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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810895773.9 (22)申请日 2018.08.08 (71)申请人 上海市第一人民医院 地址 200080 上海市虹口区海宁路100号 (72)发明人 马春辉王刚吕琦易诚青 腾松松 (74)专利代理机构 上海卓阳知识产权代理事务 所(普通合伙) 31262 代理人 巫蓓丽 (51)Int.Cl. C12N 5/0775(2010.01) (54)发明名称 一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法 及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种滑膜间充质干细胞的软组 织构建方法。
2、， 所述方法通过滑膜间充质干细胞的 分离与培养、 滑膜间充质干细胞的鉴定、 软组织 的培养与分离、 软骨分化能力检测四个步骤简单 有效地制造出软组织并对软骨分化能力进行检 测， 从而达到有效修复软骨的目的。 其优点在于： (1)本发明所构建的软组织具有良好的软骨分化 能力， 可为软骨修复提供新的选择； (2)取样方 便， 易于检测， 具有很好的应用前景。 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 CN 108949679 A 2018.12.07 CN 108949679 A 1.一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法， 其特征在于， 所述构建方法包括以下步 骤： (1)间充质干细胞的分离与培养： 。
3、将标本用乙醇表面消毒， PBS缓冲液洗涤， 置于培养皿 中， 用消过毒的手术剪刀将组织剪为小碎片， 置于离心管中， 加适量PBS缓冲液， 离心， 弃去 上清， 加入适量II型胶原酶， 摇床振荡(200rpm， 37)后， 离心弃去胶原酶， 最后在组织碎片 中加入适量含10FBS的低糖DMEM培养液， 而后转移到培养皿中， 置于培养箱中培养， 两天 后将组织块转移置新的培养皿中， 继续培养两天而后弃去组织块， 直到间充质干细胞长满 培养皿； (2)间充质干细胞的鉴定： 将细胞消化、 重悬、 离心、 用PBS缓冲液洗涤， 调整细胞密度为 2106/ml左右， 取100 l待测细胞悬液， 加入抗CD。
4、44、 CD90、 CD105以及CD45、 CD34的单克隆 抗体， 避光常温反应30min， 而后离心、 弃上清， 收集细胞， PBS缓冲液冲洗， 多聚甲醛固定， 最 后上流式细胞仪检测标记物的表达情况； (3)软组织的培养与分离： 将第三代间充质干细胞消化、 计数， 接种于12孔板中， 1.2* 106/孔， 用含有0.3mMAsc-2P的低糖DMEM培养液培养， 2-3天更换一次培养液， 10-14天后弃 去培养液， 而后用枪头沿着培养皿的边缘轻轻吹打至细胞层逐渐收缩形成一团软组织， 将 软组织置于滤纸上， 除去培养基， 用镊子轻轻夹起， 检测软组织的弹性， 将软组织置于多聚 甲醛固定。
