RDX基因在临床用药中的应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711469118.9 (22)申请日 2017.12.29 (71)申请人 北京泱深生物信息技术有限公司 地址 100080 北京市海淀区善缘街1号立方 庭大厦3103室 (72)发明人 肖枫孙耀兰常鹏 (51)Int.Cl. C12Q 1/6883(2018.01) G01N 33/68(2006.01) A61K 45/00(2006.01) A61K 31/7105(2006.01) A61P 19/10(2006.01) (54)发明名称 RDX基因在临床用药中的。

2、应用 (57)摘要 本发明涉及RDX基因在临床用药中的应用， 更具体的涉及RDX基因在绝经后骨质疏松临床用 药及检测绝经后骨质疏松中的新应用。 发明人采 用高通量测序技术研究六味地黄丸对骨质疏松 的分子作用机理， 从基因角度阐述六味地黄丸作 用机制， 挑选出候选基因RDX并验证。 本发明为绝 经后骨质疏松及临床用药提供分子理论基础， 具 有很好的临床应用价值。 权利要求书1页 说明书9页 序列表3页 附图2页 CN 108179181 A 2018.06.19 CN 108179181 A 1.检测RDX基因和/或RDX蛋白的试剂在制备绝经后骨质疏松临床用药基因检测制剂中 的应用。 2.根据权。

3、利要求1所述的应用， 其特征在于， RDX基因和/或RDX蛋白高表达的样本组适 用六味地黄丸。 3.检测RDX基因和/或RDX蛋白的试剂在制备绝经后骨质疏松诊断制剂中的应用。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 绝经后骨质疏松诊断制剂检测外周血中 RDX基因和/或RDX蛋白的表达情况。 5.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 绝经后骨质疏松的诊断制剂采用下列方法 中的一种或者几种检测RDX基因的表达： 荧光定量PCR方法、 基因芯片方法、 高通量测序方 法， 优选的， 荧光定量PCR法采用一对特异性扩增RDX基因的引物； 基因芯片包括与RDX基因 的核酸序列杂交的探针。 6.R。

4、DX基因和/或其蛋白抑制剂在制备治疗绝经后骨质疏松药物中的应用。 7.根据权利要求6所述的应用， 其特征在于， 治疗绝经后骨质疏松药物采用下述方法中 的一种和/或几种抑制RDX基因和/或RDX蛋白表达： 激活RDX基因的抑制基因、 激活RDX基因 的抑制基因表达的蛋白、 采用RNA干扰技术抑制RDX基因表达、 激活促进RDX基因mRNA降解的 microRNA、 导入促进RDX基因编码蛋白降解的分子、 抑制促进RDX基因表达的因子及蛋白的 表达。 8.根据权利要求7所述的应用， 其特征在于， 采用RNA干扰技术抑制RDX基因表达的 siRNA靶点选自下列序列中的一种和/或几种： SEQ ID 。

5、NO.5、 SEQ ID NO.8、 SEQ ID NO.11。 优选siRNA靶点序列为SEQ ID NO.5。 9.一种检测绝经后骨质疏松的荧光定量PCR试剂盒， 其特征在于， 所述试剂盒检测基因 RDX， 采用特异的上游引物和下游引物， 上游引物序列为SEQ ID NO.1， 下游引物序列为SEQ ID NO.2。 10.一种治疗绝经后骨质疏松药物， 该药物含有抑制RDX基因的表达的siRNA， 优选的， siRNA序列为SEQ ID NO.6、 SEQ ID NO.7。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108179181 A 2 RDX基因在临床用药中的应用 技术领域 0001 本发。

6、明涉及生物医药领域， 具体涉及RDX基因在临床用药中的应用， 更具体的涉及 RDX基因在绝经后骨质疏松临床用药及检测绝经后骨质疏松中的新应用。 背景技术 0002 Radixin(RDX)为细胞膜-细胞骨架连接蛋白， 是连接细胞膜和细胞骨架之间的ERM (ezrin/radixin/moesin)家族成员之一， 表达于肝细胞、 肾脏细胞等， 参与细胞形态调节、 信号转导、 细胞运动等多种生命活动。 RDX主要由3个结构域构成： 与细胞膜连接的高度保守 的球状氨基末端， 中间区域为 螺旋区， 带正电荷的羧基末端， 该区域含有苏氨酸残基， 能够 被磷酸化和去磷酸， 是RDX的主要调控位点。 现有研。

