应用毕赤酵母的pGAP调控表达木糖异构酶的方法 【技术领域】
本发明属于生物技术领域，涉及一种应用毕赤酵母的pGAP启动子调控生产生物蛋白的方法，具体是一种应用毕赤酵母的pGAP调控表达木糖异构酶的方法。
背景技术
木糖异构酶(Xylose Isomerase EC5.3.1.5)是由一系列微生物产生的，具有变构作用的酶。木糖异构酶酶的主要作用是催化D-木糖(醛戊糖)与D-木酮糖(酮戊糖)相互转换的酶，也作用于D-萄萄糖得到D-果糖。木糖异构酶主要应用于高果糖浆工业以及半纤维素乙醇工业。多种微生物具有产生木糖异构酶的功能。目前工业生产上主要是以天然的含生产木糖异构酶基因菌株进行发酵生产木糖异构酶。但是，由于天然的产木糖异构酶菌株的生长缓慢，生产周期长，营养要求较高，产物或是在胞内形成包涵体(细菌菌株)或是分泌大量自身的蛋白(真菌菌株)不利于目标蛋白的纯化，生产成本较高，不利于木糖异构酶的规模化生产和利用。
毕赤酵母(Pichia pastoris)是最近迅速发展的一种真核表达宿主，营养要求不高，适合于高密度发酵的大规模生产方式，由于Pichiapastoris分泌自身的蛋白很少，有利于表达产物的纯化。pGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是Pichia pastoris的组成型强启动子，与Pichia pastoris的pAOX1(醇氧化酶1启动子)相比其优越性主要是不需要有毒性的甲醇作为碳源。
【发明内容】
本发明的目的是为解决应用天然产木糖异构酶的菌株生产木糖异构酶的成本较高、产物难于纯化的问题，而提供一种应用毕赤酵母的pGAP(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)调控表达木糖异构酶的方法。
本发明所采用的技术方案是：
一种应用毕赤酵母的pGAP调控表达木糖异构酶的方法，其步骤是：
1、首先从毕赤酵母中扩增pGAP启动子；
2、在木糖异构酶序列的3’末端融合His6标签，构建由pGAP调控木糖异构酶基因的毕赤酵母表达载体，并将这一载体转化毕赤酵母基因组；
3、根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株；
4、将工程菌株接种于含碳源的液体培养基中，于28～30℃在生物反应器中发酵工程菌1～2d分泌表达木糖异构酶。所述液体培养基是由以下组分组成：85％磷酸25～28ml/L，CaSO4·2H2O 0.8～1.2g/L，K2SO4 17～19g/L，MgSO4·7H2O 13～16g/L，KOH 3.5～4.5g/L，碳源15～45g/L，蛋白胨18～22g/L，Yeast extract 8～12g/L，PTM4 3～5ml/L；所述PTM4是由以下组分组成：CuSO4·5H2O 2.0g/L，NaI·2H2O 0.1g/L，MnSO4·H2O 3.0g/L，Na2MoO4·2H2O 0.2g/L，H3BO3 0.02g/L，CoCl2·6H2O 1.05g/L，ZnCl2 7.0g/L，Fe2(SO4)3·7H2O 22g/L，生物素0.2g/L，硫酸1ml/L。
所述碳源是甘油、油酸、山梨醇、葡萄糖、乳酸、甘氨酸、丙氨酸、海藻糖或甘露醇。
本发明采用了毕赤酵母的pGAP调控表达的木糖异构酶，具有下列优点：
1、生产成本低，只需使用普通的无机盐、碳源和氮源作为发酵培养基。
2、可在生物反应器中发酵毕赤酵母，其细胞能生长至细胞密度达200A以上，能以足够多的细胞数量表达木糖异构酶，有利于木糖异构酶的大规模生产。
3、发酵周期短，整个发酵周期只需1～2d。
4、使用无毒性的碳源，不需要使用有毒性的甲醇作为碳源。
5、由于pGAP是毕赤酵母的强启动子，由pGAP调控表达的木糖异构酶约占总分泌蛋白的比例较高，并且由于在木糖异构酶的C端融合了His标签，有利于产物的纯化。
【具体实施方式】
