技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，涉及是涉及一种弓形虫重组抗原的制备和快速检测弓形虫的应用。
背景技术
弓形虫病是由一种刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)引起的人和动物共感染。弓形虫是一种形体小、结构简单的寄生虫。猫和其他猫科动物是弓形虫的终宿主，它寄生在这些动物小肠上皮细胞内，形成囊合子随粪便排出，其他哺乳动物和鸟吃进去发生感染，在它们身体组织内发育成为包囊。囊合子和包囊是弓形虫不同发育阶段。虽然弓形虫并不“挑剔”，但是除了终宿主以外，在其他动物体内只能进行无性繁殖，不能向外界散播它的后代。弓形虫属于人畜共患病，其中对孕妇及胎儿危害最大，因此对弓形虫的早期诊断显得尤为重要。
目前国内对弓形虫病检测方法有如下几种：
1、直接镜检：取患者血液、骨髓或脑脊液、胸腹水、痰液、支气管肺泡灌洗液、眼房水、羊水等作涂片，或淋巴结、肌肉、肝、胎盘等活组织切片，作瑞氏或姬氏染色镜检可找到滋养体或包囊，但阳性率不高。
2、动物接种或组织培养：取待检体液或组织悬液，接种小白鼠腹腔内，可产生感染并找到病原体，第一代接种阴性时，应盲目传代3次；或作组织(猴肾或猪肾细胞)培养以分离、鉴定弓形虫。该方法特异性好，但耗时长，操作繁琐，不便于早期快速筛查。
3、DNA杂交技术：国内学者首次应用32P标记含弓形虫特异DNA序列的探针，与患者外周血内细胞或组织DNA进行分子杂交，显示特异性杂交条带或斑点为阳性反应。该方法敏感性好、特异性高，但由于仪器的限制，该方法无法在基层医疗机构大规模推广。
4、皮内试验：以受染小白鼠腹腔液或鸡胚液作抗原，常出现延迟性、结核菌素反应，可用作流行病学调查。目前应用不多。
5、血清学检测：近年来血清学诊断有所发展，通过检测血液、脑脊液和尿液中弓形虫抗原成份以判断感弓形虫与否。此方法灵敏度高、操作简便，可提供早期诊断依据。必须指出的是，血清学诊断的敏感性和特异性与用于检测抗原活性及其特异性密切相关。但目前临床诊断所使用弓形虫抗原多为天然提取，纯度低、特异性差，往往造成检测假阳性，因此弓形虫重组抗原制备及临床诊断尤为重要。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请提供了一种快速检测弓形虫的重组蛋白及其应用。本发明目的之一是提供编码弓形虫融合蛋白G267的cDNA序列。
本发明目的之二是提供一种可以特异性表达弓形虫融合蛋白G267的重组大肠杆菌。该菌株经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后可特异性表达弓形虫融合蛋白G267，为血清学诊断提供特异性抗原。
本发明目的之三是提供一种表达及纯化弓形虫融合蛋白G267的方法。
本发明目的之四是提供一种准确、快速、简单的弓形虫诊断方法。
本发明的技术方案如下：
本申请人提供了一种核苷酸，所述苷酸具有如序列表SEQ ID No：1所示的核苷酸序列。
本申请人还提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白具有如序列表SEQ ID No：2所示的氨基酸序列。
优选的，上面所述融合蛋白由上面所述的核苷酸序列编码。
优选的，将弓形虫P24、P30、GRA2、GRA6抗原优势表位，通过基因工程技术构建原核表达载体并实现融合表达。
本申请人还提供了一种质粒载体，其特征在于所述质粒载体含有权利要求1所述的核苷酸序列。
本申请人还提供了一种重组表达菌株，其特征在于将权利要求5所述的质粒载体转化大肠杆菌并筛选得到重组表达菌株。
优选的，所述大肠杆菌为BL21(DE3)。
本申请人还提供了所述的融合蛋白用于检测弓形虫抗体的方法，包括以下步骤：
(1)将融合蛋白标记胶体金颗粒；
(2)将融合蛋白包被硝酸纤维素膜；
(3)组装弓形虫胶体金检测产品并用于样品检测。
本发明通过以下实验方案实现：
(1)通过目前已知的弓形虫基因序列，比对其它病原微生物相关序列，经人工设计并辅以计算机模拟弓形虫的抗原优势表位，在兼顾敏感性和特异性的基础上，最终确定综合弓形虫P24、P30、GRA2、GRA6抗原优势表位作为目的序列。
(2)在原核表达载体pET-28a(+)的多克隆位点BamHI和EcoRI之间定向插入P24、P30、GRA2、GRA6抗原优势表位构建得到重组原核表达载体pET-28a(+)-PGRA。
