器可以设计用于一个月以上,并且所包含的体积相应地 增大,以提供等价数量的剂量。本发明的试剂盒还可以包含使用说明,指 明一小滴中约0.6mg-约0.9mg的siNA化合物的剂量施用到每只眼睛中。 使用说明可以进一步指明小滴每天一次、每天两次、每天三次或每天四次 施用至每只眼睛,并且对每只眼睛的施用每日发生,每隔一天发生,一周 一次,一周两次,一周三次,每隔一周,或一月一次发生。 所有公开的论文、书籍、参考手册和其中引用的摘要的内容通过引 用完全结合在本文中,以更充分地描述本发明所述技术领域的状况。 由于可以在上述主题中进行多种变化而不背离本发明的范围和精 神,因此,意欲将包含在上文的描述中的所有主题或在附上的权利要求中 定义的所有主题解释为本发明的描述和举例说明。按照上述教导,本发明 的改进和修改是可行的。 实施例 实施例1:SYL040012的体外分析 细胞培养和转染 BxPC3和MDA-MB-231细胞获自美国培养物保藏协会(Rockville, MD,USA),并且在37℃在5%CO2/95%空气的气氛下在湿润的温箱中 维持在培养基(补充有10%FBS的RPMI-1640培养基(BxPC3细胞)和补 充有10%FBS的DMEM(MDA-MB-231细胞))中。对于转染,对于BxPC3 细胞系以106.000个细胞/cm2的密度、对于MDA-MB-231细胞系以 200.000个细胞/cm2的密度接种细胞。当细胞培养物达到约90%汇合时, 细胞用Lipofectamine 2000(Invitrogen,Pasley,UK)转染100nM SYL040012。转染后24小时,通过定量在对照培养物中的细胞内存在的 Block-it-Alexa fluor红色荧光寡核苷酸(Invitrogen,Pasley,UK)的量估测 转染效率。 RNA分离和q实时-PCR 使用RNeasy RNA提取试剂盒(Invitrogen,CA,USA)从细胞培养物 或组织中分离总RNA。将4μg总RNA用高容量cDNA Archive试剂盒 (Applied Biosystems,Inc.,Foster City,CA,USA)按照供应商的使用说 明进行反转录。 实时PCR使用Stepone plus检测系统(Applied Biosystems)进行。将 500纳克的每种样品在TaqMan 2X通用主混合物中在下述条件下进行扩 增:95℃10min,然后是40个循环:95℃15s,60℃1min。所有的实 时qRT-PCR扩增一式三份进行并且在五次独立的实验中重复,总是包括 反转录对照和无模板对照。 在转染100nM SYL040012后的不同时间点(24,48和72小时),按 照上述流程通过qRT-PCR分析ADRB2mRNA水平。将ADRB2基因的 定量数据针对兔细胞和组织中的HPRT1表达和针对人细胞中的GAPDH 表达标准化,其作为阳性扩增对照。 细胞存活性测定 细胞存活性通过MTT法测定,并且在MDA-MB-231和BxPC3中转 染后不同的时间点(24,48和72小时),用细胞滴定96水性非放射性细胞 增殖测定试剂盒(Promega,Mannheim,德国)按照供应商的使用说明进行 测定。 体外分析SYL040012的功效、特异性和安全性 在用100nM SYL040012或混杂siRNA转染BxPC3或MDA-MB-231 的细胞培养物后的不同时间点(24,48和72小时),通过qPCR分析ADRB2 mRNA水平。观察到在ADRB2的基底mRNA水平的50-70%变化的减少, 这取决于时间点(图1A)。在两种细胞系中,在转染后24小时观察到 SYL040012的最大作用,在该时间点,ADRB2mRNA的减少大约为基底 水平的50%。在BxPC3细胞中,在转染后约72小时,基底ADRB2水平 恢复,而在MDA-MB-231细胞中,在该时间点的mRNA水平保持低于基 线。混杂RNA序列的转染不调节ADRB2水平,这证明SYL040012的作 用是特异性的。 