本发明属来源于植物的药物制品领域。 目前临床上应用的疫苗用免疫佐剂（Immunological Adjuvant）为氢氧化铝胶（Alum）。它从30年代起始用，现已有60多年历史了。其优点：（1）对传统疫苗免疫佐剂性效果较好；（2）毒性小；（3）生产成本不高。但随着新型疫苗（如DNA重组疫苗，合成肽疫苗）的问世，Alum则存在着一些无法克服的缺点：1、对某些新型疫苗（如流感疫苗）无免疫佐剂性效果；2、Alum制备过程，质量控制难以标化；3、不能诱生机体的细胞免疫反应；4、批与批之间免疫佐剂性效果波动大，重复性差等等。因此，近十余年来，各国科研工作者，采用了不同来源及途径，研制了一系列新免疫佐剂，但由于效果差或毒性大等原因，至今仍无一种新型免疫佐剂，能用作人类疫苗的免疫佐剂。在新型疫苗研究及开发中最大的，共同的问题之一是免疫原性很低，单独使用很难使机体产生有保护作用的免疫应答。新型免疫佐剂与新型疫苗合用，是传统的、行之有效的、提高疫苗免疫原性的手段和策略。因此，新型免疫佐剂就成为新型疫苗的必不可少的组成成分。美国专利US4，843，067只提出增强免疫功能的一个次要成份为ASD多糖，用于免疫治疗，其主要成份为黄芪多糖对免疫功能起增强作用，治疗人的免疫功能低下如老龄等，其分离提取制备方法与本发明完全不一样。
本发明的目的是研制出了佐剂性效果好、毒性小，优于现用的氢氧化铝胶的新免疫佐剂。新型免疫佐剂与相应的疫苗（即抗原）结合，组成最佳的配方，即形成免疫刺激复合物，才能最好的发挥其免疫佐剂性效果。
本发明地主要内容为，从传统中草药伞形科植物[Angelica Sinensis（Oliv）Diels]即ASD中分离提取及制备多糖部份ASDP作为疫苗和佐剂的载体，ASDP本身也有免疫生物活性。内酯部份ASDE1-8，主要用ASDE3，8个部份可单独用也可以合用，作为免疫佐剂。并且将两部份按一定比例混合制备成复合免疫佐剂，ASDP/ASDE，再分别与相关抗原如乙肝血原疫苗，乙肝基因工程疫苗（r-HBsAg）等合用（作为实验组），以Alum作为对照，用多项指标，检测了免疫佐剂性效果。研究结果显示ASDP/ASDE3在实验动物体内，能明显增强乙肝血原疫苗及乙肝基因工程疫苗免疫原性（Immunogenicity），其抗原的半有效量（ED50），实验组较对照组一般要低3～4倍，研究过程中，未见毒副作用；同时还有诱导和增强机体的细胞免疫、细胞因子等广泛的免疫调节作用。从广义免疫佐剂来讲，ASDP/ASDE是免疫调节剂（Immunomodulator），既可用于免疫预防（Immunoprophylaxis）也完全可以用作免疫治疗。（Immunotherapy）
1、新型免疫佐剂，内酯类物质，ASDE系列（ASDE1-8），其特征在于从传统中草药伞形科植物[Angelica Sinensis（Oliv） Diels]即ASD中分离、提取及制备的内酯类物质；
a、伞形科传统中草药（Angelica Sinensis（Oliv）Diels，ASD），用粉碎机粉碎。
b、加95%乙醇，等体积，60℃，抽提3次，每次1小时；
c、乙醇提取物合并、减压浓缩去有机溶媒；
d、乙醇提取后不溶物，晾干，备用；
e、乙醇提取物柱层析：（1）柱层析：100×3CM，（2）硅胶粒度范围100目，青岛海洋化工厂产品，300克，（3）上样品量与硅胶比为1：50（w/w），（4）洗脱液乙酸乙酯：环已烷5：95～20：80（v/v），（5）流速2ml/分，洗脱液按每份100ml收集，（6）同时用硅胶GF254（TLC），扩展系统，乙酸乙酯：环已烷（1：5，V/V）测Rf值，经三用紫外分析仪，波长2537检测ASDE3-8，3650检测ASDE1-2；（7）根据检测波长，洗脱时间及Rf值不同，相同的收集液，合并、减压浓缩，依次分别得到ASDE内酯类系列（ASDE1-8）：ASDE1洗脱时间1小时，Rf值0.70，ASDE2洗脱时间1-2小时，Rf值0.61，ASDE3洗脱时间2.5-3小时，Rf值0.51，ASDE4洗脱时间3-3.5小时，Rf值0.41，ASDE5洗脱时间3.5-4.5小时，Rf值0.28，ASDE6洗脱时间4.5-5.0小时，Rf值0.17，ASDE7洗脱时间5-5.5小时，Rf值0.06，ASDE8洗脱时间5.5-6.5小时，Rf值0；
