表达嗜热糖化酶的工程菌及其应用.pdf

本发明公开了表达嗜热糖化酶的工程菌及其应用。该工程菌是是将黑曲霉的糖化酶基因灭活，并将硫磺矿硫化叶菌的糖化酶基因插入到黑曲霉的基因组中，筛选得到表达嗜热糖化酶的重组工程菌；黑曲霉的糖化酶基因具有GENBANK Accession Number为AM270061.1的5′端第92183-94360位核苷酸序列；所述硫磺矿硫化叶菌的糖化酶基因具有GENBANK Accession Number为AE006718的5′端第6228-8096位核苷酸序列。利用该工程菌株可直接发酵得到嗜热糖化酶，表达量高达3000U/ml发酵液，生产成本低，生产的糖化酶容易分离和纯化。

1、  表达嗜热糖化酶的工程菌，是将黑曲霉(Aspergillus niger)的糖化酶基因灭活，并将表达硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)的糖化酶基因的表达盒导入到黑曲霉(Aspergillus niger)的基因组中，筛选得到表达嗜热糖化酶的重组工程菌；
所述黑曲霉(Aspergillus niger)的糖化酶基因具有GENBANK Accession Number为AM270061.1的5′端第94354—92183位核苷酸序列；所述硫磺矿硫化叶菌(sulfolobussolfataricus)的糖化酶基因具有GENBANK Accession Number为AE006718的5′端第6228—8096位核苷酸序列。

2、  根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述表达硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)的糖化酶基因的表达盒中还含有乙酰氨酶基因；所述乙酰氨酶基因具有自GENBANK号为AM270228.1的的5′端第31228-33207位核苷酸序列。

3、  根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述将黑曲霉(Aspergillus niger)的糖化酶基因灭活的方法是基因敲除的方法。

4、  根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述可表达嗜热糖化酶的工程菌为黑曲霉(Aspergillus niger)WW1 CGMCC No.2841。

5、  权利要求1-4中任意所述的可表达嗜热糖化酶的工程菌在生产嗜热糖化酶中的应用。

6、  根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述生产嗜热糖化酶的方法，是将权利要求1-4中任意一项所述的工程菌发酵得到嗜热糖化酶。

表达嗜热糖化酶的工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及表达嗜热糖化酶的工程菌及其应用。
背景技术
糖化酶，系统名为α-1，4-葡聚糖葡萄糖水解酶(α-1，4-glucan-glucohydrolase)，又名葡萄糖淀粉酶(glucoamylase)，是一种外切型糖苷酶。它能够从淀粉、糖原或寡聚麦芽糖的非还原性末端释放α-D-葡萄糖。糖化酶的底物专一性较低，除了能从非还原性末端依次水解α-1，4-糖苷键，还可以水解α-1，6-糖苷键，因此能将支链淀粉全部水解成葡萄糖。此外，糖化酶还能微弱水解α-1，3-连接的碳链，它一般都能将淀粉百分百地水解生成葡萄糖。因此糖化酶是淀粉糖化发酵生产酒精、葡萄糖浆的主要酶类。
现国内外葡萄糖生产大多采用酶法，酶法制糖工艺一般采用两步法。第一步用α-淀粉酶将淀粉水解成低分子量的糊精，称为液化；第二步用糖化酶将糊精水解成葡萄糖，称为糖化。浓度较高的淀粉液糊化时，必须迅速液化，否则淀粉液粘度上升使设备无法运行，已糊化的淀粉在温度降低后会发生老化而无法液化，目前制糖工艺广泛采用喷射液化，喷射温度一般在105～108℃，现在使用的α-淀粉酶主要为来源于地衣芽孢杆菌的耐高温α-淀粉酶，最适作用温度90℃以上，最适pH为5.5～7.0。但是糖化酶的最适作用温度、pH等均与淀粉酶不同，因此需要调整温度和pH后才能进入糖化过程。
糖化酶在微生物中的分布很广，属于糖苷水解15(GH15)蛋白质家族，至今已有近40个来源于丝状真菌、酵母菌、真细菌和古菌的开放阅读框被划分到此家族。目前我国常用的是黑曲霉的糖化酶，最适pH4.5，最适温度60℃，因此液化完成后，需将液化淀粉冷却至55～60℃，pH调至4.5～5.0后，加入适量的糖化酶。保持糖化48h左右，糊精就基本上转化成葡萄糖。有时为了缩短糖化时间，在糖化过程中，常常采用高温(88-100℃)，这就要求有耐高温的酶系来参与糖化作用。
