技术领域
本发明涉及用于表达环形肽的表达盒及其应用。
背景技术
蛋白内含肽(Intein)是一种“自私”的或“寄生性”的蛋白或其编码基因，其框内插入宿主蛋白，和宿主蛋白一起翻译成由N-端外现肽(Extein)、内含肽、C-端的外现肽组成的前体蛋白，随后前体蛋白在内含肽的作用下发生自我剪接，内含肽从前体蛋白中释放出来，并将剩下的外显肽连接成成熟的功能蛋白。自从1987年首次发现内含肽以来，到2009年11月为止已经在真核、原核、古细菌甚至病毒等几乎所有生物中发现了490多种、100-800个氨基酸大小不等的内含肽(刘萱，赵志虎，刘传喧.内含肽介导的生物学效应及其应用[J].中国生物工程杂志，2003，23(2)：17-24.；http://tools.neb.com/inbase/list.php)。
普通内含肽由具有自我剪接活性的N-端剪接域、C-端剪接域以及中间的归巢内切酶(Homing endonuclease)区域三部分构成，归巢核酸内切酶结构域对于内含肽介导的蛋白剪接并不是必须的，可以剔除从而得到微小内含肽。有时包含内含肽的前体蛋白由两个不同基因组成，这种内含肽又叫做分裂型(Split)内含肽。来源于蓝细菌Synechocystis sp.PCC6803的DNA聚合酶III的α亚单位DnaE就是一个分裂型内含肽，就分别由dnaE-n、dnaE-c两个基因组成，其中dnaE-n编码一个N-端的外显肽以及一个122个氨基酸的内含肽，而dnaE-c则编码一个37个氨基酸的内含肽以及一个C-端外显肽(Wu H，Hu Z，Liu X Q.Protein trans-splicing by a split intein encoded in asplit DnaE gene of Synechocystis sp.PCC6803[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1998，95(16)：9226-9231.)。
与线性多肽相比，环肽由于分子构象受到一定的限制，具有半衰期较长、结构相对复杂、生理活性多样和特异性高等特点，能够作为先导化合物用于新药开发。目前，一些生理活性环肽，如胰岛素、催产素、抗体、真菌毒素，已被成功合成并广泛应用于药理学、医药领域。目前，从分裂型内含肽介导的环肽文库中，已经成功筛选得到了可以抑制DNA腺嘌呤甲基转移酶、ClpXP蛋白酶、HIV出芽以及α-synuclein蛋白聚集从而降低其毒性等的多种小分子环肽(Kritzer J A，Hamamichi S，McCaffery J M，etal.Rapid selection of cyclic peptides that reduce α-synuclein toxicity inyeast and animal models[J].Nat Chem Biol，2009，9(5)：655-663.；Naumann T A，Tavassoli A，Benkovic S J.Genetic selection of cyclic peptide Dammethyltransferase inhibitors[J].Chembiochem，2008，9(2)：194-197.；TavassoliA，Lu Q，Gam J，et al.Inhibition of HIV budding by a genetically selected cyclicpeptide targeting the Gag-TSG101 interaction[J].ACS Chem Biol，2008，3(12)：757-764.；Cheng L，Naumann T A，Horswill A R，et al.Discovery ofantibacterial cyclic peptides that inhibit the ClpXP protease[J].Protein Sci，2007，16(8)：1535-1542.)，提示分裂型内含肽介导的环形小分子文库，可能是活性小分子或者先导化合物的一种重要来源。
发明内容
本发明的目的是提供用于表达环形肽的表达盒及其应用。
本发明提供的表达盒是如下(a)或(b)或(c)的DNA分子：
(a)序列表的序列2自5’末端第6至510位核苷酸所示的DNA分子；
(b)序列表的序列2所示的DNA分子；
(c)将氯霉素乙酰基转移酶基因插入(a)或(b)所述DNA分子的酶切位点得到的DNA分子；所述限制性内切位点为NdeI酶切位点、KpnI酶切位点和BamHI酶切位点中的两个；所述氯霉素乙酰基转移酶如序列表的序列4所示。
