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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410409049.2 (22)申请日 2014.08.19 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104278027 A (43)申请公布日 2015.01.14 (73)专利权人 中国农业科学院北京畜牧兽医研 究所 地址 100193 北京市海淀区圆明园西路2号 专利权人 天津市畜牧兽医研究所 (72)发明人 王立贤张龙超王立刚李娜 李千军 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅陈晓庆 (51)Int.Cl. C12N 。
2、15/11(2006.01) C12Q 1/68(2006.01) 审查员 沈晶晶 (54)发明名称 一种鉴定猪的肌内脂肪含量高低的方法及 其专用引物对 (57)摘要 本发明公开了一种鉴定猪的肌内脂肪含量 高低的方法及其专用引物对。 本发明公开一种扩 增含有g.38240CA多态性位点的DNA片段的引物 对。 本发明公开的方法可对待选猪进行早期筛 选， 有效地缓解实际生产中的选取优良种猪时间 长的问题， 降低了育种花费， 有效降低或提高实 际生产中的猪肌内脂肪含量， 该方法准确度高， 检测费用低， 并可实现自动化检测， 在猪的育种 方面具有很高的实践应用价值。 权利要求书1页 说明书5页 序列。
3、表2页 附图1页 CN 104278027 B 2017.03.29 CN 104278027 B 1.一种鉴定或辅助鉴定猪的肌内脂肪含量高低的方法， 该方法为： 纯合CC基因型的猪 的肌内脂肪含量大于杂合AC基因型的猪的肌内脂肪含量， 杂合AC基因型的猪的肌内脂肪含 量大于纯合AA基因型的猪的肌内脂肪含量； 所述纯合CC基因型的猪为g.38240CA多态性位点的碱基均为C的猪； 所述杂合AC基因型的猪为g.38240CA多态性位点的碱基为A和C的猪； 所述纯合AA基因型的猪为g.38240CA多态性位点的碱基均为A的猪； 所述g.38240CA多态性位点为SEQ ID No.3或SEQ ID。
4、 No.4自5 末端起第216位。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于： 所述纯合CC基因型、 杂合AC基因型或纯合 AA基因型的判定方法如下： 以猪的基因组DNA为模板， 以SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子为引物进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物， 如果PCR扩增产物自5 末端 起第216位的碱基均为C， 则所述猪的基因型为纯合CC基因型， 如果PCR扩增产物自5 末端起 第216位的碱基为A和C， 则所述猪的基因型为杂合AC基因型， 如果PCR扩增产物自5 末端起 第216位的碱基均为A， 则所述猪的基因型为纯合AA基因型。 3.一种。
5、选育高肌内脂肪含量的猪的方法， 是选择纯合CC基因型的猪进行选育； 所述纯 合CC基因型的猪为g.38240CA多态性位点的碱基均为C的猪； 所述g.38240CA多态性位点为SEQ ID No.3或SEQ ID No.4自5 末端起第216位。 4.根据权利要求3所述的方法， 其特征在于： 所述纯合CC基因型的判定方法如下： 以猪 的基因组DNA为模板， 以SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子为引物 进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物， 如果PCR扩增产物自5 末端起第216位的碱基均为C， 则所 述猪的基因型为纯合CC基因型。 5.一种选育低肌内。
6、脂肪含量的猪的方法， 是选择纯合AA基因型的猪进行选育； 所述纯合AA基因型的猪为g.38240CA多态性位点的碱基均为A的猪； 所述g.38240CA多态性位点为SEQ ID No.3或SEQ ID No.4自5 末端起第216位。 6.根据权利要求5所述的方法， 其特征在于： 所述纯合AA基因型的判定方法如下： 以猪 的基因组DNA为模板， 以SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的DNA分子为引物 进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物， 如果PCR扩增产物自5 末端起第216位的碱基均为A， 则所 述猪的基因型为纯合AA基因型。 7.权利要求1-6任一所述的方。