为了评估ADRB2水平的减少是否对细胞存活性有影响,在上文提及 的相同时间点进行MTT测定。SYL040012随时间没有对细胞存活性引起 显著性的影响(表1)。该结果表明ADRB2mRNA响应SYL040012的减 少不引起细胞毒性。 表1:在用100nM SYL040012,100nM混杂序列或PBS处理后, MDA-MB-231和BxPC3细胞中的细胞存活性。在用100nM SYL040012、 相同剂量的混杂序列siRNA或媒介物处理后24、42和72小时,用MTT 测定分析细胞存活性。数据表示为平均值±三次独立的实验的s.e.m。 基于RNAi的化合物依赖于内源性RNAi机制的活性。RNAi的一个 缺点是,当加入大量的外源RNA分子时,该内源性系统可以被饱和22。 以评估不同剂量的SYL040012的作用的目的,用增加剂量的SYL040012 (0.001-100nM)转染BxPC3细胞。在转染后24小时分离总RNA,并且通 过实时PCR确定ADRB2mRNA水平(图1B)。以0.5nM的剂量观察到 ADRB2水平的统计学显著性减少。响应10nM剂量观察到最大作用。在 10和100nM的浓度之间没有观察到显著性差异。使用这些数据,抑制性 浓度50(IC50)计算为9.2nM。 在临床设置中,化合物对其靶标的特异性对于副作用的减少是至关重 要的。我们分析了SYL040012对肾上腺素能家族受体的作用,以分析其 对结构上与ADRB2相关的蛋白的mRNA的作用。在用SYL040012处理 后,评估BxPC3细胞中的肾上腺素能受体ADRB2、ADRB1和ADRA1B 的mRNA水平。图1C显示SYL040012能够选择性减少ADRB2的mRNA 水平,而不显著影响ADRB1或ADRA1B的mRNA水平。 实施例2:稳定性研究 方法 通过两种方法评估SYL040012在兔血清和兔房水中的稳定性:天然 HPLC法,其通过分离双链RNA与未杂交的单链而测量双链体RNA的 量,和变性IEX-HPLC法,其评价双链体中两个单链的纯度并且检测潜 在的降解化合物,以评价单链的稳定性。按照欧洲和美国药典的现行版本 进行另外的检测,如外观、pH和UV测量。 SYL040012的稳定性 RNA化合物非常容易被RNA酶降解,出于这种原因,在其媒介物 (PBS)中、在兔血清和在兔房水中评估该化合物的稳定性。 在兔血清和兔房水中在37℃温育多至24小时时,SYL040012药物 产品的稳定性研究的结果显示在图2中。这些结果证明,SYL040012在 兔房水中的半衰期高于24小时,而在兔血清中的半衰期低于30分钟。 实施例3:siRNA在GFP小鼠眼中的生物分布 方法 约8周龄的C57BL/6-Tg(ACTbEGFP)成年雄兔用于本研究。小鼠分 组笼养并且保持在12h光/暗周期的控温房间内,并且自由获取食物和水。 将6-8周龄的eGFP转基因小鼠的眼睛在连续三天的时期内用剂量为 11.2nmol/天的eGFP-siRNA处理。该模型已经在参考文献中进行了透彻 的描述34,并且大量表达eGFP蛋白,该蛋白容易通过荧光检测。所用的 RNAi靶序列如下所述:EGFP 5’-GGCTACGTCCAGGAGCGCACC-3’。 最后一次施用后48小时,将动物处死,并且采集两只眼睛,处理进行荧 光显微镜检。 在绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠中的siRNA生物分布 在任意干扰研究中的重要的第一步是优化体内siRNA递送的条件。 检测目标群体中表型改变或功能丢失的能力取决于siRNA递送至靶标组 织的效率。 为了研究siRNAs是否可以通过角膜并且进入眼前房,在eGFP转基 因小鼠中测定绿色荧光蛋白特异性的siRNA。当与未处理的小鼠比较时, 施用针对eGFP特异性设计的siRNA减少睫状突和小梁网中的荧光(图3)。 该结果表明,一方面,siRNA可以到达眼前房,另一方面,一旦到达那 里,其被睫状突的细胞摄入,并且能够减少靶基因的表达。 