目前，已从许多微生物中分离出多种类型的耐高温的糖化酶，有关糖化酶的热稳定性报告很多。Zeikus等发现Clostridium thermohydro-sulfuricum糖化酶在50％的淀粉溶液中，70℃下酶完全稳定，而且在10％酒精液中仍很稳定，即使在85℃下处理1h其酶活性仍保持50％，而且这种酶不受Ca²⁺，EDTA和α-，β-，γ-环状糊精的影响。Tomoko.TAKAHASHI等报道来自于A.saitoi的糖化酶GLUMI在50℃以上仍保持其全部活性，但该酶的活性易受Hg²⁺的抑制。陈冠军等报道从黑曲霉As3.4809变异株B-11发酵液中获得的3种类型糖化酶GI，GII，GIII，其最适温度均为70℃。α-环状糊精在60℃下可使糖化酶的热稳定性提高。一般糖化酶都具有较窄的pH值适应范围，但最适pH一般为4.5～6.5。Tomoko.TAKAHAS HI等报道来自于A.saitoi的糖化酶GLUMI其最适pH范围为2.5～7.5，最适pH为4.5。Hyun H H等曾报道A.niger产生的糖化酶pH值稳定范围为2～11。Mi-Sun Kim等报道来自于sulfolobus solfataricus的糖化酶基因在大肠杆菌中表达后重组蛋白的最适温度为90℃，最适pH5.5～6.0。Bjarne Ronfeldt Nielsen等发现在酵母中表达的重组Talaromyces emersonii葡糖淀粉酶的T1/2在70℃下约为110分钟。
硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)属于泉古菌中的极端嗜热菌，首次分离于意大利的一个硫磺矿热泉中，形态为球状，有叶状分裂，嗜热嗜酸，最佳生长温度为80℃，最适pH值为3.0，兼性自养，可以硫磺或其他简单有机物为养分。作为研究古菌的模式菌，sulfolobus solfataricus P2的基因组全序列测定于2001年已经全部完成，其基因组为2,992,245bp，编码2977个蛋白。这些蛋白有三分之一是硫磺矿硫化叶菌所特有，40％是古菌所特有，12％与细菌有同源性，2％与真菌有同源性。
丝状真菌作为转化的宿主菌，有许多其他微生物如细菌、酵母等不可比拟的优点：1)丝状真菌具有很强的分泌胞外蛋白的能力，而细菌表达的重组蛋白往往以无活性的、难溶的包含体形式存在；2)当细菌表达外源真核基因时，因其翻译和转录不同于真核生物，因此即便真核基因转入细菌，也有可能不表达，但丝状真菌不存在类似的情况；3)丝状真菌能对表达蛋白进行正确的翻译后加工，包括肽链的剪切和糖基化等翻译后加工；4)丝状真菌具有像细菌一样的快速繁殖能力和短的生活周期，比动植物的细胞培养要简单；5)许多丝状真菌，如黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillu oryzae)等长期被用在食品工业，被公认是安全的；6)丝状真菌具有成熟的发酵工艺和后处理工艺。由此可以看出，丝状真菌是一个具有吸引力的异源基因表达系统。尤其是今年来，随着丝状真菌转化技术的迅猛发展，许多丝状真菌被应用到工业、农业、医药行业中，生产出了许多真菌或非真菌来源的重组蛋白，如葡糖淀粉酶(glucoamylase)、牛凝乳酶原(bovine chymosin)、人体乳铁蛋白(human lact2oferrin)、鸡蛋清溶菌酶(hen egg-white lysozyme)和人体白细胞介素6(humaninterleukin-6)等。
发明内容
本发明的目的是提供表达嗜热糖化酶的工程菌及其应用。
本发明所提供的表达嗜热糖化酶的工程菌，是将黑曲霉(Aspergillus niger)的糖化酶基因灭活，并将表达硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)的糖化酶基因的表达盒插入到黑曲霉(Aspergillus niger)的基因组中，筛选得到表达嗜热糖化酶的重组工程菌；所述黑曲霉(Aspergillus niger)的糖化酶基因具有GENBANK Accession Number为AY250996的5′端1052-4252位核苷酸序列；所述硫磺矿硫化叶菌(sulfolobussolfataricus)的糖化酶基因具有GENBANK Accession Number为AE006718.1的5′端第6228-8096位核苷酸序列。
所述表达硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)的糖化酶基因的表达盒中还含有乙酰氨酶基因；所述乙酰氨酶基因具有自GENBANK号为AM270228.1的的5′端第31228-33207位核苷酸序列。
上述将黑曲霉(Aspergillus niger)的糖化酶基因灭活可通过基因突变、基因转换(GeneConversion)、基因破坏(gene desruption)、同源重组等技术实现。具体可利用基因敲除的方法将所述黑曲霉(Aspergillus niger)的糖化酶基因用潮霉素基因替换；随后潮霉素基因又被表达硫磺矿硫化叶菌的嗜热糖化酶基因和乙酰胺酶基因的表达盒替换。