所述(c)中的DNA分子具体可为将氯霉素乙酰基转移酶基因插入序列表的序列2所示的DNA分子的NdeI酶切位点和BamHI酶切位点得到的DNA分子；所述氯霉素乙酰基转移酶基因如序列表的序列3所示。
本发明还保护含有任一所述DNA分子的重组载体或重组菌。
所述重组载体可为将任一所述DNA分子插入pET-28a质粒的多克隆位点得到的重组质粒，具体可为将任一所述DNA分子插入pET-28a质粒的NcoI和SalI间得到的重组质粒。
所述重组菌可为将所述重组载体导入大肠杆菌得到的重组菌。所述大肠杆菌具体可为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明还保护(a)或(b)所述DNA分子在表达外源蛋白中的应用。
所述外源蛋白具体可为氯霉素乙酰基转移酶；所述氯霉素乙酰基转移酶具体可如序列表的序列4所示。
所述应用可通过用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导工程菌表达实现；所述工程菌是将pET-28a/Int-C-CAT-N转化大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌；所述pET-28a/Int-C-CAT-N是将(c)所述DNA分子插入pET-28a质粒的NcoI和SalI间得到的重组质粒。
本发明提供的表达盒中，含有分裂型DnaE内含肽，设有外源基因的插入位点，可以大大提高外源基因的表达量。将本发明的表达盒插入表达载体可以得到重组质粒，该重组质粒导入大肠杆菌得到的重组菌可以作为高通量筛选模型，进行特定生物活性小分子环肽的筛选等工作。本发明提供的的表达盒，可以用于蛋白环形突变体、环肽小分子文库构建与表达的高效表达载体，为分裂型内含肽DnaE的体内外自我剪接机制的研究、小分子环肽文库的构建与筛选等奠定了基础。
附图说明
图1为基因设计、合成、组装与克隆、鉴定详细流程。
图2为初步序列和优化后序列的高级结构预测。
图3为原始序列、初步序列、优化后序列的比较。
图4为原始序列、初始序列、优化后序列的氨基酸密码子使用频率比较。
图5为PCR产物和酶切产物的电泳图；1：PCR产物；2：酶切产物。
图6为表达盒的测序结果。
图7为表达盒的应用(介导环形分子的形成)；1：BL21(DE3)；2：BL21(DE3)(pET-28a/IntCN)(IPTG-)；3：BL21(DE3)(pET-28a/IntCN)(IPTG+)；4：BL21(DE3)(pET-28a/IntC-CAT-N)(IPTG-)；5：BL21(DE3)(pET-28a/IntC-CAT-N)(IPTG+)。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1、用于制备环肽的表达盒的制备
制备流程见图1。
一、初步序列的设计
1、从NCBI中使用GeneID：P74750检索获得来源于蓝细菌Synechocystis sp.PCC6803的分裂型内含肽DnaE-c、DnaE-n结构域的氨基酸序列。蓝细菌Synechocystissp.PCC6803的分裂型内含肽DnaE如序列表的序列1所示。DnaE-n如序列表的序列1自氨基末端第776至897位氨基酸残基所示，DnaE-c如序列表的序列1自氨基末端第898至934位氨基酸残基所示。
2、将DnaE-c(37个氨基酸)、DnaE-n(122个氨基酸)前后颠倒、融合，得到初步的共159个氨基酸的模板氨基酸序列及其对应的核苷酸序列(原始序列)。
3、由于选择的模板序列来源于蓝细菌，其氨基酸密码子的使用频率与大肠杆菌中的存在较大区别，为了避免密码子偏性影响基因在大肠杆菌中的高效表达，根据DnaE的模板氨基酸序列，选择大肠杆菌作为表达宿主，利用Gene Design 3.0的反向翻译模块Reverse Translation module进行反向翻译，得到初步序列。
二、初步序列的优化
1、重复序列分析
重复序列的存在，对于后续基因的合成、寡核苷酸的组装等过程将带来不利影响。利用随机重复序列分析软件Tandem Repeats Finder，对初步序列进行重复序列的分析，发现初步序列中不存在严重的重复序列。
2、同义密码子调整和复杂高级结构分析
除了基因的密码子、起始位点的局部二级结构外，包括整个编码区在内的全部基因复杂高级结构，可能是影响基因表达的另一个重要因素。为了剔除初步序列中的复杂高级结构，利用UNAFold软件的DNA、RNA Folding模块，对初步序列的高级结构进行分析，发现在初步序列中，存在大大小小的14个复杂的高级结构，可能会影响最终基因的高效表达。