实施例4:体内功效 动物 所有的实验使用约10周龄的成年雄新西兰白兔(NZW)(Granja San Bernardo,Spain and Charles River Laboratories)。在具有12小时光/暗周期 的控温房间中,动物分别笼养在标准的笼子中,自由获取食物和水。在开 始前一周内和在每次研究结束时,动物进行基本的眼科检查。观察下述参 数:眼睑刺激/炎症,泪液产生,瞳孔大小,角膜外观和结膜刺激/炎症。 所有的动物按照动物在眼科和视觉研究中的应用的ARVO声明 (ARVO statement for use of Animals in Ophthalmic and Vision Research)进 行处理。 IOP测量 为避免动物的不适,在向角膜局部施用anestésico(0.4%丁 卡因+0.4%丁氧普鲁卡因,Alcon)后,使用压平眼压计TONO-PEN AVIATM测量IOP。每次测量一式三份进行,并且显示平均结果。 口服水负载高压模型 在开始每次研究前四天,记录五次IOP测量,测量之间间隔2小时。 然后将动物按照IOP值分成实验组,使动物随机化。在4天的期间内, 将化合物每天一次滴注到眼睛上/内,体积记录为每只眼睛40μL,包含在 PBS中的20nmol siNA。PBS用作阴性对照。在施用的前三天中,在检测 项目或媒介物施用之前记录基底IOP测量。在施用后以2小时的时间间 隔测量IOP 4次。 在研究的第四天,在施用前和施用后1和2小时记录基底IOP测量。 在该时间点,通过在过夜禁食的动物中口服水负载(60mL/kg)的方式诱导 高压。然后,总共测量IOP 10次,测量之间间隔25分钟。在最后一次测 量后,将动物用过剂量的戊巴比妥麻醉,并且采集主要的眼结构,并且保 存在RNA中直至后续处理。 SYL040012的体内功效 作为证明SYL040012的体内功效的第一步,用三种目前用于青光眼 的一线治疗的产品处理新西兰白兔:舒净露(Trusopt)(多佐胺 (dorzolamide)),适利达(Xalatan)(拉坦前列素(latanoprost))和Timoftol (噻吗洛尔(timolol))。在连续四天的期间内,将一滴(40μL)每种化合物 滴注到三个分离组的兔子的眼睛中。在最后一次施用后一小时开始,每小 时获得IOP测量,持续8小时,所有化合物引起20-35%的IOP减少,这 取决于化合物,并且这种作用持续要6小时(数据未显示)。这些实验证 实了该动物模型由于其相应IOP调节剂的能力的适用性。 为了评估SYL040012对IOP的作用,在连续4天的时期内,对新西 兰白兔以每天一滴40μl的滴眼液的形式滴注0.3mg/天的SYL040012或 PBS。图4A显示当与滴注媒介物的对照组比较时,存在21.81%±1.55% 的IOP减少。SYL040012对IOP的作用在处理两天后可检测到,并且值 保持低于基线水平,直到最后一次施用后两天。通过进行施用混杂序列而 不是所述化合物的相同的实验,评估该作用的特异性。图4B所示的结果 表明混杂的siRNA对IOP没有作用,由此,SYL040012的作用是特异性 的。 SYL040012的评价时间作用计算为恢复的半最大时间点与获得对 IOP的半最大作用的时间之间的差异。这些计算的结果显示在表3中,并 且示例SYL040012的平均时间作用(91.6h)相对于XalatanTM(5.36h)和 TrusoptTM(4.75h)的差异。 为了分析SYL040012随时间的作用,一组兔接受两组剂量为0.3mg/ 天的化合物每日施用,彼此间隔三天的无药期。图4C显示存在19.29± 0.89%的IOP减少,并且该IOP的下降随时间得以保持。从第二次施用观 察到IOP减少,直到最后一次施用后约48小时,这包括三天的无药期间。 甚至当在多至72小时的期间内不施用所述化合物时,SYL040012能够在 该动物模型中保持IOP水平的减少的事实非常有吸引力。当使用商购药 物时,IOP的持续减少依赖于药物的连续施用。该后一种特征提示 SYL040012能够在患者对治疗的依从性较差的情形中保护免受IOP的重 新启动作用引起的最终视觉损害。 