7、究表明RDX在维持肝细胞的极性方面发 挥重要作用(Re-defining ERM function in lymphocyte activation and migration， Immunol Rev， 2013， 256(1):63-79)。 0003 骨质疏松症(osteoporosis)发生是遗传和环境因素共同作用的结果， 是一个复杂 的多因子疾病。 近年来， 随着精准医疗的深入研究， 已经发现部分相关分子标志物， 我们之 前的研究也发现一些骨质疏松相关的基因， 如IFT52基因(CN2015106280814)、 EPS8L3基因 (CN2015106280424)、 CERS2基因。

8、(CN2015106293481)、 MTUS1基因(CN 2015106280246)等。 绝 经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis， PMOP)是骨质疏松的一种， 与衰老有关， 主要发生在绝经后妇女， 由于雌激素缺乏导致骨量减少及骨组织结构变化， 使骨脆性增多 易于骨折以及由骨折引起的疼痛、 骨骼变形、 出现合并症， 乃至死亡等问题， 严重地影响老 年人的身体健康及生活质量， 甚至缩短寿命增加国家及家庭财力与人力负担。 0004 近年来中医研究已经证实骨质疏松的发病与肾虚密切相关， 多种补肾方剂， 如六 味地黄丸， 对绝经后骨质疏松具有明显的疗效， 且未发。

9、现明显副作用， 已逐渐受到重视。 发 明人采用高通量测序技术研究六味地黄丸对骨质疏松的分子作用机理， 对绝经后骨质疏松 患者服用六味地黄丸前、 后外周血样本和健康人对照外周血样本进行测序分析， 从基因角 度阐述其作用机制， 挑选出候选基因RDX。 本发明为绝经后骨质疏松及临床用药提供分子理 论基础， 具有很好的临床应用价值。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供检测RDX基因和/或RDX蛋白的试剂在制备绝经后骨质疏松 临床用药基因检测制剂中的应用。 0006 为实现上述目的， 本发明首先通过高通量测序结合生物信息学方法筛选到候选基 因RDX， 继而通过分子生物学方法验证了骨质疏松患者服用六。

10、味地黄丸后RDX基因表达量明 显下降， 显示该基因不仅和绝经后骨质疏松相关， 还是六味地黄丸的作用靶点， 可用于制备 绝经后骨质疏松诊断制剂和治疗靶点， 具有重要的临床应用价值。 0007 进一步， RDX基因和/或RDX蛋白高表达的样本组适用六味地黄丸。 0008 进一步， 检测制剂采用下列方法中的一种或者几种检测RDX基因的表达： 荧光定量 说明书 1/9 页 3 CN 108179181 A 3 PCR方法、 基因芯片方法、 高通量测序方法。 0009 本发明的目的在于提供检测RDX基因和/或RDX蛋白的试剂在制备绝经后骨质疏松 诊断制剂中的应用。 0010 进一步， RDX基因和/或R。

11、DX蛋白在绝经后骨质疏松样本中高表达。 0011 进一步， 绝经后骨质疏松诊断制剂检测外周血中RDX基因和/或RDX蛋白的表达情 况。 0012 进一步， 所述绝经后骨质疏松的诊断制剂采用下列方法中的一种或者几种检测 RDX基因的表达： 荧光定量PCR方法、 基因芯片方法、 高通量测序方法。 0013 荧光定量PCR法是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针， 对PCR产物进行标记 跟踪， 实时在线监控反应过程， 结合相应的软件可以对产物进行分析， 计算待测样品模板的 初始浓度。 荧光定量PCR的出现， 极大地简化了定量检测的过程， 而且真正实现了绝对定量。 多种检测系统的出现， 使实验的选择性。

12、更强。 自动化操作提高了工作效率， 反应快速、 重复 性好、 灵敏度高、 特异性强、 结果清晰。 0014 基因芯片又称为DNA微阵列(DNAmicroarray)， 可分为三种主要类型： 1)固定在聚 合物基片(尼龙膜， 硝酸纤维膜等)表面上的核酸探针或cDNA片段， 通常用同位素标记的靶 基因与其杂交， 通过放射显影技术进行检测。 2)用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列， 通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。 3)在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针 阵列， 与荧光标记的靶基因杂交进行检测。 基因芯片作为一种先进的、 大规模、 高通量检测 技术， 应用于疾病的诊断， 其优点有以下几。

