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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810061626.1 (22)申请日 2018.01.23 (71)申请人 南昌大学 地址 330031 江西省南昌市红谷滩新区学 府大道999号 (72)发明人 赵大显简少卿张翠真陈志和 毛振方程海燕陈娟 (74)专利代理机构 南昌新天下专利商标代理有 限公司 36115 代理人 施秀瑾 (51)Int.Cl. C12N 15/10(2006.01) (54)发明名称 一种磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒及应 用 (57)摘要 一种磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒及应 。
2、用， 属于分子生物学技术领域。 该试剂盒包括以 下六种组分： 磁珠悬液A、 缓冲液B、 缓冲液C、 缓冲 液D、 缓冲液E和洗脱液。 该试剂盒提取方法包括 以下四个步骤： 细菌裂解、 磁珠吸附、 洗涤、 洗脱。 本发明试剂盒采用单分散、 超顺磁性硅羟基纳米 磁珠， 配合独特的缓冲液系统， 提取出来的细菌 基因组DNA浓度大、 纯度高、 完整性好。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 108220284 A 2018.06.29 CN 108220284 A 1.一种磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒， 其特征是包括磁珠悬液A、 缓冲液B、 缓冲液 C、 缓冲液D、 缓冲液E、 洗脱液六种。
3、组分； 所述磁珠悬液A中使用的磁珠为单分散、 超顺磁性硅羟基纳米磁珠， 磁珠粒径300- 500nm， 浓度100mg/mL， 磁珠悬浮在20%的乙醇中； 所述缓冲液B终浓度组成为： 2-5mol/L盐酸胍、 1-2%月桂酰肌氨酸钠、 200-500g/mL核 糖核酸酶A、 0.05-0.1mol/L柠檬酸钠， 溶剂为无菌去离子水， 缓冲液B pH为6.5-8.0； 所述缓冲液C终浓度组成为： 1-2mol/L异硫氰酸胍、 60-80%异丙醇、 1-5%聚乙二醇、 0.02-0.05mol/L柠檬酸钠， 溶剂为无菌去离子水， 缓冲液C pH为5.5-7.5； 所述缓冲液D终浓度组成为： 1-2。
4、mol/L醋酸钠、 5-8%聚乙二醇， 溶剂为无菌去离子水， 缓 冲液D pH为5.0-6.0； 所述缓冲液E终浓度组成为： 0.05-0.1mol/L氯化钠、 60-80%乙醇、 10mmol/L三羟甲基氨 基甲烷， 溶剂为无菌去离子水， 缓冲液D pH为7.0-7.5； 所述洗脱液为： 无菌去离子水或10mmol/L三羟甲基氨基甲烷， 洗脱液pH为7.0-8.0。 2.权利要求1所述的磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒的应用， 其特征是按如下步骤： 步骤一， 向离心管中加入100-500 L细菌培养液， 然后加入初始菌液相同体积的缓冲液 B， 混匀， 裂解15分钟； 步骤二， 向离心管中加入。
5、10 L 磁珠悬液A和2倍初始菌液体积的缓冲液C， 混匀， 室温放 置3分钟； 步骤三， 将离心管置于磁力架上15秒， 待磁珠完全吸至孔壁上之后， 吸弃上清， 从磁力 架上取出离心管； 步骤四， 加入500 L 缓冲液D， 混匀， 将离心管置于磁力架上15秒， 待磁珠完全吸至管壁 上后， 吸弃上清， 然后从磁力架上取出离心管； 步骤五， 加入500 L 缓冲液E， 混匀， 将离心管置于磁力架上15秒， 待磁珠完全吸至管壁 上后， 吸弃上清， 然后从磁力架上取出离心管； 步骤六， 重复步骤五1次； 步骤七， 将离心管置于55恒温箱中干燥5-7 分钟至离心管内无液体残留； 步骤八， 加入50-10。
6、0 L洗脱液， 充分悬浮磁珠5分钟； 步骤九， 取出离心管并置于磁力架上15秒， 待磁珠完全吸至管壁上后， 小心吸取上清至 新的离心管， 即获得DNA产物。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108220284 A 2 一种磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒及应用 技术领域 0001 本发明属于分子生物学技术领域， 涉及一种DNA提取试剂盒。 背景技术 0002 基因组DNA的提取是分了生物学研究的一个重要环节， 是进行几乎所有核酸检测 的基础。 传统的细菌基因组DNA提取方法有酚氯仿抽提法、 盐析法和离心柱法等。 这些方 法均存在一些缺点， 例如： 酚氯仿抽提法要使用到酚和氯仿等有毒物质， 对。