7、法在猪的选育中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104278027 B 2 一种鉴定猪的肌内脂肪含量高低的方法及其专用引物对 技术领域 0001 本发明涉及一种鉴定猪的肌内脂肪含量高低的方法及其专用引物对， 属于生物技 术领域。 背景技术 0002 猪肉质品质是猪的重要经济性状， 它与人们的肉食营养、 肉食品加工和养猪业经 济效益都密切相关。 因此， 猪肉质品质研究已成为肉食品加工和猪遗传育种领域的一个重 要组成部分， 世界各国相关科技工作者也将猪肉质品质作为研究的重点与热点。 肌内脂肪， 俗称大理石花纹， 对于猪肉的品质评定是一个必不可少的指标， 其重要性表现在对肌肉组 织的感观、。
8、 可口性、 加工及储藏性能均有影响。 肌内脂肪含量与肉质的嫩度、 风味和多汁性 呈正相关， 适宜的肌内脂肪含量可产生较为理想的口感， 是决定肉质的重要性状， 也符合我 国传统烹饪文化对风味的要求， 因此， 肌内脂肪含量已成为重要的肉质指标纳入猪的育种 计划。 尽管大多肉质性状的遗传力较低， 但肌内脂肪呈中等遗传力， 表明肉质性状可以通过 育种获得较大的遗传改进。 0003 有研究对猪肉肌内脂肪含量QTL进行定位分析， 将这一肉品质性状QTL定位于12号 染色体上,定位区间为42-43Mb(Ma J,Ren J,Guo Y,Duan Y,Ding N,Zhou L,Li L,Yan X, Yan。
9、g K,Huang L,Song Y,Xie J,Milan D,Huang L.Genome-wide identification of quantitative trait loci for carcass composition and meat quality in a large- scale White Duroc x Chinese Erhualian resource population.Anim Genet.2009,40 (5):637-647.)。 也有全基因组关联研究(GWAS)， 将肌内脂肪含量性状全基因组显著关联区 间定位于12号染色体上43-55Mb区间(Lu。
10、o W,Cheng D,Chen S,Wang L,Li Y,Ma X,Song X, Liu X,Li W,Liang J,Yan H,Zhao K,Wang C,Wang L,Zhang L.Genome-wide association analysis of meat quality traits in a porcine Large WhiteMinzhu intercross population.J Int Biol Sci.2012； 8(4):580-595.)。 MAP2K4基因位于此QTL和GWAS显著区 间内， 且有研究表明， MAP2K4(mitogen-activa。
11、ted protein kinase kinase4)可作为肌内 脂肪含量性状候选基因(Ramayo-Caldas Y,Fortes MR,Hudson NJ,Porto-Neto LR, Bolormaa S,Barendse W,Kelly M,Moore SS,Goddard ME,Lehnert SA,Reverter A.A marker-derived gene network reveals the regulatory role of PPARGC1A,HNF4G,and FOXP3in intramuscular fat deposition of beef cattle.J。
12、 Anim Sci.2014； 92:2832- 2845.)。 综合， MAP2K4基因作为肌内脂肪含量性状候选基因， 具有很高的研究价值。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种鉴定猪的肌内脂肪含量高低的方法及其专用引物对。 0005 本发明提供一种扩增含有g.38240CA多态性位点的DNA片段的引物对； 0006 所述g.38240CA多态性位点为GenBank Accession Number为NC_010454.3的序列 的自5 末端起第38240位； 说明书 1/5 页 3 CN 104278027 B 3 0007 所述GenBank Accession Number为NC。
13、_010454.3的序列的更新日为2013年9月29 日。 0008 上述引物对中， 所述引物对由SEQ ID No.1所示的DNA分子和SEQ ID No.2所示的 DNA分子组成。 0009 一种鉴定或辅助鉴定猪的肌内脂肪含量高低的试剂盒也属于本发明的保护范围， 该试剂盒包含上述任一所述的引物对。 0010 一种鉴定或辅助鉴定猪的肌内脂肪含量高低的方法也属于本发明的保护范围， 该 方法为： 纯合CC基因型的猪的肌内脂肪含量大于杂合AC基因型的猪的肌内脂肪含量， 杂合 AC基因型的猪的肌内脂肪含量大于纯合AA基因型的猪的肌内脂肪含量； 0011 所述纯合CC基因型的猪为g.38240CA多态。