f、ASDE1-8这八个部份，均有免疫佐剂活性，实验中一般用ASDE3;
g、ASDE1-8部份经TLC谱，紫外及红外光谱等分析，符合内酯类物质。
2、新型疫苗及佐剂载体，多糖类物质，ASDP，其特征在于从传统中草药ASD中分离、提取及制备方法：
a、ASD经乙醇抽提之后的不溶物，称重；
b、加等体积的蒸馏水PH7.0，60℃，抽提1小时；
c、水提取物，减压浓缩；
d、水提浓缩物，加1/10体积的氯仿：正丁醇（4：1），振荡5分钟后，过滤；
e、滤液，减压浓缩；
f、加入2倍体积乙醇，振荡5分钟后过滤；
g、沉淀物用乙醇洗三次；
h、沉淀物洗过后，冷冻、干燥，得ASDP样品；
i、ASDP样品经TLC谱，紫外光谱及红外光谱，（有明显的-OH基，-CH2基峰等理化性质，符合多糖类物质。
3、新型复合免疫佐剂，即ASDP/ASDE，其特征在于，其中的免疫佐剂是由ASD中制备的ASDE系列，通常多用ASDE3，疫苗及免疫佐剂载体为由ASD中制备的ASDP，分别称取ASDE及ASDP，按1：2的重量比例混合后，制备成复合免疫佐剂ASDP、ASDE，再按所需要的剂量与相关抗原合用。
4、新型复合免疫佐剂的用途，其特征在于制备免疫预防（Immunoprophylaxis）和免疫治疗（Immunotherapy）的免疫调节剂（Immunomodulator）的用途。
ASDP/ASDE3的免疫佐剂性评价：
1、ASDP/ASDE3的免疫佐剂性
用ASDP/ASDE3分别与乙肝血源疫苗、乙型肝炎基因工程疫苗合用，免疫小鼠，6周后分离血清，用固相放射免疫法（RIA Kli），测定小鼠血清阳转数、血清阳转率、S/N比值及RIA参考单位，实验组较对照组均有明显增高。抗原半有效量（ED50），对照组比实验组高3倍以上。（表1）
2、免疫佐剂ASDE1-8中，有效部份合用，对增强抗原免疫原性有协同作用。（见表3）
3、抗HB5抗体阳性的小鼠血清，实验组与对照组同时对倍稀释，分别测各稀释血清的抗体水平，结果表明，实验组血清抗HB5抗体水平较对照组高20倍以上。（图1）
4、ASDP/ASDE3及Alum分别作为佐剂，作量效反应曲线试验，结果表明，ASDP/ASDE3有效剂量的范围较宽，小鼠从128/64mg/kg到2/1mg/kg。（图2）
5、ASDP/ASDE3对小鼠的单核巨噬细胞系统的功能，细胞免疫及多种细胞因子的活性，都有广泛的免疫调节作用。这是ASDP/ASDE3作为免疫佐剂的免疫生物学基础，同时也是作为免疫治疗剂的免疫生物学基础。
6、ASDP/ASDE3对流行性出血热灭活疫苗、乙肝血源疫苗等都能提高它们的免疫原性。
7、ASDP/ASDE3毒理学研究结果表明，毒性很低，用小鼠及大鼠，4种佐剂样品，测定其急性毒性（LD50），未见急性毒性反应（表2）；ASDP/ASDE3局部用药的刺激性试验；用多种途径，多次用药后，再经肉眼及组织学观察，均未见病理性反应及组织损害（表4），用小鼠及豚鼠的Ⅰ型变态反应试验表明ASDP/ASDE3不是Ⅰ型变态反应的过敏原（表5及表6）。ASDP及ASDE系列（即ASDE1-8的有效成分）的理化性质及初步鉴别：（1）ASDP经薄层层析，紫外光谱及红外光谱等特性的分析，认为是多糖类物质（图3、图4、图5）（2）ASDE系列即ASDE1-8共8个有效成分，经薄层层析，紫外光谱及红外光谱特性的分析，认为它们都是内酯类物质（图3、图6、图7）。
本发明的优点和积极效果：主要优点是由多糖类（ASDP）作载体，对HBsAg免疫佐剂性效果明显优于现用的氢氧化铝胶（Alum），毒副作用很小，ASDP及ASDE3对实验动物单核巨噬细胞系统，T淋巴细胞，细胞因子，B淋巴细胞的免疫生物学活性，都有广泛的免疫调节作用。这是ASDP/ASDE3作为佐剂多效用性的免疫生物学基础，ASDP/ASDE3已初步试用于其它疫苗，也有很好的免疫佐剂效果。同时也可作为新免疫调节剂用于免疫治疗。本发明药源充足，制备流程方法的稳定性重复性好，可行性强。ASDP/ASDE3本质为免疫调节剂（Immuno modulators）与抗原（疫苗）合用，用于免疫预防（Immunoprophylaxis），能明显降低抗原的有效剂量，提高预防接种效果，特别对昂贵的新型疫苗来说，ASDP/ASDE3如能在大面积人群推广使用，定会取得可观的社会效益和经济效益。