7、人体有害， 且 容易造成环境污染； 盐析法提取的DNA纯度低。 硅胶膜吸附柱法提取的DNA浓度低。 0003 传统细菌基因组DNA提取方法同时提取过程需要反复换管、 离心、 分液， 步骤繁琐， 提取工作效率低下， 并且会造成样本的丢失与污染。 此外。 传统的方法实现自动化困难、 单 位时间通量低、 既费时又繁琐， 远远不适用于核酸自动化检测。 近年来， 基于纳米材料的基 因组DNA分离技术得到了快速发展， 而纳米磁珠由于具有分散性好、 易于功能化、 易于自动 化的优点使之成为非常合适的基因组DNA制备载体。 应用表面修饰了功能基团的纳米磁珠 和合适的缓冲液系统， 能够快速、 高效地从细菌中提取。
8、基因组DNA。 具有自动化升级的潜力， 使得核酸提取的大规模集成化， 均一化成为可能。 0004 由于细菌中存在大量的蛋白质和RNA， 现有的磁珠法提取的细菌基因组DNA由于没 有去除蛋白质和RNA等杂质的步骤， 提取到的基因组DNA得率低、 纯度低。 发明内容 0005 为了解决现有技术的不足， 本发明提供了一种磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒， 利用该试剂盒提取的细菌基因组DNA片段完整， 纯度高， 无蛋白质和RNA污染， 并且得率高。 0006 为了实现上述目的， 本发明采取以下技术方案。 0007 本发明所述的一种磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒， 包括磁珠悬液A、 缓冲液B、 缓冲液。
9、C、 缓冲液D、 缓冲液E、 洗脱液六种组分。 0008 所述磁珠悬液A中使用的磁珠为单分散、 超顺磁性硅羟基纳米磁珠， 磁珠粒径300- 500nm， 浓度100mg/mL， 磁珠悬浮在20%的乙醇中。 0009 所述缓冲液B终浓度组成为： 2-5mol/L盐酸胍、 1-2%月桂酰肌氨酸钠、 200-500g/ mL核糖核酸酶A （RNase A） 、 0.05-0.1mol/L柠檬酸钠， 溶剂为无菌去离子水， 缓冲液B pH为 6.5-8.0。 核糖核酸酶A可以快速有效的降解体系中的RNA， 去除RNA污染， 同时增加磁珠对 DNA的吸附量。 0010 所述缓冲液C终浓度组成为： 1-2m。
10、ol/L异硫氰酸胍、 60-80%异丙醇、 1-5%聚乙二醇、 0.02-0.05mol/L柠檬酸钠， 溶剂为无菌去离子水， 缓冲液C pH为5.5-7.5。 缓冲液C为清洗 液， 其中的异硫氰酸胍能够使体系中的蛋白质迅速变性而与DNA分离， 达到清除蛋白质的目 的。 0011 所述缓冲液D终浓度组成为： 1-2mol/L醋酸钠、 5-8%聚乙二醇， 溶剂为无菌去离子 水， 缓冲液D pH为5.0-6.0。 说明书 1/4 页 3 CN 108220284 A 3 0012 所述缓冲液E终浓度组成为： 0.05-0.1mol/L氯化钠、 60-80%乙醇、 10mmol/L三羟甲 基氨基甲烷，。
11、 溶剂为无菌去离子水， 缓冲液D pH为7.0-7.5。 0013 所述洗脱液为： 无菌去离子水或10mmol/L三羟甲基氨基甲烷， 洗脱液pH为7.0- 8.0。 0014 本发明所述的试剂盒提取细菌基因组DNA包括细菌裂解、 磁珠吸附、 洗涤、 洗脱步 骤， 具体如下。 0015 步骤一， 向离心管中加入100-500 L细菌培养液， 然后加入初始菌液相同体积的缓 冲液B， 混匀， 裂解15分钟。 0016 步骤二， 向离心管中加入10 L 磁珠悬液A和2倍初始菌液体积的缓冲液C， 混匀， 室 温放置3分钟。 0017 步骤三， 将离心管置于磁力架上15秒， 待磁珠完全吸至孔壁上之后， 吸。
12、弃上清， 从 磁力架上取出离心管。 0018 步骤四， 加入500 L 缓冲液D， 混匀， 将离心管置于磁力架上15秒， 待磁珠完全吸至 管壁上后， 吸弃上清， 然后从磁力架上取出离心管。 0019 步骤五， 加入500 L 缓冲液E， 混匀， 将离心管置于磁力架上15秒， 待磁珠完全吸至 管壁上后， 吸弃上清， 然后从磁力架上取出离心管。 0020 步骤六， 重复步骤五1次。 0021 步骤七， 将离心管置于55恒温箱中干燥5-7 分钟至离心管内无液体残留。 0022 步骤八， 加入50-100 L洗脱液， 充分悬浮磁珠5分钟。 0023 步骤九， 取出离心管并置于磁力架上15秒， 待磁珠完。
13、全吸至管壁上后， 小心吸取上 清至新的离心管， 即获得DNA产物。 0024 本发明所述的磁珠悬液A、 缓冲液B、 缓冲液C、 缓冲液D、 缓冲液E， 为便于区分表述 不同步骤所用缓冲液不同而命名， 字母A、 B、 C、 D、 E本身没有含义。 0025 与现有技术相比， 本发明的有益效果是： 本发明提供的磁珠法细菌基因组DNA提取 试剂盒， 是一种有效的、 高质量的核酸提取试剂盒。 试剂盒中的单分散纳米磁珠， 配以独特 的缓冲系统， 使得本发明试剂盒提取出来的细菌基因组DNA片段完整、 纯度高、 得率高， 满足 后续实验要求， 大大提高了DNA的质量。 附图说明 0026 图1是本发明试剂盒。