14、性位点的碱基均为C的猪； 0012 所述杂合AC基因型的猪为g.38240CA多态性位点的碱基为A和C的猪； 0013 所述纯合AA基因型的猪为g.38240CA多态性位点的碱基均为A的猪； 0014 所述g.38240CA多态性位点为GenBank Accession Number为NC_010454.3的序列 的自5 末端起第38240位； 0015 所述GenBank Accession Number为NC_010454.3的序列的更新日为2013年9月29 日。 0016 上述方法中， 所述纯合CC基因型、 杂合AC基因型或纯合AA基因型的判定方法如下： 以猪的基因组DNA为模板， 以。
15、上述任一所述的引物为引物进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物， 如果PCR扩增产物自5 末端起第216位的碱基均为C， 则所述猪的基因型为纯合CC基因型， 如 果PCR扩增产物自5 末端起第216位的碱基为A和C， 则所述猪的基因型为杂合AC基因型， 如 果PCR扩增产物自5 末端起第216位的碱基均为A， 则所述猪的基因型为纯合AA基因型。 0017 一种选育高肌内脂肪含量的猪的方法也属于本发明的保护范围， 是选择纯合CC基 因型的猪进行选育； 0018 所述纯合CC基因型的猪为g.38240CA多态性位点的碱基均为C的猪； 0019 所述g.38240CA多态性位点为GenBank Acc。
16、ession Number为NC_010454.3的序列 的自5 末端起第38240位； 0020 所述GenBank Accession Number为NC_010454.3的序列的更新日为2013年9月29 日。 0021 上述方法中， 所述纯合CC基因型的判定方法如下： 以猪的基因组DNA为模板， 以上 述任一所述的引物为引物进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物， 如果PCR扩增产物自5 末端起第 216位的碱基均为C， 则所述猪的基因型为纯合CC基因型。 0022 一种选育低肌内脂肪含量的猪的方法也属于本发明的保护范围， 是选择纯合AA基 因型的猪进行选育； 0023 所述纯合AA基因。
17、型的猪为g.38240CA多态性位点的碱基均为A的猪； 0024 所述g.38240CA多态性位点为GenBank Accession Number为NC_010454.3的序列 的自5 末端起第38240位； 0025 所述GenBank Accession Number为NC_010454.3的序列的更新日为2013年9月29 日。 0026 上述方法中， 所述纯合AA基因型的判定方法如下： 以猪的基因组DNA为模板， 以上 说明书 2/5 页 4 CN 104278027 B 4 述任一所述的引物为引物进行PCR扩增， 得到PCR扩增产物， 如果PCR扩增产物自5 末端起第 216位的碱。
18、基均为A， 则所述猪的基因型为纯合AA基因型。 0027 上述任一所述的方法中， 所述猪为大民杂交猪， 由大白猪和民猪杂交得到。 0028 上述任一所述的引物对、 上述试剂盒和/或上述任一所述的方法在猪的选育中的 应用也属于本发明的保护范围。 0029 上述应用中， 所述猪为大民杂交猪， 由大白猪和民猪杂交得到。 0030 本发明使用测序的方法检测g.38240CA多态性位点处的碱基， 判别猪个体的基因 型， 从而对猪肌内脂肪含量性状进行选择， 可使猪平均肌内脂肪含量增大约1.25， 获得高 肌内脂肪含量的猪。 本发明提供的方法可对待选猪进行早期筛选， 有效地解决实际生产中 的选取优良种猪时间。
19、长的问题， 降低了育种花费， 有效降低或提高实际生产中的猪的肌内 脂肪含量， 该方法准确度高， 检测费用低， 并可实现自动化检测， 在猪的育种方面具有很高 的实践应用价值。 附图说明 0031 图1为AA基因型个体和CC基因型个体g.38240CA多态性位点附近序列的测序结 果。 具体实施方式 0032 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明， 均为常规方法。 0033 下述实施例中所用的材料、 试剂等， 如无特殊说明， 均可从商业途径得到。 0034 大民杂交猪(Sus scrofa)， 由大白猪和民猪杂交获得， 该猪购自中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所昌平畜禽实验基地。 0035 下述。
20、实施例中的GenBank Accession Number为NC_010454.3的序列均是指更新日 为2013年9月29日的GenBank Accession Number为NC_010454.3的序列。 0036 实施例1、 鉴定猪的肌内脂肪含量高低 0037 一、 猪g.38240CA多态性位点的确定 0038 (一)以两头大民杂交猪为实验材料， 分别提取其耳缘组织的基因组DNA。 0039 (二)引物的设计与合成 0040 根据猪MAP2K4基因的基因组序列(该序列位于GenBank Accession Number： NC_ 010454.3中),设计并合成如下引物： 0041 U(。