实施例5:在具有高眼压的动物模型中的体内功效 为了评价SYL040012在更接近在青光眼中观察到的病理学条件的条 件下的IOP降低作用,使用新西兰白兔中的口服水过载模型。该模型之 前已被一些作者描述35-38。该模型相对于其他高眼压实验模型的主要优点 在于,避免施用对眼睛有创伤性的刺激性化合物或技术,保持眼结构完好。 这允许眼睛正常响应测试药物38。 第一个实验是剂量范围发现,其中施用四种不同剂量的SYL040012 (0.15,0.3,0.6和0.9mg/只眼睛/天),总共施用3次:在诱导高压前48, 24和2小时。所有的处理在两只眼睛中实施,并且在高压诱导之前和口 服过载后每20分钟直至120分钟测量IOP。结果的重复测量双向ANOVA 分析表明时间(p<0.001)和处理(p<0.0001)的统计学显著作用,但是在这些 因素之间没有相互作用。使用单向ANOVA用Dunnett’s post-hoc检验分 析剂量和PBS的每一个之间的差异。图5A显示SYL040012在所有检测 的剂量提供针对IOP升高的显著性保护(在所有情形中,相对于盐水,p< 0.01)。在用SYL040012处理的动物中的最大平均ΔIOP值(水负载后的 IOP-水负载前的IOP),对于0.15,0.30,0.60和0.90mg/天/只眼睛的 剂量,分别为6,6mmHg,8,2mmHg,4,8mmHg和4,3mm Hg,相反在 对照动物(用媒介物处理)中的最大ΔIOP为15,55mmHg。 为了验证SYL040012对IOP的功效和特异性,将更大组的动物在连 续四天的期间内用固定的剂量0.3mg/天处理。如图5B中观察到的,在用 PBS处理的动物中,在高压诱导后的前一个小时中,水负载引起约7 mmHg的IOP升高。结果的重复测量双向ANOVA分析表明时间和治疗 的显著作用(在两种情形中,p<0.0001),但是在这两个因素之间没有相 互作用。通过单向ANOVA,利用Dunnett’s post-hoc检验,进行进一步的 分析,用于单一比较。这一分析的结果表明,与PBS处理的动物相比, 用SYL040012处理显著减少第一个小时内的ΔIOP值(相对于PBS, p<0.05)。由于使用混杂序列siRNA的处理对IOP没有作用(相对于PBS, p>0.05),因此,SYL040012的作用是特异性的。 为了进一步确保所观察到的IOP降低是相对应的ADRB2 mRNA水平 减少的反映,分析相关的组织。如上述处理动物,并且在最后一次IOP 测量后立即处死,摘下眼睛,并且分离角膜、泪腺和睫状体。提取总RNA, 并且通过实时PCR分析ADRB2的表达,如前所述。如可以从图5C中看 出的,在睫状体和泪腺中都观察到ADRB2 mRNA水平的显著减少。 实施例6:在人中的SYL040012 受试者 招募三十名健康志愿者,他们具有低于21mmHg的IOP,20/25或更 好的Snellen视敏度,并且他们的年龄至少是18岁。所有受试者都按照流 程完成该研究。表1中显示受试者人口统计学参数的平均值±标准偏差。 在进入研究之前进行综合性的体检和眼科检查,以确保受试者参与本研究 的适合性。 研究设计 设计单中心、平行、对照、开放标记的I期临床研究,来评价作为滴 眼液施用的SYL040012的安全性、耐受性和生物利用度。本研究另外的 目的是确定不同剂量的SYL040012对IOP的作用。在所有情形中,药物 仅滴注在随机选择的一只眼睛中;另一只眼睛保持不进行处理,并且作为 眼耐受性和安全性的对照。以盲式方式监测两只眼。 处理时间表 为了使不利作用的危险最小化,并且按照鉴定和减轻研究药物产品对 First-in-Human临床试验的策略的指南(Guidelines on Strategies to Identify and Mitigate Risks for First-in-Human Clinical Trials with Investigational Medicinal Products(EMEA/CHM/SWP/28367/07)),干预期分成两个时间 间隔。