13、个方面： 一是高度的灵敏性和准确性； 二是快速 简便； 三是可同时检测多种疾病。 0015 高通量测序(High-throughput sequencing)又称下一代测序技术(next generation sequencing)是对传统测序一次革命性的改变， 一次对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测定， 极大提高了测序效率。 这类大规模测序技术极大的提高了多个物种遗 传信息的解读速度， 为获取所有mRNA的序列信息， 解密mRNA图谱提供了保证。 同时高通量测 序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能， 所以又被称为深度测 序。 高通量测序平台的代表是罗氏公司(Roc。

14、he)的454测序仪(Roch GSFLX sequencer)， Illumina公司的Solexa基因组分析仪(Illumina Genome Analyzer)和ABI的SOLiD测序仪 (ABI SOLiD sequencer)。 0016 所述用于荧光定量PCR方法检测绝经后骨质疏松中RDX基因的产品含有一对特异 性扩增RDX基因的引物； 所述的基因芯片包括与RDX基因的核酸序列杂交的探针。 优选的， 一 对特异性扩增RDX基因的引物， 上游引物序列为SEQ ID NO.1， 下游引物序列为SEQ ID NO.2。 0017 进一步， 绝经后骨质疏松的诊断制剂还包括用免疫方法检测RD。

15、X蛋白的表达。 优选 所述免疫方法检测绝经后骨质疏松中RDX蛋白表达为western blot和/或ELISA和/胶体金 法。 0018 酶联免疫吸附实验(ELISA)即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面， 使酶标 记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。 该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体 等， 具有快速、 灵敏、 简便、 载体易于标准化等优点。 ELISA检测试剂盒根据检测目的和操作 步骤可分为间接法、 双抗夹心法、 竞争法、 双位点一步法、 捕获法测IgM抗体、 应用亲和素和 说明书 2/9 页 4 CN 108179181 A 4 生物素的ELISA。 ELISA检测试剂盒中生色底。

16、物可选择辣根过氧化物酶(HRP)或者碱性磷酸 酶(AP)。 0019 常用的免疫胶体金检测技术： (1)免疫胶体金光镜染色法细胞悬液涂片或组织切 片， 可用胶体金标记的抗体进行染色， 也可在胶体金标记的基础上， 以银显影液增强标记， 使被还原的银原子沉积于已标记的金颗粒表面， 可明显增强胶体金标记的敏感性。 (2)免疫 胶体金电镜染色法可用胶体金标记的抗体或抗抗体与负染病毒样本或组织超薄切片结合， 然后进行负染。 可用于病毒形态的观察和病毒检测。 (3)斑点免疫金渗滤法应用微孔滤膜作 载体， 先将抗原或抗体点于膜上， 封闭后加待检样本， 洗涤后用胶体金标记的抗体检测相应 的抗原或抗体。 (4)。

17、胶体金免疫层析法将特异性的抗原或抗体以条带状固定在膜上， 胶体金 标记试剂(抗体或单克隆抗体)吸附在结合垫上， 当待检样本加到试纸条一端的样本垫上 后， 通过毛细作用向前移动， 溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应， 当移动至固定的 抗原或抗体的区域时， 待检物与金标试剂的结合物又与之发生特异性结合而被截留， 聚集 在检测带上， 可通过肉眼观察到显色结果。 该法现已发展成为诊断试纸条， 使用十分方便。 0020 进一步， 所述检测RDX蛋白的ELISA法为使用ELISA检测试剂盒。 所述试剂盒中的抗 体可采用市售的RDX单克隆抗体。 进一步， 所述的试剂盒包括： 包被RDX单克隆抗体的固相载。

18、 体， 酶标二抗， 酶的底物， 蛋白标准品， 阴性对照品， 稀释液， 洗涤液， 酶反应终止液等。 0021 进一步， 所述检测RDX蛋白的胶体金法为使用胶体金试纸条， 抗体采用市售的RDX 单克隆抗体。 进一步， 所述胶体金试纸条采用胶体金免疫层析技术或胶体金渗滤法。 进一 步， 所述胶体金试纸条硝酸纤维素膜上的检测区(T)喷点有抗RDX单克隆抗体、 质控区(C)喷 点有免疫球蛋白IgG。 0022 本发明的目的在于提供一种检测绝经后骨质疏松的荧光定量PCR试剂盒， 其特征 在于， 所述试剂盒检测基因RDX， 采用特异的上游引物和下游引物， 上游引物序列为SEQ ID NO.1， 下游引物序列。