所述黑曲霉(Aspergillus niger)可为黑曲霉(Aspergillus niger)菌株CICC 2204(购自工业微生物菌种保藏管理中心，目录号为2204)。
所述表达嗜热糖化酶的专用工程菌优选为黑曲霉(Aspergillus niger)WW1CGMCC No.2841。
所述黑曲霉(Aspergillus niger)WW1 CGMCC No.2841，已于2008年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC No.2841。
所述黑曲霉(Aspergillus niger)WW1 CGMCC No.2841在查氏固体培养基上生长为菌落初白色，后变褶皱状。生长最适温度30℃。
所述黑曲霉(Aspergillus niger)WW1 CGMCC No.2841最适培养基为查氏培养基；培养温度为30～33℃，所表达糖化酶最适温度为90℃，最适pH值6.0。
上述工程菌可用于生产嗜热糖化酶，具体方法是将上述的表达嗜热糖化酶的专用工程菌发酵得到嗜热糖化酶。
本发明的表达嗜热糖化酶的专用工程菌，去掉黑曲霉本身的糖化酶α-1，4和α-1，6葡萄糖苷键水解活性，代替以硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)糖化酶基因，使黑曲霉表达硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)糖化酶，表达的糖化酶最适温度为90℃的糖化酶，其最适pH范围也提高至6.0，表达量达到3000U/ml发酵液(1h水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖的酶量，即为一个酶活力单位)，从而实现耐热性能好且最适pH值提高的糖化效率高的糖化酶在丝状真菌中的表达，降低了生产成本，并且增加了表达的糖化酶的安全性。
本发明表达嗜热糖化酶的专用工程菌用潮霉素置换黑曲霉的糖化酶，随后潮霉素基因又被硫磺矿硫化叶菌的嗜热糖化酶基因及乙酰胺酶基因替换；可在只含有乙酰胺为碳源供给的培养基上生长，这样方便了工程菌阳性转化子的筛选和纯化，并且不会引入过多的抗生素标签，更提高了本发明的工程菌的安全性。
本发明的方法利用上述工程菌发酵生产嗜热糖化酶，生产成本低，生产的糖化酶容易分离和纯化等特点。该工程菌生产的嗜热糖化酶，表达量高达3000U/ml发酵液，具有较高的最适温度与最适pH，二者都与目前工业常用的来源于地衣芽孢杆菌的耐高温淀粉酶相近，如使用该重组酶用于酒精工业在糖化工艺时可以不用降温，节省了能源。
附图说明
图1为黑曲霉糖化酶(glaA)基因敲除载体pEasy-glaA^dir的构建过程
图2为pWW的结构示意图
图3为重组糖化酶的最适pH检测结果
图4为重组糖化酶的最适温度检测结果
图5为重组糖化酶的热稳定性检测结果
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
本发明中“葡萄糖化酶”定义：葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase，EC.3.2.1.3)，又称γ-淀粉酶，简称糖化酶，糖化酶是由一系列微生物分泌的，具有外切酶活性的胞外酶。糖化酶的主要作用是水解淀粉、糊精、糖原等碳链上的α-D-1，4葡萄糖苷键和α-D-1，6葡萄糖苷键。将葡萄糖一个一个水解下来，而得到终产物β-D-葡萄糖。糖化酶也能微弱的水解α-D-1，3葡萄糖苷键，但水解α-D-1，4葡萄糖苷键的速度最快。
实施例1、可表达嗜热糖化酶的工程菌的构建
一、黑曲霉菌株CICC2204(购自工业微生物菌种保藏管理中心，目录号为2204)的glaA基因敲除工程菌的构建
1、黑曲霉糖化酶(glaA)基因5′侧翼序列及3′侧翼序列的克隆
根据NCBI上公布的糖化酶基因(具有GENBANK Accession Number为AM270061.1的5′端第94354—92183位核苷酸序列)及其上下游序列设计引物：
glaA的5′端侧翼序列的引物：
G1A5’FR1’F：5′-CAAGTATATGATGCGGTAGTGG-3′；
G1A5’FR1’R：5′-TGCTGAGGTGTAATGATGCTGG-3′。
glaA的3′端侧翼序列的引物加XhoI及ApaI酶切位点：
Hyg-G1A3’FR3’F：5’-CTCGAGACAATCAATCCATTTCGCTAT-3’
Hyg-G1A3’FR3’R：5’-GGGCCCTAACTCCGCGGAGGCTCATGG-3’