为了克服上述影响，选择大肠杆菌中的同义密码子，利用Gene Design 3.0的密码子替换(Codon Juggling)模块对初步序列进行优化。在优化之前，初步序列的100bp、300bp附近，分别存在一个复杂的高级结构，而本次优化以后，这两处的高级结构被分解成两个较小的结构，复杂性大大降低(见图2)。经过优化，一些复杂高级结构甚至被完全剔除，最终使全序列的高级结构从14个降低到7个。
重复进行步骤1和步骤2，最后得到477bp的优化后序列。
原始序列、初步序列以及优化后序列的比较见图3。在不改变氨基酸序列的前提下，优化后序列与原始序列约有1/4(118处)存在差异。氨基酸密码子使用频率的分析发现：原始序列中大肠杆菌偏性使用密码明显偏低，而优化后序列中大肠杆菌偏性密码使用频率得到明显提高。优化后序列虽然在第25个氨基酸、96个氨基酸附近偏性密码子使用频率低于初步序列，但仍然明显高于原始序列的使用频率(见图4)，这两处的改变，大大降低了局部的复杂高级结构，应该不会影响基因在大肠杆菌中的高效表达。
三、表达盒DNA的获得
1、多克隆位点、限制性酶切位点以及保护性碱基的添加
利用GeneDesign 3.0的限制性酶切位点添加(Restriction site addition)、短序列添加(short sequence addition)模块并结合Tandem Repeats Finder进行重复序列的分析，在DnaE-c、DnaE-n两个结构域之间添加一段含有NdeI、KpnI、BamHI酶切位点(下划线部分)以及三种不同框架的终止密码(阴影部分)的短的核苷酸linker序列即CATATGTAACTGAGTAG GTACC GGATCC，linker序列的添加可以方便外源基因或者随机短肽文库在NdeI、BamHI位点克隆，与分裂型内含肽实现框内融合。同时在5’-、3’-端添加限制性酶切位点NcoI、SalI、PstI、终止密码TAATGA以及保护性碱基，得到534bp的完整序列(含有DnaE以及合适酶切位点、中间linker序列)。
2、表达盒DNA的获得
利用Tandem Repeats Finder对上述完整序列进行重复序列分析、优化直到不存在严重的重复序列以后，得到优化后的最终含有分裂型DnaE基因、合适Linker序列以及酶切位点的序列，即本发明的表达盒(见序列表的序列2)。序列2所示的表达盒由531个核苷酸组成，自5’末端第6-116位核苷酸为DnaE-c的编码基因，第117-144位核苷酸为多克隆位点Linker，第145-510位核苷酸为DnaE-n的编码基因。
四、表达盒DNA的制备
以表达盒的核苷酸序列为出发点，利用GeneDesign 3.0的建筑预制件设计(Building Block Design)模块，将全长531bp的表达盒划分成44-61nt长度不等、相互互补的14个寡核苷酸片段，进行寡核苷酸片段的合成。14个寡核苷酸片段见表1。
表1 用于组装分裂型DnaE内含肽的不同寡核苷酸序列
名称 序列(5’-3’) 长度(nt) Seq1 ATACCATGGTTAAAGTTATCGGTCGTCGTTCTCTGGGTGTTCAGCGTATCTTCGACATCGG 61 Seq2 CCGTTAGCCAGCAGGAAGTTGTGGTCCTGCGGCAGACCGATGTCGAAGATACGCTGAACA 60 Seq3 ACAACTTCCTGCTGGCTAACGGTGCTATCGCTCACAATTGTCATATGTAACTGAGTAGGTACCG 64 Seq4 TCAGGATTTCGGTACCGAAAGACAGGCAGTTGGATCCGGTACCTACTCAGTTACATATGACA 62 Seq5 TGTCTTTCGGTACCGAAATCCTGACCGTTGAATACGGTCCGCTGCCGATCGGTAAAATC 59
Seq6 GGGTCAACAGAGTAAACAGAGCAGTTGATTTCTTCAGAAACGATTTTACCGATCGGCAGCGG 62 Seq7 CTGCTCTGTTTACTCTGTTGACCCGGAAGGTCGTGTTTACACCCAGGCTATCGCTCAG 58 Seq8 CAGTTCGTATTCCAGAACTTCCTGTTCACCACGGTCGTGCCACTGAGCGATAGCCTGGGTGT 62 Seq9 CAGGAAGTTCTGGAATACGAACTGGAAGACGGTTCTGTTATCCGTGCTACCTCTGACCAC 60 Seq10 CGATAGCCAGCAGCTGGTAGTCGGTGGTCAGGAAACGGTGGTCAGAGGTAGCACGGATA 59 Seq11 ACTACCAGCTGCTGGCTATCGAAGAAATCTTCGCTCGTCAGCTGGACCTGCTGACCC 57 Seq12 GTGGTTGTCCAGAGCTTCTTCGGTCTGTTTGATGTTTTCCAGGGTCAGCAGGTCCAGCTG 60 Seq13 CGAAGAAGCTCTGGACAACCACCGTCTGCCGTTCCCGCTGCTGGACGCTGGTACCATC 58 Seq14 AAACTGCAGGTCGACTCATTATTTGATGGTACCAGCGTCCAGCA 44