19、为SEQ ID NO.2。 0023 进一步， 该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪， 灵 敏度高， 定量快速准确、 稳定性好， 具有良好的应用前景。 0024 进一步， 上述荧光定量PCR试剂盒组分包括： 特异性引物、 内参引物、 荧光定量PCR 反应液。 其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物， 上游引物序列为SEQ ID NO.1， 下游引物序列为SEQ ID NO.2。 所述内参引物为 -actin内参引物， 上游引物序列为SEQ ID NO.3， 下游引物序列为SEQ ID NO.4。 0025所述的试剂盒还包含RNA抽提试剂。 优选Reagent进行样。

20、本RNA提取。 0026 本发明目的是提供一种绝经后骨质疏松检测试剂盒， 所述的检测试剂盒检测RDX 蛋白。 进一步的， 所述的试剂盒还包括其他检测试剂。 0027 本发明目的是提供一种检测绝经后骨质疏松的基因芯片， 所述的基因芯片包括与 RDX基因的核酸序列杂交的探针。 0028 本发明目的是提供一种绝经后骨质疏松临床用药基因检测试剂盒， 所述试剂盒检 测RDX基因和/或RDX蛋白的表达， RDX基因和/或RDX蛋白高表达的样本组适用六味地黄丸。 0029 本发明目的是提供一种绝经后骨质疏松临床用药基因检测基因芯片， 所述基因芯 片包括与RDX基因的核酸序列杂交的探针， RDX基因和/或RD。

21、X蛋白高表达的样本组适用六味 地黄丸。 说明书 3/9 页 5 CN 108179181 A 5 0030 本发明的目的在于提供RDX基因和/或其蛋白抑制剂在制备治疗绝经后骨质疏松 药物中的应用。 0031 进一步， 所述治疗绝经后骨质疏松药物是指可以抑制RDX基因的表达的制剂。 本领 域人员熟知抑制基因的表达通常可以采用下述方法中的一种和/或几种： 通过激活RDX基因 的抑制基因、 激活RDX基因的抑制基因表达的蛋白、 采用RNA干扰技术抑制RDX基因表达、 激 活促进RDX基因mRNA降解的microRNA、 导入促进RDX基因编码蛋白降解的分子、 抑制促进RDX 基因表达的因子及蛋白的表。

22、达。 0032 RNA干扰(RNAi)是指外源性和内源性双链RNA在生物体内诱导同源靶基因的mRNA 特异性降解， 导致转录后基因沉默的现象， 是一种使用小的双链RNA高效、 特异地阻断体内 某种特定基因的表达， 促使mRNA降解， 使细胞表现出特定基因缺失表型的技术。 siRNA设计 完成后可以采用直接合成法或者构建siRNA表达载体， 制备好的siRNA可以通过磷酸钙共沉 淀法、 电穿孔法、 DEAE-葡聚糖和polybrene法、 显微注射或基因枪等机械法、 阳离子脂质体 试剂法等途径转染细胞。 0033 进一步， 抑制RDX基因表达的siRNA靶点选自下列序列中的一种和/或几种： SE。

23、Q ID NO.5、 SEQ ID NO.8、 SEQ ID NO.11。 优选siRNA序列为SEQ ID NO.5。 0034 进一步， 所述抑制RDX基因表达的siRNA序列选自下列序列中的一种和/或几种： SEQ ID NO.6、 SEQ ID NO.7、 SEQ ID NO.9、 SEQ ID NO.10、 SEQ ID NO.12、 SEQ ID NO.13。 优 选siRNA序列为SEQ ID NO.6、 SEQ ID NO.7。 0035 本发明的目的在于提供一种治疗绝经后骨质疏松药物， 所述治疗绝经后骨质疏松 药物抑制RDX基因的表达。 0036 进一步， 治疗绝经后骨质疏松。

24、药物还包含药剂学上能接受的载体。 0037 包含在本发明的药剂学上能接受的载体为在制剂时通常利用的载体， 该载体包含 乳糖(lactose)、 右旋糖(dextrose)、 蔗糖(sucrose)、 山梨醇(sorbitol)、 甘露醇 (mannitol)、 淀粉、 阿拉伯橡胶、 磷酸钙、 藻酸盐(alginate)、 凝胶(gelatin)、 硅酸钙、 微晶 纤维素、 聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)、 纤维素(cellulose)、 水、 糖浆、 甲基纤 维素(methyl cellulose)、 羟基苯甲酸甲酯(methyl hydroxybenzoate)、。