以黑曲霉菌株CICC2204(购自工业微生物菌种保藏管理中心，目录号为2204)的基因组DNA作为模板，分别以G1A5’FR1’F及G1A5’FR1’R序列为引物；Hyg-G1A3’FR3’F及Hyg-G1A3’FR3’R序列为引物进行PCR扩增得到糖化酶5′侧翼序列，3′侧翼序列。
上述PCR扩增条件均为：预变性94℃5分钟，再进行25个循环：变性94℃，30秒、退火56℃，1分钟、延伸72℃，2分，72℃，延伸10分钟。
上述glaA的5′端侧翼序列的引物(G1A5’FR1’F及G1A5’FR1’R)PCR扩增得到1.5kb的扩增产物，经测序表明该产物即为glaA的5′端侧翼片段(自GENBANK号为AM270061.1的5′端第95854-94355位核苷酸)，将该片段命名为glaA5′FR。
上述引物对Hyg-G1A3’FR3’F及Hyg-G1A3’FR3’R PCR扩增得到约1.5kb产物，经测序表明该扩增片段为glaA的3′端侧翼片段，将其命名为glaA3′FR，该产物具有自GENBANK号为AM270061.1的5′端第92182-90683位核苷酸。
2、黑曲霉糖化酶(glaA)基因敲除载体的构建
根据质粒pSecTag2/Hygro A(购自invitrogen公司)上潮霉素表达框序列设计以下引物：
Hyg序列引物两端加NotI酶切位点：
G1A5’FR-Hyg2’F：5’-GCGGCCGCGATGAAAAAGCCTGAACTCACCG-3’
G1A5’FR-Hyg2’R：5’-GCGGCCGCGCTATTCCTTTGCCCTCGGACGA-3’
以G1A5’FR-Hyg2’F和G1A5’FR-Hyg2’R为引物，以质粒pSecTag2/Hygro A(购自invitrogen公司)为模板，扩增潮霉素基因表达框。
扩增条件为：预变性94℃5分钟，再进行25个循环：变性94℃，30秒、退火56℃，1分钟、延伸72℃，2分，72℃，延伸10分钟。
PCR扩增得到约1.0kb片段，经测序表明其核苷酸序列为序列表中序列1，为潮霉素基因，将其命名为HYG。
将上述扩增得到的1.5kb glaA5′FR克隆到T载体pEasy-T1(购自全式金公司)上，经PCR扩增、酶切鉴定及测序验证，将验证正确含有1.5kb glaA5′FR的重组载体命名为pET-5′FR1。将上述扩增得到的1.0kb HYG克隆到T载体pEasy-T1(购自全式金公司)上，经PCR扩增、酶切鉴定及测序验证，将验证正确含有HYG的重组载体命名为pET-Hyg。将上述扩增得到的1.5kb glaA3′FR克隆到T载体pEasy-T1(购自全式金公司)上，经PCR扩增、酶切鉴定及测序验证，将验证正确含有glaA3′FR的重组载体命名为pET-3′FR1。
黑曲霉糖化酶(glaA)基因敲除载体的构建过程如图1所示，将pET-Hyg用NotI酶切后，回收得到的1.0kb片段，将该片段插入到pET-5′FR1的NotI酶切位点得到重组载体，进行酶切和测序验证，将经验证表明含有Hyg和glaA5′FR片段的重组载体命名为pET-5′FR1-Hyg。将pET-3′FR1用XhoI及ApaI酶切，回收1.5kb片段，插入到pET-5′FR1-Hyg的XhoI和ApaI酶切位点之间，得到重组载体，将该重组载体进行酶切和测序验证，将经验证表明含有依次连接的glaA5′FR、Hyg和glaA3′FR片段的重组载体命名为pEasy-glaA^dir(图1)，该载体即为黑曲霉菌株CICC 2204(购自工业微生物菌种保藏管理中心，目录号为2204)糖化酶基因敲除载体。
3、黑曲霉菌株CICC 2204(购自工业微生物菌种保藏管理中心，目录号为2204)敲除糖化酶(glaA)基因的菌株668-glaA^dir的构建
用HindIII消化10微克的质粒pEasy-glaA^dir，在0.8％的琼脂糖凝胶上分离线性DNA，并且通过琼脂糖凝胶电泳分离出HindIII线性化的pEasy-glaA^dir质粒DNA片段，胶回收该片段。
将上述分离得到的pEasy-glaA^dir质粒线性DNA进行原生质体转化到黑曲霉菌株CICC 2204(购自工业微生物菌种保藏管理中心，目录号为2204)中去。转化方法见文献(姚婷婷，王正祥.黑曲霉原生质体的制备、再生及转化条件.食品与生物技术学报，2006年25卷04期)，具体步骤如下所示：
A、将黑曲霉菌株CICC 2204(购自工业微生物菌种保藏管理中心，目录号为2204)用查氏固体培养基培养，挑取包含有培养基的4cm²左右大小的单菌落，和培养基一起放入内含60ml查氏液体培养基的三角瓶中，30℃ 200rpm摇床培养4天，收集菌丝体；
B、用1M山梨醇溶液洗步骤A得到得菌丝体一次，称取湿重，按照质量体积比为1g：10ml加酶裂解液，30℃，80rpm轻微摇床酶解，血球计数板检测原生质体的形成数量并确定酶解时间，得到原生质体液；
C、将原生质体液过滤，收集滤液，4℃下3200rpm离心10min，弃上清液，分别用预冷的0.6M KCl溶液和S/C溶液洗涤沉淀、离心，原生质体沉淀重悬于适量S/C溶液，使原生质体浓度达到1-3×10⁶个/ml，置冰浴备用；