(3)将步骤(2)中所述的重组原核表达载体pET-28a(+)-PGRA转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，用卡那青霉素抗性筛选单克隆菌株，该菌株诱导后可特异性表达弓形虫P24、P30、GRA2、GRA6抗原优势表位，得到融合蛋白G267。
(4)将步骤(3)所表达的融合蛋白G267进行纯化。融合蛋白G267纯化的具体步骤包括：
从含卡那青霉素抗性的LB平板上挑取pET-28a(+)-PGRA重组菌单克隆至LB液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为50μg/mL，37℃恒温摇床培养12小时后，用含50μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基将该菌按1：100比例稀释后，分装至细菌培养瓶中，置37℃恒温摇床培养至OD600＝0.7，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1.0mmol/L，诱导4小时后进行SDS-PAGE电泳分析，诱导后菌体经离心、超声破碎后提取包涵体，经PEG纯化、透析后于-20℃备用。
(5)将步骤(4)纯化得到的G267融合蛋白同时用于标记胶体金颗粒和包被硝酸纤维素膜，制成试纸条，用胶体金试纸检测血清样本，根据胶体金颜色变化确定其使用线性范围。
本发明有益的技术效果在于：
1、本发明所涉及到的原核表达载体pET-28a(+)是基因工程领域最常用的原核表达载体之一，没有生物危险性。在此基础上构建得到的重组原核表达载体pET-28a(+)-PGRA也不具有任何生物危险性。构建融合蛋白G267所用到的大肠杆菌菌株为BL21(DE3)，该菌株为分子生物学领域最常用的表达菌株之一，也不具有生物危险性。整个制备过程安全性高，不存在弓形虫污染、扩散等潜在风险。
2、本发明通过分子生物学技术将弓形虫P24、P30、GRA2、GRA6抗原优势表位融合，经诱导表达并纯化后得到融合蛋白G267，该融合蛋白抗原表位丰富，特异性高，用该融合蛋白作为标金抗原和包被抗原组装成胶体金试剂条，适合弓形虫的大规模临床诊断。
3、本发明所使用的融合蛋白G267通过培养大肠杆菌并诱导、纯化得到，生产工艺简单实用、生产成本低，适合大规模生产。
4、本发明提供了鉴别诊断弓形虫的一种新方法，使用操作简单易行，非常适合弓形虫的大规模临床诊断。
附图说明
图1为本发明实施例14制备得到的胶体金试纸的使用示意图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进行具体描述。以下实施例虽然对本发明的设计思路作了比较详细的文字描述，但是这些文字描述，只是对本发明设计思路的简单文字描述，而不是对本发明设计思路的限制，任何不超出本发明设计思路的组合、增加或修改，均落入到本发明的保护范围内。
实施例1：弓形虫优势抗原表位选择
以弓形虫菌为靶抗原，利用生物软件DNAssist2.0分析其抗原表位序列的亲水性及抗原性，选择优势抗原表位P24、P30、GRA2和GRA6。同时，序列比较结果显示所选择的P24、P30、GRA2和GRA6四个优势抗原表位序列具备广谱性，是所有弓形虫蛋白共有表位；并且P24、P30、GRA2和GRA6抗原优势表位与其它蛋白序列无明显同源性，仅存在于弓形虫蛋白序列。
实施例2：弓形虫优势抗原表位串联
将弓形虫P24、P30、GRA2和GRA6四个优势抗原表位序列连接，得到重组蛋白氨基酸序列，其具体序列如序列表SEQ ID No：2所示。
实施例3：优化编码重组蛋白的核苷酸序列
在重组蛋白氨基酸序列不变的前提下，为了提高重组蛋白在大肠杆菌中的表达量，根据大肠杆菌偏爱密码子将编码重组蛋白氨基酸序列转化为对应核苷酸序列，具体序列如序列表SEQ ID No：1所示，并在其上下游分别添加酶切位点BamHI和EcoRI对应的核苷酸序列，由杭州贤至生物科技有限公司合成。合成后的目的基因连接于pMD20-T载体(宝生物工程大连有限公司)中。
实施例4：构建重组蛋白表达载体