25、 丙基羟基苯甲酸 丙酯(propyl hydroxybenzoate)、 滑石、 硬脂酸镁(stearic acid magnesium)及矿物油 (mineral oil)等， 但并非局限于此。 0038 本发明的组合物除了上述成分以外还可以包含润滑剂、 湿润剂、 甜味剂、 香味剂、 乳化剂、 悬浮剂、 防腐剂等。 药剂学上能接受的载体和制剂详细记载于雷明登氏药学全书。 0039 本发明的组合物能通过口服或非口服进行给药， 作为非口服给药时， 能通过静脉 内注射， 鼻腔内注射， 局部注射， 脑室内注射， 脊髓腔注射， 皮下注射， 腹腔注射， 经皮给药等 方式进行给药。 0040 本发明的组合。

26、物的适合的给药剂量根据制剂化方法、 给药方式、 患者的年龄、 体 重、 性别、 病态、 食物、 给药时间、 给药途径、 排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行 多种处方， 通常， 熟练的医生能够容易地决定及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂 量。 0041 本发明的组合物根据本发明所属技术领域的普通技术人员可以容易实施的方法， 利用药剂学上能接受的载体和/或赋形剂来进行制剂化， 从而能够以单位用量形态制备或 说明书 4/9 页 6 CN 108179181 A 6 者内装在多容量容器内来制备。 此时， 剂型是油性或者水性介质中的溶液、 悬浮液或乳化液 形态， 或者也可以是浸膏剂、 粉末剂、。

27、 颗粒剂、 片剂或者胶囊剂形态， 还可以包括分散剂或者 稳定剂。 0042 除非另有定义， 本发明中所有的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普 通技术人员所通常理解的含义。 附图说明 0043 图1是RDX基因在绝经后骨质疏松外周血及健康人外周血中相对表达量图图2是 RDX基因在绝经后骨质疏松患者服用六味地黄丸前后外周血中相对表达量图 0044 图3是RNA干扰后各组RDX mRNA相对表达水平图： C组： 空白对照组； C1组： 转染脂质 体组； C2组： 转染非特异性的siRNA组； S1， S2， S3组： 转染特异性的siRNA组。 具体实施方式 0045 下面结合具体实施例， 。

28、进一步阐述本发明， 仅用于解释本发明， 而不能理解为对本 发明的限制。 本领域的普通技术人员可以理解： 在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 以对这些实施例进行多种变化、 修改、 替换和变型， 本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。 0046 实施例1高通量测序及分析 0047 分别收集3例绝经后骨质疏松患者服用六味地黄丸前、 后外周血样本和3例健康人 对照外周血样本， 进行RNA提取， RNA提取后琼脂糖凝胶电泳， 从电泳结果可以初步判定提取 的RNA样品质量合格与否， 是否可以用于进一步的转录组分。

29、析。 进而通过NanoDrop1000分光 光度计检测RNA样品的提取情况， RNA-seq测序的样品要求： OD260/OD280为1.8-2.2。 0048 测序平台为Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台， 进行高通量转录组深度 测序， 测序后我们运用Fast-QC软件对测序数据的质量进行整体评估， 包括碱基的质量值分 布， 质量值的位置分布， GC含量， PCR duplication含量， kmer的frequency等。 在差异基因表 达分析时， 根据得到的FPKM值， 采用国际公认算法EBSeq进行差异筛选。 其中， 筛选时， LOG2FC1或-1,FDR0.0。

30、5。 为了更好的理解差异表达基因的功能， 我们对差异表达基因进 行了Gene Onlogy和信号通路分析， 并对差异表达基因进行功能注释和蛋白质互相作用网 络分析， 鉴于以上数据分析的结果， 结合文献我们筛选了差异表达基因RDX。 RDX在骨质疏松 组高表达， 并且在服用六味地黄丸后低表达。 0049 实施例2绝经后骨质疏松患者服用六味地黄丸前后外周血RDX基因表达情况一、 材 料和方法 0050 1、 材料 0051 征集22例绝经后骨质疏松患者的同意， 在其检测初期抽取外周血， 服用六味地黄 丸半年后再次收取其外周血， 对其进行分组及编号。 0052 2、 方法 0053 2.1绝经后骨质。