D、取100ul步骤C得到的原生质体悬液，加入约1-10ug的线性化质粒(10ul)pEasy-glaA^dir，用枪头轻轻吹吸混匀，加入50ul PEG溶液，轻轻颠倒混匀，冰浴20分钟；
同时分别取100ul步骤C得到的原生质体，分别加入ddH₂O(10ul)，分别用枪头轻轻吹吸混匀并加入50ulPEG溶液，轻轻颠倒混匀，冰浴20分钟；
E、取出后转入质粒的与转入ddH₂O的分别缓缓加入1ml PEG溶液，室温放置5分钟后加入2ml S/C溶液，轻轻颠倒混匀，将转入质粒的与转入ddH₂O的分别铺在选择性平板上(含有200ug/ml潮霉素B的基本培养基)，另外转入ddH₂O的铺在对照培养基上作为原生质体对照；30℃培养。
上述步骤中使用的培养基和溶液的配方如下所示：
查氏固体培养基：含1.6％(质量百分含量)的agar，蔗糖3.0％(质量百分含量)，NaNO₃ 0.2％(质量百分含量)，K₂HPO₄ 0.1％(质量百分含量)，7H₂O·FeSO₄ 0.001％(质量百分含量)，7H₂O·MgSO₄ 0.05％(质量百分含量)，KCl 0.05％(质量百分含量)，其余为水；pH5.5-6.0的固体培养基
查氏液体培养基：含蔗糖3.0％(质量百分含量)，NaNO₃ 0.2％(质量百分含量)，K₂HPO₄ 0.1％(质量百分含量)，7H₂O·FeSO₄ 0.001％(质量百分含量)，7H₂O·MgSO₄0.05％(质量百分含量)，KCl 0.05％(质量百分含量)，其余为水，pH5.5-6.0的液体培养基。
基本培养基：含1M蔗糖，K₂HPO₄ 0.1％(质量百分含量)，7H₂O·MgSO₄0.05％(质量百分含量)，7H₂O·FeSO₄ 0.001％(质量百分含量)，KCl 0.05％(质量百分含量)，NaNO₃ 0.2％(质量百分含量)，1％(质量百分含量)的agar，200ug/ml潮霉素B，其余为水的固体培养基。
对照培养基：1M蔗糖，NaNO₃ 0.2％(质量百分含量)，K₂HPO₄ 0.1％(质量百分含量)，7H₂O·FeSO₄ 0.001％(质量百分含量)，7H₂O·MgSO₄ 0.05％(质量百分含量)，KCl 0.05％(质量百分含量)，1％琼脂。
酶裂解液：1％(质量百分含量)蜗牛酶、1％(质量百分含量)纤维素酶、0.1％(质量百分含量)溶菌酶，用1M的山梨醇溶液配置后，用0.45um孔径的膜过滤灭菌。
S/C溶液：含1M山梨醇，50mM CaCl₂的溶液。
PEG溶液：含25％(质量百分含量)PEG8000，50mM CaCl₂，10mM Tris-HCl，pH7.5的溶液。
30℃培养9-10天后在选择性平板上均长出十余个转化子，作为对照的原生质体在对照培养基上长大，说明原生质体的消化没有问题，而在选择性培养基上未长出菌落。挑取选择性平板上的转化子单菌落，接种在含潮霉素B(200ug/ml)的查氏液体培养基中，30℃培养3-4天后，取200ul液体涂布在查氏固体培养基(含潮霉素B200ug/ml)上，连续分离传代2次，含有潮霉素B抗性基因的转化子存活下来。根据glaA的5′端侧翼片段(自GENBANK号为AM270061.1的5′端第95854-94355位核苷酸)，结合其位置及上游序列，设计正向验证引物(该引物位于GENBANK号为AM270061.1的5′端第96180-96161位核苷酸)，
Up glaA 5’FR F：CTATCGTGTTTGTAGCAATG
根据潮霉素序列，设计反向验证引物：
In Hyg 3‘FR R：CTATTTACCCGCAGGACATA
取存活的菌株提取基因组基因，用Up glaA 5’FR F和In Hyg 3‘FR R进行扩增检测，扩增得到2.0kb片段的菌株为PCR检测阳性的菌株。将PCR检测阳性的重组菌株命名为黑曲霉668-glaA^dir。
二、表达硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)SSG(SSG是ssg基因表达的蛋白质)的重组工程菌的获得
1、硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)的糖化酶基因表达载体的构建
1)黑曲霉amdS基因的克隆
根据NCBI上公布的米曲霉乙酰胺酶基因序列与黑曲霉基因组DNA比对选取相似性最大的序列设计引物：
Acetamidase引物带Sca I及Not I酶切位点
PgpdA-amdS 5F：5′-AGTACTATGGCCCTCACATCCTGGGAAC-3′；
amdS-TrpC 5R：5′-GCGGCCGCTCAAGCACTAGCCTTCTTGAATT-3′；
以黑曲霉菌株CICC 2204(购自工业微生物菌种保藏管理中心，目录号为2204)的基因组DNA作为模板，以PgpdA-amdS 5F和amdS-TrpC 5R为引物，进行PCR扩增。
