肠道病毒EV71检测特异性引物和探针 【技术领域】
本发明是一种用于检测肠道病毒EV71核苷酸序列的特异性引物和探针。
背景技术
人肠道病毒71型(EV71)属于肠道病毒(Enteroviruses，EVs)，微小核糖核酸病毒科，其核酸为单股正旋RNA，其衣壳蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4四种结构组成。EV71感染常引起患者手足口病，并可造成严重的神经系统疾病，同时，有关于其引起神经性肺水肿的报道。自1969年首自从加利福尼亚一患者粪便中分离出后，如今，EV71已蔓延至全世界，严重威胁人类，尤其是婴幼儿的健康与生命，并引起了多次爆发与流行，导致社会恐慌。由于目前尚无有效的针对EV71的疫苗，因此，及时诊断疾病、处理疫情十分重要，而这就需要一种既能准确又快速的实验室检验方法来确定病原，这也是临床诊断与流行病学研究的一个必不可少的环节。
肠道病毒EV71的检测技术包括有病毒分离、血清免疫学、以PCR为基础的分子生物学和免疫组化等方法。病毒分离方法繁琐，周期长，而且，有可能会得不到合适的临床标本或无法分离到病毒株。使用血清型特异性的中和抗血清进行的中和实验可用于进行肠道病毒的鉴定，试验结果可靠性不是很高，并且由于肠道病毒包括若干个血清型，通常要使用组合抗血清进行鉴定。PCR检测法简便、快速，近年来，在临床检测中备受青睐，但是，普通PCR检测易产生污染。实时荧光定量PCR方法因其特异、灵敏且准确等优点，在人类传染病和病原定量上的应用日益广泛。在实时荧光定量PCR检测方法中，引物和探针的设计尤为重要，决定了检测结果的有效性。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种用于检测肠道病毒EV71的特异性引物和探针。
基于上述目的，本发明采用以下技术方案。
用于检测肠道病毒EV71的特异性引物和探针序列包括：上游引物VP1F序列为5’CAYGTC AGR GCD TGG RTH CC 3’，下游引物VP1R序列为5’KYR TAR TTY GGR TTG GYYTTR AAC A 3’和探针VP1P序列为5’FAM CGC CCG ATG CGY AAC CAAAA TAMRA 3’。
本发明的具体原理是利用一对靶核酸序列的特异性引物和探针，采用一步法实时荧光定量RT‑PCR试剂盒，通过PCR技术实现靶核酸序列片断的扩增。所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团(R)和荧光淬灭基团(Q)的寡核苷酸。在探针完整时，报告基团发出的荧光被淬灭基团吸收，在PCR扩增过程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性将特异结合在靶核苷酸片断上的荧光探针酶切降解，使报告基团的荧光信号可以被检测，荧光信号量的变化与扩增产物量成正比，从而可以通过荧光强弱来判断待测样本中靶核苷酸序列的存在。
【附图说明】
利用引物对VP1F/VP1R和探针VPIP检测肠道病毒EV71阳性样本的荧光PCR扩增图。见附图1。
【具体实施方式】
1.引物和探针的设计：通过分别对所有已知的肠道病毒EV71型VP1基因序列进行比较分析，选择高度保守的区段，设计多对引物和探针，引物长度一般为20碱基左右。最优引物探针序列组合如下：
上游引物VP1F：5’CAY GTC AGR GCD TGG RTH CC 3’
下游引物VP1R：5’KYR TAR TTY GGR TTG GYY TTR AACA 3’
探针VP1P：5’FAM CGC CCG ATG CGY AAC CAAAA TAMRA 3’。
2.反应体系的优化：利用灭活的肠道病毒EV71作为待检样品，用Trizol试剂抽提病毒基因组RNA，分装后贮存于‑80℃。
2.1引物浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将EV71引物浓度分别从0.1μmol/l至1.6μmol/l作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳引物浓度是0.2μmol/l。
2.2探针浓度的优化在反应体系中其它条件相同的情况下，将EV71探针浓度分别从0.1μmol/l至0.5μmol/l作倍比连续稀释，通过对试验结果的分析比较，确定最佳探针浓度是0.16μmol/l。
利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的EV71实时荧光RT‑PCR反应体系为25μl。按照一步法荧光定量RT‑PCR试剂盒说明进行反应液的配置。
3.仪器检测通道的选择
选择的荧光检测通道应与探针所标记的报告荧光基团一致，具体按照仪器使用说明书进行设置。
4.PCR反应条件如下
42℃ 30min进行逆转录反应；95℃ 3min，1个循环；94℃ 10s，55℃40s，40个循环，在55℃ 40s阶段收集荧光。
5.检测结果分析
如果待检样本中含有EV71，则显示阳性扩增曲线，其检测灵敏度可以达到1000拷贝/ml，如果待检样本中没有EV71，则显示阴性扩增曲线，即无扩增信号，提示上述引物对和探针具有良好的特异性和灵敏度。
本发明的优点在于：
(1)本发明提供的引物和探针的检测灵敏度可以达到1000拷贝/ml，说明其灵敏度良好。
(2)本发明提供的引物和探针对不含EV71的样本没有检测信号，说明其特异性强。
(3)由于本发明是针对EV71 VP1基因序列进行比对分析，选取高度保守部位进行引物和探针的设计，避免了假阴性结果的出现。