31、疏松外周血及健康人外周血总RNA的提取 0054采用Reagent进行样本RNA提取， 实验操作按产品说明书进行。 说明书 5/9 页 7 CN 108179181 A 7 0055 RNA质量判定标准： RNA样本的OD260/OD280值为1.8-2.2之间； 总RNA电泳图谱有清 晰的28S、 18S条带； 70水浴保温1小时后的电泳图谱与水浴保温前的图谱无明显差异。 0056 2.2逆转录合成cDNA 0057采用III Reverse Transcriptase(invitrogen， 货号18080-044)进 行cDNA反转录， 实验操作按产品说明书进行， 具体操作如下： 005。

32、8 使用逆转录试剂盒， 用逆转录缓冲液对l g总RNA进行逆反录合成cDNA。 采用25 l 反应体系， 每个样品取1 g总RNA作为模板RNA， 在PCR管中分别加入以下组分： 0059 5逆转录缓冲液5 l， 10mmol/l dNTP 1.25 l， 0.1mmol/l DTT 2.5 l， 30 mmol/l OligodT 2 l,200U/ l MMLV 1.25 l， 模板RNA1 g， 加入灭菌水至总体系25 l。 42孵育1小 时， 7210分钟， 短暂离心。 cDNA保存放-20冰箱备用。 0060 2.3 Real-Time PCR 0061 2.3.1仪器及分析方法 0。

33、062 用ABI 7500型荧光定量PCR仪， 采用2-CT法进行数据的相对定量分析。 0063 2.3.2引物设计 0064 采用在线引物设计软件， 模板序列为NM_001260492.1， 引物设计后由invitrogen 公司合成。 具体引物序列如下： 0065 RDX引物： 0066 5 -agtcattcctccaacaga-3 (SEQ ID NO.1) 0067 5 -gttcttcctcgcttctatg-3 (SEQ ID NO.2) 0068 扩增长度123bp。 0069 -ACTIN引物： 0070 5 -taatcttcgccttaatact-3 (SEQ ID NO。

34、.3) 0071 5 -ccttcatacatctcaagt-3 (SEQ ID NO.4) 0072 扩增长度103bp。 0073 操作过程如下： 0074 反应体系： 2mix 10 l； 上游引物(10uM)和上下游引物(10uM)各0.5 l； 模板2 l； 加入灭菌蒸馏水补平至25 l。 0075用Power Green PCR Master Mix(invitrogen， 货号4367659)进行扩增， 实验操作按产品说明书进行。 0076 扩增程序为： 95 10min， (9515sec， 5860sec)35个循环。 0077 样品RealTimePCR检测： 将各样品cD。

35、NA10倍稀释后取2 l作模板， 分别用目的基因 引物和内参基因引物进行扩增。 同时在60-95进行溶解曲线分析。 二、 实验结果 0078 实时定量PCR结果显示(具体见图1)： 比较RDX基因在绝经后骨质疏松患者服用六 味地黄丸前后外周血中RDX表达情况， 服用六味地黄丸后RDX基因表达量比服用前整体下降 了三分之一左右， 与高通量测序结果趋势一致。 0079 实施例4绝经后骨质疏松患者外周血及健康人外周血中RDX基因表达情况 0080 1、 材料 0081 收集32例绝经后骨质疏松患者外周血及29例健康人外周血， 对其进行分组及编 号。 说明书 6/9 页 8 CN 108179181 。

36、A 8 0082 2、 方法 0083 具体步骤参照实施例3。 0084 3、 结果 0085 实时定量PCR扩增曲线拐点清楚， 扩增曲线整体平行性好， 表明各反应管的扩增效 率相近， 极限平而无上扬现在， 曲线指数期斜率较大， 说明扩增效率较高； 样本扩增产物溶 解曲线都是单峰， 说明扩增产物只有一条， 为特异性扩增； 根据qRT-PCR的相对定量公式， qRT-PCR扩增结果稳定， 其中RDX在绝经后骨质疏松外周血中的表达水平高于健康人外周血 中的表达水平， 前者约为后者的1.26倍(见图2)， 以上结果验证了高通量测序的结果。 0086 实施例5细胞系MG-63的培养 0087 一、 实。