时间间隔1开始向一名受试者滴注单一剂量的SYL040012,该受 试者观察72小时。在滴注后24,48和72小时评估耐受性;当耐受性标 准满足滴注后72小时时,对下一名受试者给药。对于每名新的受试者进 行相同的步骤,直到已经施用了六名受试者。良好的耐受性以及由此包括 下一名志愿者的可能性定义为关于不利事件v3.0级别.14常用科学术语标 准(Common Terminology Criteria for Adverse Events v3.0scale.14)不存在 3级以上的毒性。在时间间隔2开始之前测定安全性和耐受性。 在时间间隔2期间,在连续7天内以每天滴注施用SYL040012。在 该时间间隔内测定两个剂量,每个剂量施用给12名受试者。出于安全性 原因,三名受试者的初始组接受低剂量(600μg)的SYL040012;当满足之 前描述的耐受性标准时,其余的受试者分配施用该剂量。对于高剂量(900 μg)进行相同的步骤。 所有的受试者在医院的临床研究部进行治疗,其保证流程的依从性。 表2显示了流程表。 IOP测量 在时间间隔1期间,在用Goldmann眼压计对坐着的受试者滴注后1, 2,4,48和72小时测量IOP。在时间间隔2期间,在第一次滴注(筛查) 之前和治疗4天后确定IOP曲线。在两种情形中,在9:00,12:00,15:00, 18:00和21:00小时测量IOP。还在时间间隔1和2期间在每次评估眼耐 受性时,在滴注前和滴注后1小时测量IOP。在9:00-12:00的上午采取IOP 曲线之外进行的测量。 统计学分析 通过分析时间间隔1滴注后72小时和时间间隔2期间最后滴注后24 小时眼不利作用的发生和频率来评估SYL040012治疗后的眼部和结膜局 部耐受性。使用卡方检验进行眼(施用的相对于未施用的)之间的比较。 通过比较滴注SYL040012后获得的值与筛查时的基底值进行一次滴 注后的单次日常IOP值的分析。通过配对斯氏t检验评估统计学显著性。 通过比较在第4天得到的IOP曲线与在筛查时得到的曲线而评估在时间 间隔2期间SYL040012对IOP的作用。使用治疗和以天为单位的时间作 为变量和IOP作为重复测量,通过重复测量双向方差分析(ANOVA)来评 估统计学显著性,然后通过Bonferroni post-hoc检验来评估每个时间点的 显著性。取决于使用这些统计学检验中的每一种所需要的条件依从性,用 配对斯氏t检验或Wilcoxon检验分析其他参数(临床分析、视敏度、症 状持续性)。认为P<0.05是显著性的。 结果:SYL040012对IOP的作用 在筛查是获得的值与在单次滴注SYL040012后获得的那些值之间没 有观察到IOP的显著差别。在时间间隔2期间,在7天的期间内以重复 的剂量时间表施用SYL040012降低24名健康受试者中的15名的IOP值, 而与所用的剂量无关。600μg剂量的SYL040012在施用4天后引起IOP 的整体统计学显著性降低;post hoc数据分析显示SYL040012对在15:00 小时获得的测量的显著作用(图6A)。与筛查时的值相比,接受该剂量的 五名志愿者在第4天表现出超过20%的平均IOP值减少。我们在该亚组 进行独立的分析,并且发现对IOP的整体统计学显著性作用;post hoc分 析揭示了在所有研究的时间点差异都是统计学显著性的(图6B)。值得注 意的是,这五名受试者中的基底IOP值高于其他受试者中的基底IOP值 (分别地,16.2±2.9mmHg相对于14.9±2.8mmHg)。对于其他抗青光眼 药物已经报道了这种具有较高的IOP值的增加的反应性。39 实施例7:治疗成年人中的高眼压或开角型青光眼:双盲、安慰剂对照的 多剂量功效试验 患者 招募总共80名男性和女性受试者,他们被研究者评估为良好或中等 一般健康,年龄≥18岁,具有既往病史或刚诊断的升高的IOP(≥21mmHg), 在两只眼睛肿具有或不具有开角型青光眼。