下面采用非限定性实施例对本发明作进一步说明。
实施例一
1、首先从Pichia pastoris中扩增pGAP启动子；
2、在木糖异构酶序列的3’末端融合His6标签，构建由pGAP调控木糖异构酶基因的Pichia pastoris表达载体，并将这一载体转化Pichia pastoris基因组；
3、根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株；
4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中【液体培养基的配方(每升)：85％磷酸25.7ml，CaSO4·2H2O 0.87g，K2SO4 17.5g，MgSO4·7H2O 13.9g，KOH 3.73g，甘油40g，蛋白胨19g，Yeast extract 9g，PTM4微量元素3ml】【PTM4配方(每升)：CuSO4·5H2O 2.0g，NaI·2H2O 0.1g，MnSO4·H2O 3.0g，Na2MoO4·2H2O 0.2g，H3BO30.02g，CoCl2·6H2O 1.05g，ZnCl2 7.0g，Fe2(SO4)3·7H2O 22g，生物素0.2g，硫酸1ml】，在生物反应器中进行发酵表达木糖异构酶。其发酵参数为：温度28℃，pH5.0，搅拌转速700r/min。发酵2d后离心收获上清进行纯化木糖异构酶。通过蛋白电泳和酶活性测定对表达的木糖异构酶进行鉴定(蛋白电泳证明发酵表达的目标蛋白符合木糖异构酶蛋白分子量，并且木糖异构酶活性＞1μ/μg目标蛋白)而证明本实施所获得的产品是木糖异构酶。
实施例二
1、首先从Pichia pastoris中扩增pGAP启动子；
2、在木糖异构酶基因序列的3’末端融合His6标签，构建由pGAP调控木糖异构酶基因的Pichia pastoris表达载体，并将这一载体转化Pichia pastoris基因组；
3、根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株；
4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中【液体培养基的配方(每升)：85％磷酸26.7ml，CaSO4·2H2O 0.93g，K2SO4 18.2g，MgSO4·7H2O 14.9g，KOH 4.13g，油酸20g，蛋白胨20g，Yeast extract 10g，PTM4微量元素4ml】【PTM4配方(每升)：CuSO4·5H2O 2.0g，NaI·2H2O 0.1g，MnSO4·H2O 3.0g，Na2MoO4·2H2O 0.2g，H3BO30.02g，CoCl2·6H2O 1.05g，ZnCl2 7.0g，Fe2(SO4)3·7H2O 22g，生物素0.2g，硫酸1ml】，在生物反应器中进行发酵表达木糖异构酶。其发酵参数为：温度30℃，pH5.0，搅拌转速300r/min。发酵2d后离心收获上清进行纯化木糖异构酶。通过蛋白电泳和酶活性测定对表达的木糖异构酶进行鉴定(蛋白电泳证明发酵表达的目标蛋白符合木糖异构酶蛋白分子量，并且木糖异构酶活性＞1μ/μg目标蛋白)而证明本实施所获得地产品是木糖异构酶。
实施例三
1、首先从Pichia pastoris中扩增pGAP启动子；
2、在木糖异构酶基因序列的3’末端融合His6标签，构建由pGAP调控木糖异构酶基因的Pichia pastoris表达载体，并将这一载体转化Pichia pastoris基因组；
3、根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株；