将含目的基因的pMD20-T载体和pET-28a(+)载体(德国Novagen公司)通过限制性内切酶BamHI和EcoRI(宝生物工程大连有限公司)分别于37℃双酶切12小时，酶切产物分别进行1％琼脂糖凝胶电泳，并分别切胶回收目的基因和pET-28a(+)载体(本发明所使用的胶回收试剂盒均来自宁波中鼎生物技术有限公司)。使用T4连接酶(宝生物工程大连有限公司)将回收的目的基因和pET-28a(+)载体按一定的比例于4℃连接12小时，连接产物转化DH5α感受态细胞(杭州贤至生物科技有限公司)，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃恒温培养12小时之后，于平板上挑取单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养12小时后，采用质粒纯化试剂盒(本发明所使用的质粒纯化试剂盒均来自于宁波中鼎生物技术有限公司)提取质粒，经BamHI和EcoRI双酶切鉴定后得到正确的重组表达载体。
实施例5：构建重组蛋白表达菌株
将构建好的重组表达载体转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，并涂布于含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB平板，于37℃过夜培养。第二日，挑取平板上单克隆菌株至含卡那青霉素抗性(50μg/mL)的LB液体培养基，37℃恒温摇床培养8小时后，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)(终浓度为1.0mmol/L)诱导表达4个小时后制备蛋白电泳样品。13.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明重组蛋白成功表达，得到重组蛋白表达菌株。
实施例6：最佳诱导物浓度确定
将重组蛋白G267表达菌株在LB平板上划线，37℃过夜培养后挑取单个菌落接种于5mL LB液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为50μg/mL，37℃摇床培养12小时后，用卡那青霉素浓度为50μg/mL的LB液体培养基将该菌液按1：100稀释，分装至5支试管(每管5mL)，置37℃恒温摇床培养至OD600＝0.7，分别加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度分别为0.2mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L，继续培养3小时后取等量菌液进行聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据融合蛋白G267表达量确定最佳异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导浓度为1.0mmol/L。
实施例7：最佳诱导时间确定
将重组蛋白G267表达菌株在LB平板上划线，37℃过夜培养后挑取单个菌落接种于5mL LB液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为50μg/mL，37℃摇床培养12小时后，用卡那青霉素浓度为50μg/mL的LB液体培养基将该菌液按1：100稀释，分装至5支试管(每管5mL)，置37℃恒温摇床培养至OD600＝0.7，加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为最佳诱导浓度1.0mmol/L，分别诱导培养3小时、3.5小时、4小时、4.5小时、5小时后取等量菌液进行聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，根据融合蛋白G267表达量确定最佳异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导时间为4小时。
实施例8：弓形虫融合蛋白G267大量表达及纯化
从含卡那青霉素抗性的LB平板上挑取pET-28a(+)-PGRA重组菌单克隆至LB液体培养基，加卡那青霉素至终浓度为50μg/mL，37℃恒温摇床培养12小时后，用含50μg/mL卡那青霉素的LB液体培养基将该菌按1：100比例稀释后，分装至细菌培养瓶中，置37℃恒温摇床培养至OD600＝0.7，加诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1.0mmol/L，继续培养诱导4小时。离心收集菌体后，用细菌裂解液重悬，-70℃冷冻30分钟，超声破碎3分钟，4℃离心取沉淀，弃上清。取10mL包涵体变性溶液搅拌溶解沉淀，4℃离心后，取上清加PEG4000至0.2％(W/V)、氧化型谷胱苷肽至1mmol/L、还原型谷胱苷肽至2mmol/L，4℃静置30分钟后转至截留分子量为10kD-12kD的透析袋中，于PBS(10mmol/L，pH7.4)中过夜透析。透析后立即取出并分装，于-70℃保存备用。