21、上游引物)： 5 -CACAGAGTAGATGCTTTTGG-3 (SEQ ID No.1)； 0042 D(下游引物)： 5 -GAGGAGTGGCGTGATTC-3 (SEQ ID No.2)。 0043 (三)PCR扩增 0044 分别以步骤(一)得到的大民杂交猪的基因组DNA为模板， 以U和D为引物进行PCR扩 增， 得到PCR扩增产物， 分别命名为产物1和产物2。 0045 PCR扩增体系： 基因组DNA200ng， 10PCR扩增缓冲液5 l， dNTPs终浓度为10mM， 上、 下游引物各50ng， Taq DNA聚合酶0.75U， Mg2+2.5mmol/L， 用ddH2O补足。
22、体系至50 l。 0046 PCR扩增程序： 95预变性5min； 95变性20s， 58.5退火30s， 72延伸30s， 共35 个循环； 最后72延伸10min。 说明书 3/5 页 5 CN 104278027 B 5 0047 (四)测序及序列分析 0048 将产物1和产物2进行测序， 得到产物1的序列(如SEQ ID No.3所示)和产物2的序 列(如SEQ ID No.4所示)。 SEQ ID No.3和SEQ ID No.4只存在一个碱基的差异， 均为SEQ ID No.3和SEQ ID No.4中自5 末端起第216位， 该处的碱基为C或A， 如图1中箭头所示， 该位点 为G。
23、enBank Accession Number为NC_010454.3序列的自5 末端起第38240位， 因此将该位点 命名为g.38240CA。 0049 在GenBank Accession Number为NC_010454.3的序列自5 末端第38240位的碱基 (或步骤(三)得到的PCR扩增产物自5 末端起第216位的碱基)均为C的个体， 该个体为纯合 型个体， 将该个体的基因型命名为纯合CC基因型， 在GenBank Accession Number为NC_ 010454.3的序列自5 末端第38240位的碱基(或步骤(三)得到的PCR扩增产物自5 末端起第 216位的碱基)均为A的。
24、个体， 该个体为纯合型个体， 将该个体的基因型命名为纯合AA基因 型， 在GenBank Accession Number为NC_010454.3的序列自5 末端第38240位的碱基(或步 骤(三)得到的PCR扩增产物自5 末端起第216位的碱基)为C和A的个体， 该个体为杂合型个 体， 将该个体的基因型命名为杂合AC基因型。 0050 二、 g.38240CA多态性位点与猪的肌内脂肪含量的关联性分析 0051 为确定g.38240CA多态性位点与猪的肌内脂肪含量性状是否相关， 以593头大民 杂交猪为实验材料， 进行如下试验： 0052 (一)提取每头猪的耳缘组织的基因组DNA， 分别按照步。
25、骤一中(三)的方法进行PCR 扩增， 得到各PCR扩增产物， 按照步骤一中(四)的方法确定每头猪的基因型是纯合CC、 杂合 AC还是纯合AA。 0053 (二)用索氏提取法检测每头猪的肌内脂肪(IMF)含量。 0054 结果如表1所示。 0055 表1表明， 纯合CC基因型的猪的肌内脂肪含量高于杂合AC基因型的猪的肌内脂肪 含量， 杂合AC基因型的猪的肌内脂肪含量大于纯合AA基因型的猪的肌内脂肪含量。 0056 (三)对猪的基因型与猪肌内脂肪含量以最小二乘法开展关联分析， 具体方法可参 见文献 “Zhang L,Wang L,Li Y,Li W,Yan H,Liu X,Zhao K,Wang 。
26、L.A substitution within erythropoietin receptor gene D1domain associated with litter size in Beijing Black pig,Sus scrofa.Anim Sci J.2011； 82(5):627-632” 。 0057 所用模型如下： 0058 YS+P+B+G+e 0059 其中Y为性状测定值， S为性别效应， P为胎次效应， B为屠宰批次效应， G为基因型效 应， e为残差效应。 0060 结果如表1所示。 0061 表1 猪的基因型与猪的肌内脂肪含量的关联性分析 说明书 4/5 页 6 。
27、CN 104278027 B 6 0062 0063 注： 同列上标不同字母表示差异显著(P0.001) 0064 表1表明， 在猪的肌内脂肪含量性状中， 纯合CC基因型的猪的肌内脂肪含量显著大 于杂合AC基因型的猪的肌内脂肪含量， 杂合AC基因型的猪的肌内脂肪含量显著大于纯合AA 基因型猪的肌内脂肪含量， 纯合CC基因型猪的肌内脂肪含量比纯合AA基因型猪的肌内脂肪 含量高约1.25(P0.001)。 0065 结果表明， 本发明用GenBank Accession Number为NC_010454.3的序列自5 末端 起第38240位单核苷酸多态性鉴定猪的肌内脂肪含量的结果与猪的肌内脂肪含量的实际测 定结果一致。 在实际的猪育种中， 为获得更高肌内脂肪含量的猪， 最好选择纯合CC基因型的 猪进行育种。 说明书 5/5 页 7 CN 104278027 B 7 0001 序列表 1/2 页 8 CN 104278027 B 8 0002 序列表 2/2 页 9 CN 104278027 B 9 图1 说明书附图 1/1 页 10 CN 104278027 B 10 。