扩增条件为：预变性94℃ 5分钟，再进行25个循环：变性94℃，30秒、退火56℃，1分钟、延伸72℃，2分钟，72℃，延伸10分钟。
扩增得到约1.9kb的DNA片段，回收该片段连接到pEasy-T1(购于全式金公司)载体后测序，经测序表明该扩增片段即为乙酰胺酶基因(自GENBANK号为AM270228.1的5′端第31228-33207位核苷酸序列)，将其命名为amdS，将含有该amdS片段的重组载体命名为pET-amdS。
将质粒pET-amdS用Sca I及Not I双酶切后得到1.9kb的amdS片段备用。
2)PgpdA片段的获得
根据构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gpdA的启动子PgpdA序列设计引物以构巢曲霉(购自工业微生物菌种保藏管理中心，目录号2288)基因组DNA为模板PCR扩增得到2049bp的PgpdA片段，其序列为自GENEBANK号为Z32524.1的5′端第138-2186位核苷酸序列，作为amdS的启动子序列。
引物分别带Bgl II及Sca I酶切位点，引物序列如下所示：
PgpdA-F：AGATCT AGATCTTTCGACACTGAAATAC；
PgpdA-R：AGTACT AGTACTTACTTAGGGGAAATAA。
扩增得到约2.0kb的片段，回收扩增得到的PgpdA片段后连接到pEASY-T1载体上经测序表明正确后，用Bgl II及Sca I双酶切，得到约2.0kb片段，将其命名为PgpdA。
3)TtrpC片段的获得
根据构巢曲霉色氨酸合成基因trpC的终止子TtrpC序列设计引物以构巢曲霉(购自工业微生物菌种保藏管理中心，目录号2288)基因组DNA为模板PCR扩增得到763bp的TtrpC片段，在NCBI的序列自GENEBANK号为X02390.1的5‘端第3406-4168位核苷酸序列，该片段作为amdS的终止子。
引物序列如下所示：
amdS-TtrpC 6F：5′-GCGGCCGC GGATCCACTTAACGTTACTGA-3′；
TtrpC-G1A3’FR 6R：5′-AAGCTT TCGAGTGGAGATGTGGAGTGG-3′；
回收扩增得到的TtrpC片段后用NotI及HindIII双酶切该片段，得到0.76kb片段，经测序验证正确的片段命名为TtrpC。
4)带不同酶切位点的3′FR序列的扩增
以载体pET-3′FR1模板，分别设计以下两对带不同酶切位点的引物，进行PCR扩增。其中带ApaI及BglII酶切位点的引物序列为：
Ssg-G1A3’FR 3F：5′-GGGCCCACAATCAATCCATTTCGCTATA-3′；
G1A3’FR-PgpdA 3R：5′-AGATCTTAACTCCGCGGAGGCTCATGG-3′。
带HindIII及AatII酶切位点引物序列为：
TrpC-G1A3’FR 7F：5′-AAGCTTACAATCAATCCATTTCGCTA-3′；
G1A3’FR 7R：5′-GACGTCTAACTCCGCGGAGGCTCATGG-3′。
扩增条件为：预变性94℃5分钟，再进行25个循环：变性94℃，30秒、退火56℃，1分钟、延伸72℃，2分钟，72℃，延伸10分钟。
扩增得到带有不同酶切位点的1.5kb的3′FR片段。将该扩增得到带有ApaI及BglII酶切位点的3′FR片段命名为3′flank P1片段；将以上扩增得到的带有HindIII及AatII酶切位点的3′FR片段命名为3′flank P2片段。
5)硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)的糖化酶基因的克隆
根据NCBI公布的硫磺矿硫化叶菌P2的ssg基因序列，分析黑曲霉菌株CICC2204(购自工业微生物菌种保藏管理中心，目录号为2204)中糖化酶基因启动子序列，运用融合PCR技术合成含有黑曲霉菌株CICC 2204(购自工业微生物菌种保藏管理中心，目录号为2204)中糖化酶5′端序列(自GENBANK号为AM270061.1的5′端第95854-94355位核苷酸)和硫磺矿硫化叶菌P2的ssg基因序列(具有GENBANKAccession Number为AE006718的5′端第6228—8096位核苷酸序列)的片段，将其命名为5′FR-SSG。其具体获得方法如下所述：
设计Overlap PCR引物序列如下，其中，G1A 5’FR1F带AatII酶切位点，Ssg2R带ApaI酶切位点：
G1A 5’FR1F：5′-GACGTCCAAGTATATGATGCGGTAGTG-3′；
G1A5’FR-ssg1R：
5′-TTCCTATGGAGGAAACTCTCATTGCTGAGGTGTAATGATGCTGG-3′；
G1A5’FR-ssg2F：