细菌裂解液配方：Tris-Cl 50mmol/L，pH为8.0
EDTA 1mmol/L
NaCl 100mmol/L
包涵体变性溶液：细菌裂解液+SKL 0.3％(W/V)
实施例9：Western Blot检测
纯化后的融合蛋白G267跑12％聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移到PVDF膜，一抗分别为弓形虫阴性血清和弓形虫阳性血清，二抗为HRP标记的羊抗人IgG抗体，底物为Western Blot常用的鲁咪诺荧光底物。X光底片曝光、显影、定影。
相关溶液配方：
1.电泳缓冲液：
Gly1 8.8g，Tris 3.03g，SDS 1g，加双蒸水定容至1000ml。
2.转膜缓冲液：
Gly 2.9g，Tris 5.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，加双蒸水定容至1000ml。
3.洗涤液：
Tris 3g，NaCl 8g，KCl 0.2g，Tween-20 1ml，定容至1000ml(pH7.8)。
4.荧光底物：
Pierce公司产品(货号：Prod#34075)。
实施例10：制备兔多抗
取一只雄性新西兰白兔，基础免疫白兔皮内多点注射弗氏完全佐剂乳化的300μgG267融合蛋白，共1mL/只。20天后进行第二次加强免疫，方法为取150ug G267融合蛋白用弗氏不完全佐剂乳化，共1mL/只，皮内多点注射。之后每隔15天加强免疫一次，方法与第二次加强免疫相同，共免疫5次。第五次加强免疫前，耳动脉采血5ml，纯化得到G267多克隆抗体，通过酶联免疫吸附实验测其效价。10天之后，颈动脉采血约100ml，处死白兔。酶联免疫吸附实验具体如下：
融合蛋白G267经包被液稀释后(终浓度为1μg/mL)，以100μL/孔加入酶标板(无锡国盛生物工程有限公司)，4℃包被12小时后通过DEM-3型洗板机(中山大学达安基因股份有限公司)用洗涤液洗涤1次；加入封闭液，200μL/孔，37℃封闭1小时，洗板机洗板1次；加入G267多克隆抗体1ug/ml，100μL/孔，37℃孵育35min后，洗涤液洗涤3次；加羊抗兔-HRP(辣根过氧化物酶)标记二抗，100μL/孔，37℃孵育30分钟后，洗涤液洗涤四次；每孔加显色液A和显色液B各50μL，37℃避光显色10分钟后，加终止液终止反应，50μL/孔，酶标仪(Thermo)450nm波长空白孔校零后读取OD值。相关溶液配方如下：
包被液：Na2CO3 1.59g，NaHCO3 2.93g，加双蒸水定容至1000mL(pH9.6)。
封闭液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，20g牛血清白蛋白，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
洗涤液：Na2HPO4.12H2O 2.68g，NaH2PO4.2H2O 0.39g，NaCl 8.5g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
显色液A：200mg TMB溶于100mL无水乙醇，加双蒸水定容至1000mL。
显色液B：柠檬酸2.1g，Na2HPO4.12H2O 71g，加双蒸水定容至1000mL。
使用时：1mL显色液A+1mL显色液B+0.4μL 30％H2O2。
终止液：2M H2SO4，21.7mL浓H2SO4加双蒸水定容至1000mL。
实施例11：兔多抗纯化
用50ml平衡缓冲液PBS(10mg/ml pH＝7.4)平衡琼脂糖亲和介质Protein G层析柱(南京金斯瑞生物科技有限公司)，至电脑核酸蛋白检测仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)显示吸光度调为0。血清12000rpm离心5分钟，收集上清过0.45um滤器并上样后加PBS洗涤至吸光度为0，接着用0.1M甘氨酸(pH＝3.0)洗脱，收集流出液并加入500Mm Tris-HCl(pH＝8.5)缓冲液中和至pH＝7.0左右，得到的即为弓形虫兔多克隆抗体。