合成表1所示的14条寡核苷酸片段，等摩尔混合后作为模板，以最外围的Seq1和Seq14为引物，通过重叠PCR，将14条片段进行一次性组装，PCR产物进行电泳。电泳图见图5，电泳显示，PCR产物约531bp。
分离、纯化PCR产物，用限制性内切酶NcoI和SalI进行双酶切、回收酶切产物；用限制性内切酶NcoI和SalI双酶切pET-28a质粒(Novagen，产品目录号69864-3)，回收载体骨架；将酶切产物与载体骨架连接；将连接产物进行测序，测序结果见图6。结果表明，得到了重组质粒pET-28a/IntCN(在pET-28a质粒的NcoI和SalI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的PCR产物)。重组质粒pET-28a/IntCN用NcoI和SalI进行双酶切，酶切产物的电泳图见图5。
实施例2、表达盒的应用
一、重组菌甲的制备
以pET-14b(Novagen，产品目录号69674)为模板，用CAT基因特异引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(氯霉素乙酰基转移酶基因；CAT基因)。
CAT基因特异引物：5’-ggcatatggagaaaaaaatcactggatat-3’；
5’-aaggatcccgccccgccctgccactc-5’。
分离、纯化PCR产物，用限制性内切酶NdeI和BmaHI进行双酶切、回收酶切产物；用限制性内切酶NdeI和BmaHI双酶切重组质粒pET-28a/IntCN，回收载体骨架；将酶切产物与载体骨架连接；将连接产物进行测序。测序结果表明，得到了重组质粒pET-28a/Int-C-CAT-N(在pET-28a/IntCN的NdeI和BmaHI酶切位点之间插入了序列表的序列3所示的CAT基因；DnaE-c编码基因、DnaE-n编码基因与中间插入的CAT基因表达可形成IntC-CAT-N融合蛋白)。
用重组质粒pET-28a/Int-C-CAT-N转化大肠杆菌BL21(DE3)(Novagen，产品目录号69387-3)，得到重组菌甲。
二、重组菌乙的获得
用重组质粒pET-28a/IntCN转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌乙(对照)。
三、氯霉素乙酰基转移酶表达量的检测
分别将初始浓度相同(均为OD＝0.1)的大肠杆菌BL21(DE3)、重组菌甲和重组菌乙培养3小时，然后加入IPTG(使其终浓度为1mM)诱导表达，重组菌甲和重组菌乙均设置不用IPTG诱导的对照，继续培养3小时，然后离心，收集菌液进行SDS-15％聚丙烯酰胺凝胶电泳。
电泳图见图7。由图7可见：大肠杆菌BL21(DE3)、IPTG诱导的重组菌乙，未经诱导的重组菌乙中，都检测不到预期分子量的IntC-CAT-N融合蛋白(43.8KD)和预期分子量的CAT蛋白(25.7KD)；IPTG诱导的重组菌甲，未经诱导的重组菌甲中，都检测到预期分子量的IntC-CAT-N融合蛋白，IPTG诱导可以使融合蛋白的表达量增加；只有IPTG诱导的重组菌甲中可以检测到预期分子量的CAT蛋白(由融合蛋白中释放)和Int-NC(融合蛋白释放CAT蛋白后经自身剪接得到的翻译后加工产物)。
以上结果与分裂型内含肽可以介导环形分子的形成等相关文献相关报道一致(Muralidharan V，Muir T M.Protein ligation：an enabling technology for thebiophysical analysis of proteins[J].Nat Meth，2006，3(6)：429-438.；VolkmannG，Murphy P W，Rowland E E，et al.Intein-mediated cyclization of bacterialacyl carrier protein stabilizes its folded conformation but does not abolishfunction[J].J Biol Chem，2010，285(12)：8605-8614.)，表明本发明合成的表达盒的确可以进行自身翻译后的剪接加工，导致环形分子CAT突变体的形成。