5、， 石蜡包埋， 切片， 脱蜡， 进行HE染色； (4)软骨分化能力检测： 将软组织置于12孔板内， 使用低糖DMEM培养1天使其充分贴壁， 然后更换培养基为软骨培养基， 置于培养箱中培养， 隔几天更换一次培养液， 培养结束后， 利用RNA试剂盒提取纯化RNA， 而后反转录， 最后根据SYBRPremixExTaqTMII试剂盒的说明操 作， 并用荧光定量PCR仪检测ColII、 SOX9以及AGN的表达。 2.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 所述乙醇是浓度为75的乙醇。 3.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 所述低糖DMEM培养液包括含10FBS的低糖 DMEM培养液和含有0.3。
6、mMAsc-2P的低糖DMEM培养液。 4.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 所述多聚甲醛是浓度为4的多聚甲醛。 5.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 步骤(1)中用乙醇消毒次数为2次， PBS缓冲液 洗涤次数为2次； 摇床振荡时间为2h； 培养箱是37、 5CO2饱和湿度的培养箱。 6.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 步骤(4)中置于培养箱中培养的时间为2周， 每3天更换一次培养液。 7.根据权利要求1所述方法， 其特征在于， 所述间充质干细胞来源于选自滑膜中的组 织； 所述标本是人新鲜滑膜标本。 8.根据权利要求1-7任一所述方法制备得到滑膜间充质干细胞的软组织。 9.。
7、一种用于制备软组织的试剂， 其特征在于， 所述试剂包括： 乙醇、 PBS缓冲液、 II型胶 原酶、 低糖DMEM培养液、 抗CD44、 CD90、 CD105以及CD45、 CD34的单克隆抗体、 多聚甲醛。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108949679 A 2 一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及生物医药技术领域， 具体地说， 是一种滑膜间充质干细胞的软组织构 建方法及其应用。 背景技术 0002 关节软骨缺损是临床上较为常见的一类疾病， 主要表现为顽固性疼痛和进行性关 节功能减退， 若不及时根治最终会引起退行性骨关节炎。 随着全国乃至全球老龄。
8、化的进程， 这类疾病无疑会给家庭以及社会带来长期沉重的负担。 关节软骨是关节表面上的一层致密 的结缔组织， 主要由软骨基质及软骨细胞构成， 缺乏血管、 淋巴及神经组织， 因此软骨细胞 代谢活性较低。 此外， 虽然软骨细胞具有一定的再生能力， 但软骨细胞数量很少(仅占软骨 组织的5左右)， 同时其周围高密度的软骨基质直接阻碍了软骨细胞向缺损区的移行， 因 此软骨一旦损伤发生病变后， 其自愈能力极为有限。 目前临床上关于关节软骨损伤的治疗 主要采用手术治疗以及软骨移植术， 但手术治疗只能延缓软骨损伤的进展， 无法达到修复 软骨损伤的目的。 软骨移植术虽然具有一定的治疗效果， 但软骨来源有限， 难以。
9、应用于大面 积的软骨损伤修复。 0003 近年来组织工程技术发展迅速， 为软骨修复提供了一种潜在可行的方法， 已成为 新一代软骨修复技术的研究核心。 间充质干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能 的成体干细胞， 目前已从骨髓、 滑膜、 骨膜和脂肪等多种不同的组织中分离纯化出间充质干 细胞， 是组织工程技术重要的种子细胞。 近年来的研究发现， 滑膜来源的间充质干细胞比其 他来源间充质干细胞有更强的成软骨潜能。 此外， 滑膜位于关节囊的内层衬里， 位置特殊， 易于取材， 并且不会影响到关节承重区。 若种子细胞取材于骨髓或骨膜， 将不可避免地影响 骨与关节的力的承载面。 因此， 滑膜组织中的间充。