5′-CCAGCATCATTACACCTCAGCAATGAGAGTTTCCTCCATAGGAA-3′；
Ssg2R：5′-GGGCCCTTATATATGGTTTAAGAGCT-3′。
以pET-5′FR1为模板，以上述序列(G1A5’FR1F和G1A5’FR-ssg1R)为引物进行PCR扩增，扩增条件为：预变性94℃5分钟，再进行25个循环：变性94℃，30秒、退火56℃，1分钟、延伸72℃，2分钟，72℃，延伸10分钟。得到1.5kb的G1A5′FR片段。
以嗜热古菌硫磺矿硫化叶菌P2(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，目录号1.2371^T)基因组DNA为模板，上述G1A5’FR-ssg2F和Ssg2R为引物，进行PCR扩增，扩增条件为：预变性94℃5分钟，再进行25个循环：变性94℃，30秒、退火56℃，1分钟、延伸72℃，2分钟，72℃，延伸10分钟。PCR得到1.8kb的ssg片段片段。
以上述PCR得到的G1A5′FR及ssg片段为模板，用引物G1A5’FR1F及Ssg2R进行PCR扩增，扩增条件为：预变性94℃5分钟，再进行25个循环：变性94℃，30秒、退火56℃，1分钟、延伸72℃，3分钟，72℃，延伸10分钟。
将PCR扩增得到的3.3kb片段，即为5′FR-ssg，将5′FR-ssg连接至pEasy-T1上经测序及酶切鉴定正确，命名为pET-5′FR-ssg。经测序表明该PCR扩增得到的约3.3kb片段5′FR-ssg具有序列表中序列2的核苷酸序列，自序列表中序列2的5′端第1—1500位为上述黑曲霉菌株CICC2204(购自工业微生物菌种保藏管理中心，目录号为2204)中糖化酶5′端序列，自序列2的5′端第1501—3369位为上述硫磺矿硫化叶菌P2的SSG基因序列。
6)表达硫磺矿硫化叶菌(sulfolobus solfataricus)的糖化酶基因的重组载体的构建
将上述得到的PgpdA片段与经过双酶切的amdS片段连接后得到4034bp片段，与经过NotI及HindIII双酶切获得的TtrpC 763p片段连接后得到4797bp片段。该片段与用ApaI和BglII双酶切后的1.5kb的3′flank P1片段连接后得到6297bp片段，与经HindIII和AatII酶切后的3′flank P2片段(1510bp)连接后得到7797bp片段。
将pET-5′FR-ssg用AatII及ApaI酶切后，与上述得到的7.8kb的片段连接(选择二者在ApaI端连接的方式)，得到11.1kb片段。
将该片段与经过AatII酶切后回收的pGEM-T Vector(购自promega)载体片段连接后得到新的重组表达载体，将该载体进行PCR和测序验证，将验证正确的含有上述11.1kb片段的重组载体命名为pWW(其结构示意图如图2所示)。
2、重组黑曲霉表达载体pWW的转化及转化子的筛选
1)重组黑曲霉表达载体pWW的转化
重组黑曲霉表达载体pWW经AatII完全酶切线性化后，以步骤一的步骤3)制备的菌株黑曲霉668-glaA^dir为出发菌株制备原生质体，进行PEG-原生质体转化，转化方法见文献(姚婷婷，王正祥.黑曲霉原生质体的制备、再生及转化条件.食品与生物技术学报，2006年25卷04期)，具体步骤如下所示：
A、将黑曲霉668-glaA^dir用查氏固体培养基培养，挑取包含有培养基的4cm²左右大小的单菌落，和培养基一起放入内含60ml查氏液体培养基的三角瓶中，30℃200rpm摇床培养4天，收集菌丝体；
B、用1M山梨醇溶液洗步骤A得到得菌丝体一次，称取湿重，按照质量体积比为1g：10ml加酶裂解液，30℃，80rpm轻微摇床酶解，血球计数板检测原生质体的形成数量并确定酶解时间，得到原生质体液；
C、将原生质体液过滤，收集滤液，4℃下3200rpm离心10min，弃上清液，分别用预冷的0.6M KCl溶液和S/C溶液洗涤沉淀、离心，原生质体沉淀重悬于适量S/C溶液，使原生质体浓度达到1-3×10⁶个/ml，置冰浴备用；
D、取100ul步骤C得到的原生质体悬液，加入约1-10ug的线性化质粒(10ul)pWW，用枪头轻轻吹吸混匀，加入50ulPEG溶液，轻轻颠倒混匀，冰浴20分钟；
同时分别取100ul步骤C得到的原生质体，分别加入ddH₂O(10ul)，分别用枪头轻轻吹吸混匀并加入50ulPEG溶液，轻轻颠倒混匀，冰浴20分钟；
E、取出后转入质粒的与转入ddH₂O的分别缓缓加入1ml PEG溶液，室温放置5分钟后加入2ml S/C溶液，轻轻颠倒混匀，将转入质粒的与转入ddH₂O的分别铺在选择平板上(含有10mM乙酰胺和20mM CsCl的基本培养基)，另外转入ddH₂O的铺在对照培养基上作为原生质体对照；30℃培养5-6天。
上述步骤中使用的培养基和溶液的配方如下所示：