4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中【液体培养基的配方(每升)：85％磷酸27.2ml，CaSO4·2H2O 1.03g，K2SO4 18.2g，MgSO4·7H2O 15.2g，KOH 4.23g，山梨醇35g，蛋白胨20g，Yeast extract 10g，PTM4微量元素4ml】【PTM4配方(每升)：CuSO4·5H2O 2.0g，NaI·2H2O 0.1g，MnSO4·H2O 3.0g，Na2MoO4·2H2O 0.2g，H3BO30.02g，CoCl2·6H2O 1.05g，ZnCl2 7.0g，Fe2(SO4)3·7H2O 22g，生物素0.2g，硫酸1ml】，在生物反应器中进行发酵表达木糖异构酶。其发酵参数为：温度28℃，pH5.0，搅拌转速500r/min。发酵2d后离心收获上清进行纯化木糖异构酶。通过蛋白电泳和酶活性测定对表达的木糖异构酶进行鉴定(蛋白电泳证明发酵表达的目标蛋白符合木糖异构酶蛋白分子量，并且木糖异构酶活性＞1μ/μg目标蛋白)而证明本实施所获得的产品是木糖异构酶。
实施例四
1、首先从Pichia pastoris中扩增pGAP启动子；
2、在木糖异构酶基因序列的3’末端融合His6标签，构建由pGAP调控α淀粉酶基因的Pichia pastoris表达载体，并将这一载体转化Pichia pastoris基因组；
3、根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株；
4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中【液体培养基的配方(每升)：85％磷酸27.7ml，CaSO4·2H2O 1.13g，K2SO4 18.7g，MgSO4·7H2O 15.5g，KOH 4.33g，葡萄糖40g，蛋白胨21g，Yeast extract 11g，PTM4微量元素5ml】【PTM4配方(每升)：CuSO4·5H2O 2.0g，NaI·2H2O 0.1g，MnSO4·H2O 3.0g，Na2MoO4·2H2O 0.2g，H3BO30.02g，CoCl2·6H2O 1.05g，ZnCl2 7.0g，Fe2(SO4)3·7H2O 22g，生物素0.2g，硫酸1ml】，在生物反应器中进行发酵表达木糖异构酶。其发酵参数为：温度30℃，pH5.0，搅拌转速700r/min。发酵1d后离心收获上清进行纯化木糖异构酶。通过蛋白电泳和酶活性测定对表达的木糖异构酶进行鉴定(蛋白电泳证明发酵表达的目标蛋白符合木糖异构酶蛋白分子量，并且木糖异构酶活性＞1μ/μg目标蛋白)而证明本实施所获得的产品是木糖异构酶。
实施例五
1、首先从Pichia pastoris中扩增pGAP启动子；
2、在木糖异构酶基因序列的3’末端融合His6标签，构建由pGAP调控木糖异构酶基因的Pichia pastoris表达载体，并将这一载体转化Pichia pastoris基因组；
3、根据载体上所带的抗性基因筛选高拷贝重组子作为工程菌株；
4、将工程菌株菌液接种于液体培养基中【液体培养基的配方(每升)：85％磷酸27.7ml，CaSO4·2H2O 0.93g，K2SO4 18.7g，MgSO4·7H2O 15.7g，KOH 4.33g，乳酸30g，蛋白胨22g，Yeast extract 12g，PTM4微量元素5ml】【PTM4配方(每升)：CuSO4·5H2O 2.0g，NaI·2H2O 0.1g，MnSO4·H2O 3.0g，Na2MoO4·2H2O 0.2g，H3BO30.02g，CoCl2·6H2O 1.05g，ZnCl2 7.0g，Fe2(SO4)3·7H2O 22g，生物素0.2g，硫酸1ml】，在生物反应器中进行发酵表达木糖异构酶。其发酵参数为：温度28℃，pH5.0，搅拌转速800r/min。发酵1d后离心收获上清进行纯化木糖异构酶。通过蛋白电泳和酶活性测定对表达的木糖异构酶进行鉴定(蛋白电泳证明发酵表达的目标蛋白符合木糖异构酶蛋白分子量，并且木糖异构酶活性＞1μ/μg目标蛋白)而证明本实施所获得的产品是木糖异构酶。