10、质干细胞正逐渐成为软骨组织工程的理 想来源。 但目前关于滑膜间充质干细胞在软骨修复中的研究非常有限， 主要包括滑膜间充 质干细胞的关节腔内注射以及滑膜间充质干细胞与三维支架的结合。 细胞液的直接注射操 作简单， 但细胞易流散， 导致修复区的有效干细胞数大幅减少， 并且需要多次注射， 软骨修 复缓慢。 滑膜间充质干细胞与三维支架的结合虽然在目前的临床研究取得了一定的成效， 但这些支架材料的长期安全性尚属未知。 基于上述两种方法的不足， 一种脱离支架同时又 可保证细胞形成合力避免其流散于关节腔的软组织培养技术将会在软骨损伤修复中具有 更大的优势。 0004 中国专利申请： CN105392489A。
11、公开了一种软骨损伤治疗剂及其制造方法， 软骨损 伤治疗剂的制造方法包含以下工序:在含有FGF、 PDGF、 TGF- 、 HGF、 EGF、 至少一种磷脂和至 少一种脂肪酸的无血清培养基A中， 使间充质干细胞增殖的增殖工序； 将上述增殖工序后的 间充质干细胞、 等张保存剂和细胞保护剂混合的混合工序。 但是关于本发明一种用于修复 软骨损伤的试剂及其应用目前还未见报道。 发明内容 说明书 1/7 页 3 CN 108949679 A 3 0005 本发明的第一个目的是针对现有技术的不足， 提供一种滑膜间充质干细胞的软组 织构建方法。 0006 本发明的第二个的目的是针对现有技术的不足， 提供一种滑。
12、膜间充质干细胞的软 组织。 0007 本发明的第三个目的是针对现有技术的不足， 提供一种用于修复软骨损伤的试 剂。 0008 为实现上述第一个目的， 本发明采取的技术方案是： 0009 一种滑膜间充质干细胞的软组织构建方法， 所述构建方法包括以下步骤： 0010 (1)间充质干细胞的分离与培养： 将标本用乙醇表面消毒， PBS缓冲液洗涤， 置于培 养皿中， 用消过毒的手术剪刀将组织剪为小碎片， 置于离心管中， 加适量PBS缓冲液， 离心， 弃去上清， 加入适量II型胶原酶， 摇床振荡(200rpm， 37)后， 离心弃去胶原酶， 最后在组织 碎片中加入适量含10FBS的低糖DMEM培养液， 而。
13、后转移到培养皿中， 置于培养箱中培养， 两天后将组织块转移置新的培养皿中， 继续培养两天而后弃去组织块， 直到间充质干细胞 长满培养皿； 0011 (2)间充质干细胞的鉴定： 将细胞消化、 重悬、 离心、 用PBS缓冲液洗涤， 调整细胞密 度为2106/ml左右， 取100 l待测细胞悬液， 加入抗CD44、 CD90、 CD105以及CD45、 CD34的单 克隆抗体， 避光常温反应30min， 而后离心、 弃上清， 收集细胞， PBS缓冲液冲洗， 多聚甲醛固 定， 最后上流式细胞仪检测标记物的表达情况； 0012 (3)软组织的培养与分离： 将第三代间充质干细胞消化、 计数， 接种于12孔。
14、板中， 1.2*106/孔， 用含有0.3mMAsc-2P的低糖DMEM培养液培养， 2-3天更换一次培养液， 10-14天 后弃去培养液， 而后用枪头沿着培养皿的边缘轻轻吹打至细胞层逐渐收缩形成一团软组 织， 将软组织置于滤纸上， 除去培养基， 用镊子轻轻夹起， 检测软组织的弹性， 将软组织置于 多聚甲醛固定， 石蜡包埋， 切片， 脱蜡， 进行HE染色； 0013 (4)软骨分化能力检测： 将软组织置于12孔板内， 使用低糖DMEM培养1天使其充分 贴壁， 然后更换培养基为软骨培养基， 置于培养箱中培养， 隔几天更换一次培养液， 培养结 束后， 利用RNA试剂盒提取纯化RNA， 而后反转录，。