37、验材料 0088 细胞系MG-63购自中科院上海细胞研究所。 0089 二、 主要溶液 0090 细胞培养液： DMEM培养基+10标准胎牛血清。 0091 0.25胰蛋白酶消化液： 0.25g胰蛋白酶加入100m1去离子水中， 滤器过滤灭菌， 分 装备用。 0092 三、 细胞传代 0093 1将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去， 加入0.25胰蛋白酶液1m1， 覆盖细 胞层， 瓶口消毒， 加盖； 0094 2倒置显微镜下观察细胞变化， 随着时间的推移， 原贴壁的细胞逐渐趋于圆形， 细 胞间质回缩， 细胞间隙加大， 在还未漂起时将胰酶弃去， 加入5ml含10胎牛血清的培养液 终止消化； 0。

38、095 3细胞计数： 取上述细胞悬液0.5mI， 适当稀释后滴入血细胞计数板内， 按白细胞计 数法数四角四大格内细胞总数， 计数时仅计数细胞核和细胞浆完整的细胞， 成堆的细胞按 一个细胞计算， 将4大方格内的细胞总数按下列公式换算成每毫升细胞悬液中的细胞数： 细 胞总数/ml4大格细胞总数/4104稀释倍数； 0096 4根据细胞计数结果， 用DMEM完全培养液进一步稀释为每毫升含3105个细胞浓 度， 分装于培养瓶中(8m1/每瓶)， 放置于37， 5CO2培养箱中培养。 0097 实施例6 RNAi抑制RDX基因表达 0098 一、 实验材料 0099 siRNA构建与合成 0100 根据。

39、RDX基因在GenBank(NCBI Reference Sequence:NM_001260492.1)中序列设 计相应的siRNA。 设计后送往合成公司合成。 非特异性的siRNA由合成公司提供。 0101 二、 实验方法 0102 (一)RNA干扰技术特异性抑制MG-63细胞中RDX基因的表达 0103 1、 MG-63细胞的培养 0104 方法步骤同实施例3。 0105 2、 siRNA的设计与合成 0106 siRNA表达载体pSIREN-DNR含新霉素抗性基因和GFP绿色荧光标记， 可以实时监测 载体在细胞中的转染效率。 根据目的mRNA序列， 设计3条RNA干扰靶序列(表1)。 。

40、对于每条选 说明书 7/9 页 9 CN 108179181 A 9 定的siRNA靶序列， 设计siRNA正义链和反义链， 以loop(9nt)相连， 称为shRNA(short hairpin RNA)。 合成每条编码shRNA的DNA模板的两条单链， 退火DNA单链得到shRNA的DNA双 链模板。 模板链后面接有RNAPoIyIII聚合酶转录中止位点， 同时两端分别设计BamHI和 HindIII酶切位点， 可以克隆到siRNA载体多克隆位点的BamHI和HindIII酶切位点之间。 siRNA空载体用BamHI和HindIII双酶切后， 1琼脂糖凝胶电泳， 回收线性载体。 把退火的 。

41、DNA模板双链连接到线性载体中。 采用T4连接酶， 插入片断与载体的摩尔比约为3:1。 连接产 物转化DH5 大肠杆菌， 在LB Amp培养基上涂板， 37培养过夜。 PCR鉴定； 测序鉴定。 柱抽提 阳性克隆载体并定量。 0107 表1 siRNA转录模板序列 0108 0109 3、 细胞分组及转染 0110 (1)细胞分组 0111 C组： 空白对照组； C1组： 转染脂质体组； C2组： 转染非特异性的siRNA组； S1， S2， S3 组： 转染特异性的siRNA组。 0112 (2)转染 0113 按照LipofectamineTM2000Transfection Reagent。

42、提供的步骤进行。 0114 转染前24h， 取对数生长期的细胞用胰酶消化并计数， 用DMEM培养基调整细胞浓 度为1105/ml， 取2m1接种于六孔板， 放置于37， 5CO2培养箱中培养， 在细胞达80融合 时用于转染。 在转染前用不含血清的DMEM培养基培养3-4h。 0115 配制转染液体： 0116 A液： 250u1无血清培养基稀释4.0ugDNA， 温和混匀； 0117 B液： 250u1无血清培养基稀释10u1Lipofectamine， 温和混匀， 室温放置5min； 0118 转染： A液与B液混合在一起， 室温保温20min， 直接将复合物加入到每孔中， 摇动 培养板， 。