为了包括在该研究中,他们必 须具有正常的结果,或下述两只眼睛肿的评估的典型的开角型青光眼的结 果: -视野24-2或等价的(24-2Humphrey视野SITA检验,每只眼睛约 5分钟)。 -光学相干层析成像(OCT)。 -在斯内伦视力表上,最佳校正的视敏度≥0.5(20/40),或≤0.3 logMAR。 -希尔默试验(Schirmer test)(流泪)。 -眼底镜检查。 该试验的主要目的是确定在14天的治疗期间SYL040012的每日剂量 后眼表面上(角膜和结膜)的耐受性和对眼内压的作用。 次要目的包括评估每次剂量后的局部耐受性,系统耐受性(对实验室 参数、体检、生命体征和心电图的作用),和可能与研究产品相关的眼底 或视敏度的变化(如果有的话)。 基线期间 在第一次施用研究产品前多至30天,招募受试者参与临床试验的治 疗期间的合格性。通过抗青光眼药物需要清洗,该期间可以更久些。允许 需要短暂清洗的抗青光眼药物的暂时的处方。 如果在基线期间开始时,患者进行具有数周清洗的抗青光眼用药(参 考European Glaucoma Society,研究流程表的脚注),研究者可以开出具 有短暂清洗时间的另一种抗青光眼药物,以避免眼睛没有持续数周的降低 IOP的用药。 治疗期间 在第1天,受试者以1∶1∶1∶1的比率随机以滴眼液施用80μg SYL040012,300μg SYL040012,900μg SYL040012或安慰剂。 受试者每天(包括银行休假日和周末)回到研究产品施用和评估地点。 受试者在两只眼睛肿接受1剂量的研究产品,持续14天。 随访 在最后一次研究产品施用后4-7天(最后一次施用后96小时起[4天] +3天)进行随访时进行最终评估。 为了确定SYL040012对患者IOP的作用,在开始治疗前那天和在地 14天用Goldmann眼压计获得24小时IOP测量曲线。调整时间点为用于 IOP曲线测量的经典的时间表(09:00,12:00,15:00和18:00以及次日的 9:00)。此外,在第1,7和15天,还在接受最后一次施用后4-7天发生的 随访过程中进行单次IOP测量。 说明书中引用的参考文献 1.Quigley H.Glaucoma.Lancet(柳叶刀)2011;377:1367-1377. 2.Weinreb RN,Khaw PT.Primary open-angle glaucoma(原发性开角型青 光眼).Lancet(柳叶刀)2004;363:1711-1720. 3.Glaucoma is the second leading cause of blindness globally(青光眼是全 球第二大失明的原因).Bulletin of the WorldHealth Organization(世界卫 生组织报告书)2004;82:811-890. 4.Varma R,Lee PP,Goldberg I,Kotak S.An assessment of the health and economic burdens of glaucoma(青光眼健康和经济负担评估).Am J Ophthalmol(美国眼科学杂志)152:515-522. 5.Khaw PT,Shah P,Elkington AR.Glaucoma--1:diagnosis(青光眼--1: 诊断).BMJ 2004;328:97-99. 6.Caprioli J,Varma R.Intraocular pressure:modulation as treatment for glaucoma(眼内压:调节作用青光眼的治疗).Am J Ophthalmol(美国眼 科学杂志)152:340-344e342. 7.Heijl A,Leske MC,Bengtsson 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本发明涉及降低眼睛的IOP的方法、组合物和剂量,其包括19个核苷酸的双链RNA分子。 。
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