15、 最后根据SYBRPremixExTaqTMII试剂盒的 说明操作， 并用荧光定量PCR仪检测ColII、 SOX9以及AGN的表达。 0014 作为本发明的一个优选实施方案， 所述乙醇是浓度为75的乙醇。 0015 作为本发明的一个优选实施方案， 所述低糖DMEM培养液包括含10FBS的低糖 DMEM培养液和含有0.3mMAsc-2P的低糖DMEM培养液。 0016 作为本发明的一个优选实施方案， 所述多聚甲醛是浓度为4的多聚甲醛。 0017 作为本发明的一个优选实施方案， 步骤(1)中用乙醇消毒次数为2次， PBS缓冲液洗 涤次数为2次； 摇床振荡时间为2h； 培养箱是37、 5CO2饱和。
16、湿度的培养箱。 0018 作为本发明的一个优选实施方案， 步骤(4)中置于培养箱中培养的时间为2周， 每3 天更换一次培养液。 0019 作为本发明的一个优选实施方案， 所述间充质干细胞来源于选自滑膜中的组织； 所述标本是人新鲜滑膜标本。 0020 为实现上述第二个目的， 本发明采取的技术方案是： 0021 如上任一所述方法制备得到滑膜间充质干细胞的软组织。 说明书 2/7 页 4 CN 108949679 A 4 0022 为实现上述第三个目的， 本发明采取的技术方案是： 0023 一种用于制备软骨组织的试剂， 所述试剂包括： 乙醇、 PBS缓冲液、 II型胶原酶、 低 糖DMEM培养液、 。
17、抗CD44、 CD90、 CD105以及CD45、 CD34的单克隆抗体、 多聚甲醛。 0024 本发明优点在于： 0025 1、 本发明所构建的软组织具有良好的软骨分化能力， 可为软骨修复提供新的选 择。 0026 2、 本发明间充质干细胞来源于选自滑膜中的组织， 其间充质干细胞比其他来源间 充质干细胞有更强的成软骨潜能； 此外， 滑膜位于关节囊的内层衬里， 位置特殊， 易于取材， 并且不会影响到关节承重区。 0027 3、 本发明是一种脱离支架同时又可保证细胞形成合力避免其流散于关节腔的软 组织培养的方法， 在软骨修复中具有更大的优势， 具有很好的应用前景。 附图说明 0028 附图1是滑。
18、膜间充质干细胞的形态。 图1A显示， 培养初期大量细胞从组织碎片中爬 出来， 细胞主要为长纤状， 个别细胞为类圆形。 图1B显示， 培养5天时， 细胞融合达到了80 左右。 0029 附图2是进行滑膜间充质干细胞的鉴定， 细胞表面抗原的表达情况。 0030 附图3是进行软组织的培养与分离时， 将增殖至一定数量的第三代滑膜间充质干 细胞消化、 计数、 接种、 培养、 吹打后的图片。 图3A是将增殖至一定数量的第三代滑膜间充质 干细胞消化、 计数、 接种、 培养后的图片； 图3B是将增殖至一定数量的第三代滑膜间充质干 细胞消化、 计数、 接种、 培养后， 用枪头沿着培养皿的边缘轻轻吹打， 细胞层直。
19、接从培养皿底 部脱离的图片； 图3C是将增殖至一定数量的第三代滑膜间充质干细胞消化、 计数、 接种、 培 养后， 用枪头沿着培养皿的边缘轻轻吹打， 细胞层直接从培养皿底部脱离， 继续轻柔吹打， 细胞层逐渐收缩形成一团软组织的图片。 0031 附图4是制备得到的软组织图片， 其弹性显示良好。 0032 附图5是软组织的HE染色图。 0033 附图6是诱导组中软骨分化相关基因的RNA水平。 具体实施方式 0034 下面结合具体实施方式， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发 明而不用于限制本发明的范围。 此外应理解， 在阅读了本发明记载的内容之后， 本领域技术 人员可以对本发明作。