实施例12：胶体金颗粒标记融合蛋白G267
取10ml 0.01％胶体金溶液加入0.2mol/L碳酸钾溶液20uL，充分混匀后加入100ug弓形虫融合蛋白G267，室温反应2小时后添加10％牛血清白蛋白(BSA)1ml，封闭处理2小时后，离心(7500rpm/min、20分钟)，弃去上清后沉淀用1ml复溶液充分溶解，采用喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)将复溶液按照10ul/cm均匀喷涂于玻璃纤维(宽度6mm)，再置于电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)37℃静置30分钟。
相关溶液配方如下：
0.01％胶体金溶液：1％氯金酸溶液1ml，1％柠檬酸溶液1.4ml，加超纯水加热溶解反应并定容至100ml。
1％氯金酸溶液：1gAuCL3.HCl.4H2O粉末加超纯水溶解并定容至100ml。
1％柠檬酸溶液：1g柠檬酸晶体加超纯水溶解并定容至100ml。
复溶液：Tris碱6.057g溶解于800ml双蒸水，用适量HCL调节pH至8.0，加双蒸水定容到1000ml。
实施例13：弓形虫诊断试纸条制备
弓形虫融合蛋白G267经包被液稀释后(终浓度为1mg/ml)，通过喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)按照1ul/cm将其均匀包被于硝酸纤维素膜(Sartorius)，此为T线。通过喷金划膜仪(上海金标生物科技有限公司)将弓形虫兔多克隆抗体(终浓度为1mg/ml)按照1ul/cm均匀包被于硝酸纤维素膜，此为C线。划膜包被结束后，将硝酸纤维素膜置于电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)37℃静置30分钟。
按照常规工艺将样品垫、玻璃纤维、硝酸纤维素膜、滤纸在PVC垫板上依次组装后切成宽4mm长条，装上试剂卡条壳并压紧。相关溶液配方如下：
包被液：Na2HPO4.7H2O 43.42g，NaH2PO4.H2O 5.244g，加双蒸水定容至1000mL(pH7.4)。
实施例14：弓形虫诊断试纸条操作步骤及标准
用弓形虫标准品免疫小鼠，取血清，梯度稀释后，100μL/孔上样，室温放置15min后，如图1所示，随着测试样品浓度增高，紫红色反应条带颜色逐渐加深。
实验结果显示，本发明利用弓形虫P24、P30、GRA2、GRA6抗原优势表位所制备得到的融合蛋白G267，并用其所建立的胶体金试纸条可快速有效鉴别诊断弓形虫感染。
实施例15：试纸的灵敏性、特异性实验
灵敏度测定：按照弓形虫试纸条操作方法，使用本发明试纸条检测梯度稀释后的阳性血清(临床已确定)，通过层析读数仪(杭州唯赞科技有限公司)分别读值(cut-off值200，大于200判定阳性，小于200判定阴性)，符合率100％，结果见表1所示。
表1：临床阳性样本检测
特异性测定：按照弓形虫试纸条操作方法，使用本发明试纸条检测3种其它血清物质，观察反应特异性。结果显示，使用本发明试纸条检测10份阴性血清(临床已确定)，符合率为100％，检测10份肝吸虫阳性血清标本，10份甲型肝炎阳性血清样本，10份乙型肝炎阳性血清等，无一阳性，表明其他疾病基本不会造成本发明试纸条的假阳性，特异性很好。
序列表
<110> 江苏省血吸虫病防治研究所
<120> 一种快速检测弓形虫的重组蛋白及其制备方法和应用
<141> 2017-12-06
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 765
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gaacgcccga ccggcaaccc ggatctgctg aaaattgcca ttaaagccag cgatggcagc 60
tatagcgaag tgggcaacgt gaacgtggaa gaagtgattg ataccatgaa aggcggcggc 120
ggcgccggca ttaaactgac cgtgccgatt gaaaaatttc cggtgaccac ccagaccttt 180
gtggtgggct gcattaaagg cgatgatgcc cagagctgca tggtgaccgt gaccgtgcag 240