14、提取的大肠杆菌DH10B和金黄色葡萄球菌基因组DNA的琼脂糖 凝胶电泳图， 泳道M： DNA分子量DL15000， 泳道1： 本试剂盒提取的大肠杆菌DH10B基因组DNA， 泳道2： 本试剂盒提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA。 0027 图2是三种不同方法提取的大肠杆菌DH10B基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图， 泳道 M： DNA分子量DL15000， 泳道1： 本发明试剂盒提取的大肠杆菌DH10B基因组DNA， 泳道2： 酚 氯仿抽提法提取的大肠杆菌DH10B基因组DNA， 离心柱法提取的大肠杆菌DH10B基因组DNA。 具体实施方式 0028 本发明将通过以下实施例作进一步说明。 0029。
15、 实施例1。 说明书 2/4 页 4 CN 108220284 A 4 0030 磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒的制备。 按照以下组分浓度配置相应的缓冲液： 磁珠悬液A： 100mg/mL纳米磁珠、 20%乙醇。 0031 缓冲液B： 3mol/L盐酸胍、 2%月桂酰肌氨酸钠、 400g/mL RNase A、 0.05mol/L柠檬 酸钠， pH为7.5。 0032 缓冲液C： 1.5mol/L异硫氰酸胍、 70%异丙醇、 5%聚乙二醇、 0.02mol/L柠檬酸钠， pH 为5.5。 0033 缓冲液D： 1.5mol/L醋酸钠、 5%聚乙二醇， pH为5.5。 0034 缓冲液E： 0。
16、.05mol/L氯化钠、 75%乙醇、 10mmol/L三羟甲基氨基甲烷， pH为7.0。 0035 洗脱液： 无菌去离子水， pH为7.2 实施例2。 0036 用上述实施例1制备的磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取大肠杆菌DH10B 和金黄色葡萄球菌基因组DNA， 步骤如下： 步骤一， 向离心管中加入200 L大肠杆菌DH10B或金黄色葡萄球菌过夜培养液， 然后加 入200 L缓冲液B， 混匀， 裂解15分钟。 0037 步骤二， 向离心管中加入10 L磁珠悬液A和400 L缓冲液C， 混匀， 室温放置3分钟。 0038 步骤三， 将离心管置于磁力架上15秒， 待磁珠完全吸至孔壁上之。
17、后， 吸弃上清， 从 磁力架上取出离心管。 0039 步骤四， 加入500 L 缓冲液D， 混匀， 将离心管置于磁力架上15秒， 待磁珠完全吸至 管壁上后， 吸弃上清， 然后从磁力架上取出离心管。 0040 步骤五， 加入500 L 缓冲液E， 混匀， 将离心管置于磁力架上15秒， 待磁珠完全吸至 管壁上后， 吸弃上清， 然后从磁力架上取出离心管。 0041 步骤六， 重复步骤五1次。 0042 步骤七， 将离心管置于55恒温箱中干燥5-7分钟至离心管内无液体残留。 0043 步骤八， 加入100 L洗脱液， 充分悬浮磁珠5分钟。 0044 步骤九， 取出离心管并置于磁力架上15秒， 待磁珠完。
18、全吸至管壁上后， 小心吸取上 清至新的离心管， 即获得DNA产物。 0045 提取的基因组DNA经NanoDrop 2000C超微量分光光度计检测浓度和纯度， 结果如 表1所示。 可以看出， 本试剂盒提取得到的基因组DNA纯度高， 能够满足实验要求， 且基因组 DNA提取效率较高， 可从200 L菌液获得大于80 g DNA。 取5 L的基因组DNA， 于质量浓度1%的 琼脂糖凝胶上， 在100v电压下电泳30min， 用紫外凝胶成像系统进行照相， 可见基因组DNA完 整性好， 且没有RNA污染(图1所示)。 0046 表1 本试剂盒细菌基因组DNA提取结果 细菌类型DNA浓度 （ng/ L）。
19、OD260/280OD230/260 大肠杆菌DH10B450.61.881.92 金黄色葡萄球菌401.21.861.93 对比例1。 0047 分别用酚氯仿抽提法和离心柱法提取细菌基因组DNA， 步骤分别按照各自的说 明书进行， 提取的基因组DNA经NanoDrop 2000C超微量分光光度计检测浓度和纯度， 结果如 表2所示。 可以看出， 本发明试剂盒提取得到的基因组DNA与其他两种方法相比， 纯度高、 浓 说明书 3/4 页 5 CN 108220284 A 5 度大， 没有盐离子污染， 基因组完整性好 （图2所示） 。 0048 表2 三种方法对DH10B基因组DNA提取结果 方 法DNA浓度 （ng/ L）OD260/280OD230/260 本发明试剂盒443.31.871.91 酚氯仿抽提法215.41.781.92 离心柱法358.91.661.93 说明书 4/4 页 6 CN 108220284 A 6 图1 图2 说明书附图 1/1 页 7 CN 108220284 A 7 。