20、各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限 定的范围。 0035 实施例1软组织的制备方法(一) 0036 软组织的制备方法如下： 0037 (1)滑膜间充质干细胞的分离与培养： 将人新鲜滑膜标本用75乙醇表面消毒2 次， PBS洗2次， 置于培养皿中， 用消过毒的手术剪刀将组织剪为小碎片， 置于50ml离心管中， 加适量PBS， 离心， 弃去上清， 加入适量II型胶原酶， 摇床振荡(200rpm， 37)2h后， 离心弃去 胶原酶， 最后在组织碎片中加入适量含10FBS的低糖DMEM培养液， 而后转移到培养皿中， 说明书 3/7 页 5 CN 108949679 A 5 。
21、置于37、 5CO2饱和湿度的培养箱中培养， 两天后将组织块转移置新的培养皿中， 继续培 养两天而后弃去组织块， 直到间充质干细胞长满培养皿。 0038 (2)滑膜间充质干细胞的鉴定： 将细胞消化重悬、 离心， PBS缓冲液洗2遍， 调整细胞 密度为2106/ml左右。 取100 l待测细胞悬液， 加入抗CD44、 CD90、 CD105以及CD45、 CD34的 单克隆抗体， 避光常温反应30min， 而后离心、 弃上清， 收集细胞， PBS冲洗2遍， 4多聚甲醛 固定。 0039 (3)软组织的培养与分离： 将增殖至一定数量的第三代滑膜间充质干细胞消化、 计 数， 接种于12孔板中， 1.。
22、2*106/孔， 用含有0.3mMAsc-2P的低糖DMEM培养液培养， 2-3天更换 一次培养液， 10-14天后弃去培养液， 而后用枪头沿着培养皿的边缘轻轻吹打至细胞层可逐 渐收缩形成一团软组织， 将软组织置于滤纸上， 除去培养基。 用镊子轻轻夹起， 检测软组织 的弹性， 将软组织置于4多聚甲醛固定， 石蜡包埋， 切片， 脱蜡， 进行HE染色。 0040 (4)软组织分化能力检测准备工序 0041 将软组织置于12孔板内， 使用低糖DMEM培养1天使其充分贴壁， 之后更换培养基为 软骨培养基， 置于37、 5CO2饱和湿度的培养箱中培养2周， 每3天更换一次培养液， 待用。 0042 实施。
23、例2软组织的制备方法(二) 0043 软组织的制备方法如下： 0044 (1)滑膜间充质干细胞的分离与培养： 将人新鲜滑膜标本用70乙醇表面消毒1 次， PBS洗1次， 置于培养皿中， 用消过毒的手术剪刀将组织剪为小碎片， 置于50ml离心管中， 加适量PBS， 离心， 弃去上清， 加入适量II型胶原酶， 摇床振荡(200rpm， 37)1h后， 离心弃去 胶原酶， 最后在组织碎片中加入适量含5FBS的低糖DMEM培养液， 而后转移到培养皿中， 置 于32、 3CO2饱和湿度的培养箱中培养， 两天后将组织块转移置新的培养皿中， 继续培养 两天而后弃去组织块， 直到间充质干细胞长满培养皿， 培养。
24、5天时， 检测细胞融合情况。 0045 (2)滑膜间充质干细胞的鉴定： 将细胞消化重悬、 离心， PBS缓冲液洗2遍， 调整细胞 密度为2106/ml左右。 取100 l待测细胞悬液， 加入抗CD44、 CD90、 CD105以及CD45、 CD34的 单克隆抗体， 避光常温反应30min， 而后离心、 弃上清， 收集细胞， PBS冲洗2遍， 4多聚甲醛 固定。 0046 (3)软组织的培养与分离： 将增殖至一定数量的第三代滑膜间充质干细胞消化、 计 数， 接种于12孔板中， 1.2*106/孔， 用含有0.3mMAsc-2P的低糖DMEM培养液培养， 2-3天更换 一次培养液， 10-14天。