gcccgcgcca gcagcgtggt gaacaacgtg gcccgctgca gctatggcgc caacagcacc 300
ctgggcccgg tgaaactgag cgccgaaggc ccgaccacca tgaccctggt gtgcggcaaa 360
gatggcgtga aagtgccgca ggataacaac cagtattgca gcggcaccac cctgaccggc 420
tgcaacgaaa aaagctttaa agatattctg ccgaaactga gcgaaaaccc gtggggcggc 480
ggcggcttta aagtggccaa agaagccgcc ggccgcggca tggtgaccgt gggcaaaaaa 540
ctggccaacg tggaaagcga tcgcagcacc accaccaccc aggccccgga tagcccgaac 600
ggcctggccg aaaccgaagt gccggtggaa ccgcagcagc gcggcggcgg cggcgaacgc 660
attgaagaac agggcacccg ccgccgctat agcagcgtgc aggaaccgca ggccaaagtg 720
ccgagcaaac gcacccagaa acgccatcgc ctgattggcg ccgtg 765
<210> 2
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gly Ala Pro Thr Gly Ala Pro Ala Leu Leu Leu Ile Ala Ile Leu Ala
1 5 10 15
Ser Ala Gly Ser Thr Ser Gly Val Gly Ala Val Ala Val Gly Gly Val
20 25 30
Ile Ala Thr Met Leu Gly Gly Gly Gly Ala Gly Ile Leu Leu Thr Val
35 40 45
Pro Ile Gly Leu Pro Pro Val Thr Thr Gly Thr Pro Val Val Gly Cys
50 55 60
Ile Leu Gly Ala Ala Ala Gly Ser Cys Met Val Thr Val Thr Val Gly
65 70 75 80
Ala Ala Ala Ser Ser Val Val Ala Ala Val Ala Ala Cys Ser Thr Gly
85 90 95
Ala Ala Ser Thr Leu Gly Pro Val Leu Leu Ser Ala Gly Gly Pro Thr
100 105 110
Thr Met Thr Leu Val Cys Gly Leu Ala Gly Val Leu Val Pro Gly Ala
115 120 125
Ala Ala Gly Thr Cys Ser Gly Thr Thr Leu Thr Gly Cys Ala Gly Leu
130 135 140
Ser Pro Leu Ala Ile Leu Pro Leu Leu Ser Gly Ala Pro Thr Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Pro Leu Val Ala Leu Gly Ala Ala Gly Ala Gly Met Val Thr
165 170 175
Val Gly Leu Leu Leu Ala Ala Val Gly Ser Ala Ala Ser Thr Thr Thr
180 185 190
Thr Gly Ala Pro Ala Ser Pro Ala Gly Leu Ala Gly Thr Gly Val Pro
195 200 205
Val Gly Pro Gly Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ala Ile Gly Gly Gly
210 215 220
Gly Thr Ala Ala Ala Thr Ser Ser Val Gly Gly Pro Gly Ala Leu Val
225 230 235 240
Pro Ser Leu Ala Thr Gly Leu Ala His Ala Leu Ile Gly Ala Val
245 250 255