43、轻轻混匀。 在CO2培养箱中37保温24-48h， 6h后换液， 加入含血清的培养基。 0119 4、 转染效率的验证 说明书 8/9 页 10 CN 108179181 A 10 0120 (1)荧光倒置显微镜下观察细胞形态和转染情况 0121 转染24h后， 将培养板置于荧光倒置显微镜下观察细胞形态及生长状态， 绿色荧光 下观察转染情况。 0122 (2)应用Real-time PCR方法检测转染前后RDX基因表达的变化 0123 标准曲线的构建： 选取在50mI培养瓶中正常培养的MG-63细胞1瓶， 提取RNA， 测 定RNA浓度和纯度， 进行逆转录反应， 将反应生成的DNA模板十倍稀释。

44、， 得到相当于104- 100copies/ul的DNA模板， 分别加入RDX引物和内参照actin引物， 配制25u1反应体系， 使用 Real-time PCR扩增仪， 进行PCR扩增反应。 得到RDX和actin的标准曲线。 0124 Real-time PCR方法检测转染前后RDX基因表达的变化： 提取各组细胞的RNA， 测 定RNA浓度和纯度， 进行逆转录反应， 每组DNA模板同时进行RDX和actin的Real-time PCR反 应， 实验重复三次。 0125 对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。 0126 三、 实验结果 0127 Real-time PCR检测转染效率。 应用Re。

45、al-time PCR方法构建RDX和actin的标准曲 线， 线性关系良好， 符合要求。 用双标准曲线的方法比较各组RDX基因的表达。 空白对照组、 脂质体转染组、 非特异性转染组基因的表达基本相似， 差异无统计学意义。 RDX-siRNA1， RDX-siRNA2， RDX-siRNA3均有抑制RDX基因表达的作用， RDX-siRNA1的作用更明显， 抑制效 率达75， 而RDX-siRNA2和RDX-siRNA3的抑制作用分别为21和32， 与空白对照组、 脂质 体转染组、 非特异性转染组相比， 差异有统计学意义， P0.05(图2)。 0128 本发明采用高通量测序筛选出绝经后骨质疏。

46、松致病相关基因RDX， 进一步分析显 示， 该基因与六味地黄丸用药效果相关， 在临床指导用药方面方面具有重要意义， 发明人结 合分子细胞生物学实验验证， 证实了RDX与绝经后骨质疏松病具有很好的相关性， 并提供了 干扰RDX基因表达的siRNA。 本发明为绝经后骨质疏松临床诊疗提供了新的诊断靶点和用药 靶点， 具有很好的临床应用前景。 说明书 9/9 页 11 CN 108179181 A 11 序列表 北京泱深生物信息技术有限公司 RDX基因在临床用药中的应用 13 SIPOSequenceListing 1.0 1 18 DNA Homo sapiens 1 agtcattcct ccaa。

47、caga 18 2 19 DNA Homo sapiens 2 gttcttcctc gcttctatg 19 3 19 DNA Homo sapiens 3 taatcttcgc cttaatact 19 4 18 DNA Homo sapiens 4 ccttcataca tctcaagt 18 5 23 DNA Homo sapiens 5 cagaaatatt tcatttaatg aca 23 6 21 RNA 序列表 1/3 页 12 CN 108179181 A 12 Homo sapiens 6 ucauuaaaug aaauauuucu g 21 7 21 RNA Homo 。

48、sapiens 7 gaaauauuuc auuuaaugac a 21 8 23 DNA Homo sapiens 8 gagaatcaat aagcggattt tgg 23 9 21 RNA Homo sapiens 9 aaaauccgcu uauugauucu c 21 10 21 RNA Homo sapiens 10 gaaucaauaa gcggauuuug g 21 11 23 DNA Homo sapiens 11 gacaaaaagg cacctgattt tgt 23 12 21 RNA Homo sapiens 12 aaaaucaggu gccuuuuugu c 21 序列表 2/3 页 13 CN 108179181 A 13 13 21 RNA Homo sapiens 13 caaaaaggca ccugauuuug u 21 序列表 3/3 页 14 CN 108179181 A 14 图1 图2 说明书附图 1/2 页 15 CN 108179181 A 15 图3 说明书附图 2/2 页 16 CN 108179181 A 16 。