25、后弃去培养液， 而后用枪头沿着培养皿的边缘轻轻吹打至细胞层可逐 渐收缩形成一团软组织， 将软组织置于滤纸上， 除去培养基。 用镊子轻轻夹起， 检测软组织 的弹性， 将软组织置于4多聚甲醛固定， 石蜡包埋， 切片， 脱蜡， 进行HE染色。 0047 (4)软组织分化能力检测准备工序 0048 将软组织置于12孔板内， 使用低糖DMEM培养1天使其充分贴壁， 之后更换培养基为 软骨培养基， 置于37、 5CO2饱和湿度的培养箱中培养2周， 每3天更换一次培养液， 待用。 0049 实施例3软组织的制备方法(三) 0050 软组织的制备方法如下： 0051 (1)滑膜间充质干细胞的分离与培养： 将人。
26、新鲜滑膜标本用80乙醇表面消毒3 次， PBS洗3次， 置于培养皿中， 用消过毒的手术剪刀将组织剪为小碎片， 置于50ml离心管中， 加适量PBS， 离心， 弃去上清， 加入适量II型胶原酶， 摇床振荡(200rpm， 37)3h后， 离心弃去 说明书 4/7 页 6 CN 108949679 A 6 胶原酶， 最后在组织碎片中加入适量含15FBS的低糖DMEM培养液， 而后转移到培养皿中， 置于42、 7CO2饱和湿度的培养箱中培养， 两天后将组织块转移置新的培养皿中， 继续培 养两天而后弃去组织块， 直到间充质干细胞长满培养皿， 培养5天时， 检测细胞融合情况。 0052 (2)滑膜间充质。
27、干细胞的鉴定 0053 将细胞消化重悬、 离心， PBS缓冲液洗2遍， 调整细胞密度为2106/ml左右。 取100 l待测细胞悬液， 加入抗CD44、 CD90、 CD105以及CD45、 CD34的单克隆抗体， 避光常温反应 30min， 而后离心、 弃上清， 收集细胞， PBS冲洗2遍， 4多聚甲醛固定。 0054 (3)软组织的培养与分离： 将增殖至一定数量的第三代滑膜间充质干细胞消化、 计 数， 接种于12孔板中， 1.2*106/孔， 用含有0.3mMAsc-2P的低糖DMEM培养液培养， 2-3天更换 一次培养液， 10-14天后弃去培养液， 而后用枪头沿着培养皿的边缘轻轻吹打至。
28、细胞层可逐 渐收缩形成一团软组织， 将软组织置于滤纸上， 除去培养基。 用镊子轻轻夹起， 检测软组织 的弹性， 将软组织置于4多聚甲醛固定， 石蜡包埋， 切片， 脱蜡， 进行HE染色。 0055 (4)软组织分化能力检测准备工序 0056 将软组织置于12孔板内， 使用低糖DMEM培养1天使其充分贴壁， 之后更换培养基为 软骨培养基， 置于37、 5CO2饱和湿度的培养箱中培养2周， 每3天更换一次培养液， 待用。 0057 实施例4用于修复软骨损伤的试剂的效果评价 0058 一、 实验方法 0059 分别将实施例1-3所制备得到的软组织进行检测， 检测方法如下： 0060 (1)滑膜间充质干。
29、细胞的鉴定 0061 将细胞消化重悬、 离心， PBS洗2遍， 调整细胞密度为2106/ml左右， 取100 l待测 细胞悬液， 加入抗CD44、 CD90、 CD105以及CD45、 CD34的单克隆抗体， 避光常温反应30min， 而 后离心、 弃上清， 收集细胞， PBS冲洗2遍， 4多聚甲醛固定， 最后上流式细胞仪检测标记物 的表达情况。 0062 (2)软组织的培养与分离 0063 将增殖至一定数量的第三代滑膜间充质干细胞消化、 计数， 接种于12孔板中， 1.2* 106/孔， 用含有0.3mMAsc-2P的低糖DMEM培养液培养， 2-3天更换一次培养液， 10-14天后弃 去培。