附图说明：
图1为新免疫佐剂ASDP/ASDE3与阳性对照佐剂氢氧化铝胶（Alum），分别与乙型肝炎血源疫苗及乙型肝炎基因工程疫苗合用，分离小鼠血清后进行稀释，比较抗HBs抗体的滴度水平，横座标为稀释度，纵座标为cpm均值（×103），曲线1为r-HBsAg/ASDP/ASDE3；曲线2已知抗HBs抗体阳性对照血清，曲线3为r-HBsAg/Alum（阳性佐剂对照），曲线4为已知抗HBs抗体阴性对照血清。图1表明新型复合免疫佐剂抗HBS抗体水平，较阳性对照佐剂Alum高20倍以上。
图2为ASDP/ASDE3免疫佐剂性剂量反应曲线图。横坐标为ASDP/ASDE3浓度mg/kg，纵坐标A，为cpm均值（×103）结果见曲线5，（对照Al（OH）3为2.5×103）。纵座标B，为血清阳转率（%），结果见曲线6，（Al（OH）3为67%）。纵座标C，为样品cpm值与已知阴性血清cpm值比值（S/N），结果见曲线7（AL（OH）3为28）。
图3为ASDE佐剂系列即ASDE1-8及ASDP的薄层层析（TLC）图谱，扩展溶媒为乙酸乙酯：环已烷（20：80，v/v）显迹，是用紫外线分析仪。
图4为ASDP紫外光谱图（UV），曲线8为ASDP呈末端吸收，符合多糖类紫外光谱，曲线9为小牛血清白蛋白280mm有吸收峰。
图5为ASDP红外光谱图（IR），曲线10呈糖类典型羟基（-OH）峰。
图6为ASDE系列（ASDE1-8）紫外光谱图，曲线11-18，ASDE1_2UV相似。
图7为曲线19，20分别为ASDE2、ASDE3红外光谱图，均有典型羰基（-o=o）吸收峰（1200-1800nm）符合内酯类化学物质。
图8为ASDE1-8及ASDP的分离提取及制备流程图。
本发明的最佳实施例
1、ASDE系列（ASDE1-8内酯类）的分离、提取、制备：
a、ASD100克加95%乙醇100ml，60℃振荡，提取三次。
b、乙醇提取物合并，减压浓缩成20ml。
c、硅胶柱层析，层析柱100cm×3.0cm。
d、上述样品与硅胶比为1：50（W/W）。
e、先后用乙酸乙酯-环已烷5：95～20：80（v/v），洗脱，流速2ml/分。
f、梯度洗脱，分部收集之洗脱液，经薄层层析，扩展溶媒系统，乙酸乙酯：环已烷（1：5，v/v），紫外检测，波长2537检测ASDE3-8部分，3650检测ASDE1-2部分，并测出各部分Rf值（附图3）。
g、将理化性质相同的洗脱液，分别合并，减压，浓缩。
h、可得到ASDE1-8，其中ASDE3为0.3克。
2、ASDP（多糖类）分离、提取、制备；
a、ASD经提取过ASDE系列后的乙醇不溶物，晾干称重100克，
b、加PH7之蒸馏水100ml，
c、60℃提抽三次，
d、水提物收集，合并，减压浓缩，
e、浓缩液加氯仿：正丁醇4：1，沉淀，过滤，
f、取上清液加三倍乙醇沉淀过滤，
i、取沉淀用乙醇洗三次，
j、沉淀物，经冷冻干燥，可得ASDP3克。
3、免疫刺激复合物即抗原+载体（ASDP）+佐剂（ASDE1-8）的制备：
按2：1比例（w/w）混合，振荡5分钟，制备成复合免疫佐剂，然后再与所试的抗原（疫苗）混合，轻轻振荡30分钟，在室温2～3小时后，制备成免疫刺激复合，即可免疫实验动物。
表1.新免疫佐剂ASDP/ASDE3的免疫佐剂性
乙肝表面抗
免疫佐剂 剂量 原(HBsAg) 血清阳 血清阳 S/N RIA ED50P值
mg/kg 微克/鼠 转数 转率%
AL(OH)3100 1.25 7/7 100 13.7 560 0.363
(对照) 0.3125 3/7 43 0.8 <8
0.078 0/7 0 0 0
ASDP 60 30 1.25 7/7 100 32.9 1820 0.118 <0.01
ASDE30.3125 7/7 100 12.7 551
0.078 2/6 33 6.0 22
*小鼠 BALB/C 雄性 三周龄，8-10克
样品用50%小牛血清1：5稀释
表2.ASDP/ASDE的急性毒性（LD50）
小鼠 (mg/kg) 大鼠(mg/kg)
免疫佐剂 S.C. I.M. I.V. S.C.
ASDE2>4000 >800 >800
ASDP/ASDE2>2000 >200 100
ASDE3>4000 >1600 >640
ASDP/ASDE3>2000 >800 200