30、养液， 而后用枪头沿着培养皿的边缘轻轻吹打至细胞层逐渐收缩形成一团软组织。 将 软组织置于滤纸上， 除去培养基， 用镊子轻轻夹起， 检测软组织的弹性， 将软组织置于4多 聚甲醛固定， 石蜡包埋， 切片， 脱蜡， 进行HE染色。 0064 (3)软骨分化能力检测 0065 将软组织置于12孔板内， 使用低糖DMEM培养1天使其充分贴壁， 之后更换培养基为 软骨培养基， 置于37、 5CO2饱和湿度的培养箱中培养2周， 每3天更换一次培养液。 培养 结束后， 利用RNA试剂盒提取纯化RNA， 而后反转录， 最后根据SYBRPremixExTaqTMII试剂盒的 说明操作， 并用荧光定量PCR仪检测。
31、ColII、 SOX9以及AGN的表达。 0066 二、 实验结果 0067 (1)滑膜间充质干细胞的融合检测结果： 通过实施例1制备方法， 培养初期大量细 胞从组织碎片中爬出来， 细胞主要为长纤状， 个别细胞为类圆形， 培养5天时， 细胞融合达到 了80左右、 较实施例2、 3， 实施例1的制备方法得到的细胞更多且融合度更高。 0068 (2)滑膜间充质干细胞的鉴定结果： 实施例1CD44、 CD90、 CD105表达率高于95， 说明书 5/7 页 7 CN 108949679 A 7 CD45与CD34表达率低于2。 与实施例2、 3比较， 实施例1CD44、 CD90、 CD105表达。
32、率更高。 0069 (3)软组织的培养与分离的结果： 实施例1制备得到的软组织弹性较实施例2、 3更 好； 实施例1的软组织内部的细胞状态良好， 无死细胞， 而实施例2、 3中均出现了死细胞。 0070 (4)软骨分化能力检测结果： 实施例1软骨培养基诱导2周后， 软组织内的软骨分化 相关基因如ColII、 SOX9以及AGN均大幅增加， 而实施例2、 3中软组织内的软骨分化相关基因 如ColII、 SOX9以及AGN增加幅度均没有实施例1中大。 0071 实施例5用于修复软骨损伤的试剂的效果评价 0072 一、 实验材料及分组 0073 1、 实验材料： 间充质干细胞来源于选自滑膜中的组织；。
33、 标本是人新鲜滑膜标本。 0074 2、 实验分组： 通过本发明实验方法制备得到6份软组织， 采用随机数字表法分为对 照组与实验组， 每组3份软组织。 0075 二、 实验方法 0076 按照以下实验方法制备6份软组织。 0077 1、 滑膜间充质干细胞的分离与培养 0078 将人新鲜滑膜标本用75乙醇表面消毒2次， PBS缓冲液洗涤2次， 置于培养皿中， 用消过毒的手术剪刀将组织剪为小碎片， 置于50ml离心管中， 加适量PBS缓冲液， 离心， 弃去 上清， 加入适量II型胶原酶， 摇床振荡(200rpm， 37)2h后， 离心弃去胶原酶， 最后在组织碎 片中加入适量含10FBS的低糖DME。
34、M培养液， 而后转移到培养皿中， 置于37、 5CO2饱和 湿度的培养箱中培养。 两天后将组织块转移置新的培养皿中， 继续培养两天而后弃去组织 块， 直到间充质干细胞长满培养皿。 0079 2、 滑膜间充质干细胞的鉴定 0080 将细胞消化重悬、 离心， PBS缓冲液洗2遍， 调整细胞密度为2106/ml左右。 取100 l待测细胞悬液， 加入抗CD44、 CD90、 CD105以及CD45、 CD34的单克隆抗体， 避光常温反应 30min， 而后离心、 弃上清， 收集细胞， PBS冲洗2遍， 4多聚甲醛固定， 最后上流式细胞仪检 测标记物的表达情况。 0081 3、 软组织的培养与分离 0。
35、082 将增殖至一定数量的第三代滑膜间充质干细胞消化、 计数， 接种于12孔板中， 1.2* 106/孔， 用含有0.3mMAsc-2P的低糖DMEM培养液培养， 2-3天更换一次培养液， 10-14天后弃 去培养液， 而后用枪头沿着培养皿的边缘轻轻吹打至细胞层逐渐收缩形成一团软组织， 将 软组织置于滤纸上， 除去培养基， 用镊子轻轻夹起， 检测软组织的弹性。 将软组织置于4多 聚甲醛固定， 石蜡包埋， 切片， 脱蜡， 进行HE染色。 0083 4、 软骨分化能力检测 0084 将软组织置于12孔板内， 使用低糖DMEM培养1天使其充分贴壁， 实验组更换培养基 为软骨培养基， 对照组不更换， 。
36、置于37、 5CO2饱和湿度的培养箱中培养2周， 每3天更换 一次培养液。 培养结束后， 利用RNA试剂盒提取纯化RNA ， 而后反转录 ， 最后根据 SYBRPremixExTaqTMII试剂盒的说明操作， 并用荧光定量PCR仪检测ColII、 SOX9以及AGN的表 达。 0085 三、 实验结果 0086 (1)培养初期细胞生长结果： 如图1A所示， 培养初期大量细胞从组织碎片中爬出 说明书 6/7 页 8 CN 108949679 A 8 来， 细胞主要为长纤状， 个别细胞为类圆形。 如图1B所示， 培养5天时， 细胞融合达到了80 左右。 0087 (2)滑膜间充质干细胞的鉴定结果：。
37、 如图2所示， CD44、 CD90、 CD105表达率高于 95， CD45与CD34表达率低于2， 该结果与间充质干细胞表面抗原表达相符， 说明分离所 得细胞为滑膜间充质干细胞。 0088 (3)软组织弹性及HE染色结果： 将增殖至一定数量的第三代滑膜间充质干细胞消 化、 计数、 接种、 培养后如图3A所示， 如图3B所示， 将增殖至一定数量的第三代滑膜间充质干 细胞消化、 计数、 接种、 培养后， 用枪头沿着培养皿的边缘轻轻吹打， 细胞层直接从培养皿底 部脱离； 如图3C所示， 将增殖至一定数量的第三代滑膜间充质干细胞消化、 计数、 接种、 培养 后， 用枪头沿着培养皿的边缘轻轻吹打， 。
38、细胞层直接从培养皿底部脱离， 继续轻柔吹打， 细 胞层逐渐收缩形成一团软组织； 如图4所示， 用镊子轻轻夹起软组织时， 软组织可被拉长， 随 后又收缩至原位置， 说明软组织具有一定的弹性； 如图5所示， 软组织内部的细胞状态良好， 无死细胞。 0089 (4)软骨分化能力检测结果： 如图6所示， 软骨培养基诱导2周后， 软组织内的软骨 分化相关基因如ColII、 SOX9以及AGN均大幅增加， 表明我们所构建的软组织具有良好的软 骨分化能力， 有望为软骨修复提供新的选择。 0090 四、 实验结论 0091 由以上实施例结果表明： 本发明制备方法得到的软组织具有良好的软骨分化能 力， 本发明制。
39、备的软组织具有脱离支架同时又可保证细胞形成合力， 避免其流散于关节腔 的优点， 从而达到软骨修复的目的。 0092 本发明所构建的软组织具有良好的软骨分化能力， 可为软骨修复提供新的选择； 本发明间充质干细胞来源于选自滑膜中的组织， 其间充质干细胞比其他来源间充质干细胞 有更强的成软骨潜能； 此外， 滑膜位于关节囊的内层衬里， 位置特殊， 易于取材， 并且不会影 响到关节承重区。 0093 本发明是一种脱离支架同时又可保证细胞形成合力避免其流散于关节腔的软组 织培养的方法， 在软骨修复中具有更大的优势， 具有很好的应用前景。 0094 以上所述仅是本发明的优选实施方式， 应当指出， 对于本技术领域的普通技术人 员， 在不脱离本发明原理的前提下， 还可以做出若干改进和补充， 这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。 说明书 7/7 页 9 CN 108949679 A 9 图1 图2 说明书附图 1/3 页 10 CN 108949679 A 10 图3 图4 图5 说明书附图 2/3 页 11 CN 108949679 A 11 图6 说明书附图 3/3 页 12 CN 108949679 A 12 。