查氏固体培养基：含1.6％(质量百分含量)的agar，蔗糖3.0％(质量百分含量)，NaNO₃ 0.2％(质量百分含量)，K₂HPO₄ 0.1％(质量百分含量)，7H₂O·FeSO₄ 0.001％(质量百分含量)，7H₂O·MgSO₄ 0.05％(质量百分含量)，KCl 0.05％(质量百分含量)，其余为水；pH5.5-6.0的固体培养基。
查氏液体培养基：含蔗糖3.0％(质量百分含量)，NaNO₃ 0.2％(质量百分含量)，K₂IIPO₄ 0.1％(质量百分含量)，7H₂O·FeSO₄ 0.001％(质量百分含量)，7H₂O·MgSO₄0.05％(质量百分含量)，KCl 0.05％(质量百分含量)，其余为水，pH5.5-6.0的液体培养基。
基本培养基：含1M蔗糖，K₂HPO₄ 0.1％(质量百分含量)，7H₂O·FeSO₄ 0.001％(质量百分含量)，7H₂O·MgSO₄ 0.05％(质量百分含量)，KCl 0.05％(质量百分含量)，10mM乙酰胺，20mM CsCl和1％(质量百分含量)琼脂的固体培养基。
对照培养基：1M蔗糖，NaNO₃ 0.2％(质量百分含量)，K₂HPO₄ 0.1％(质量百分含量)，7H₂O·FeSO₄ 0.001％(质量百分含量)，7H₂O·MgSO₄ 0.05％(质量百分含量)，KCl 0.05％(质量百分含量)，1％琼脂。
酶裂解液：1％(质量百分含量)蜗牛酶、1％(质量百分含量)纤维素酶、0.1％(质量百分含量)溶菌酶，用1M的山梨醇溶液配置后，用045um孔径的膜过滤灭菌。
S/C溶液：含1M山梨醇，50mM CaCl₂的溶液。
PEG溶液：含25％(质量百分含量)PEG8000，50mM CaCl₂，10mM Tris-HCl，pH7.5的溶液。
2)转化子的筛选
AmdS基因编码乙酰胺酶基因，该酶能够作用于乙酰胺，分解乙酰胺为乙酸及铵，作为细胞生长的碳源。该基因在黑曲霉菌株CICC 2204(购自工业微生物菌种保藏管理中心，目录号为2204)内微弱表达，同时内源性的乙酰胺酶的微弱表达可以通过加入20mM CsCl得到抑制。通过在只含有乙酰胺为碳源供给的培养基上生长从而筛选出发生同源重组的阳性克隆，稳定的转化体表现为优势生长且菌落逐渐增大。黑曲霉菌株CICC 2204原生质体在基本培养基上生长作为对照，对照能够长大说明原生质体的消化没有问题，而黑曲霉菌株CICC 2204原生质体在选择性培养基上(含有10mM乙酰胺和20mM CsCl的基本培养基)未长出或长出较小的菌落但不能继续生长，在选择培养基上能够生长的上述得到的转化子即为阳性转化子。挑取步骤1)获得的转化子，在含有10mM乙酰胺和20mM CsCl的基本培养基(含1M蔗糖，K₂HPO₄ 0.1％(质量百分含量)，7H₂O·FeSO₄ 0.001％(质量百分含量)，7H₂O·MgSO₄ 0.05％(质量百分含量)，KCl 0.05％(质量百分含量)，10mM乙酰胺，20mM CsCl和1％(质量百分含量)琼脂的固体培养基)，30℃培养筛选2次，得到阳性转化子。
为了将阳性转化子进行鉴定，根据glaA的5′端侧翼片段(自GENBANK号为AM270061.1的5′端第95854-94355位核苷酸)，结合其位置及上游序列，设计正向验证引物(该引物位于GENBANK号为AM270061.1的5′端第96180-96161位核苷酸)，
Up glaA 5’FR F：5′-CTATCGTGTTTGTAGCAATG-3′
根据硫磺矿硫化叶菌的糖化酶基因(具有GENBANK Accession Number为AE006718的5′端第6228—8096位核苷酸序列)合成反向验证引物，
In Ssg R：5′-CTATATATAATACAGTAGTTTC-3′
提取菌株黑曲霉668-glaA^dir及转化子的基因组DNA，进行PCR分子鉴定，用引物Up glaA 5’FR F和In Ssg R进行扩增检测，扩增得到2047bp片段的菌株为PCR检测阳性的菌株，结果筛选得到PCR检测阳性的正确的转pWW菌株。而对照菌未扩增到目的条带。
3)转化子嗜热糖化酶酶活测定
分别挑取上述转化子的单克隆包含有培养基的4cm²左右大小的单菌落，和培养基一起放入分别转接至装有100ml摇瓶培养基(豆饼粉2％(质量百分含量)，玉米浆2％(质量百分含量)，玉米淀粉12％(质量百分含量)，其余为水)的500ml三角瓶中，同时取原始菌菌株黑曲霉668-glaA^dir作为对照，30℃下摇培4天，取发酵液上清液分别测试糖化酶活性。
嗜热糖化酶酶活测定方法如下所述：
分别吸取1ml发酵液上清液，移入容量瓶中，分别用缓冲液稀释至10ml刻度，100ml刻度，1000ml刻度(稀释程度根据酶活的高低而定，浓度越高，稀释倍数应越大)充分摇匀，作为样品待测。制备待测酶液时，样液浓度应控制在滴定空白和样品时消耗0.05mol/L硫代硫酸钠标准滴定溶液的差值在4.5ml～5.5ml，范围内(酶活力约为120U/ml～150U/ml)。
取A、B两支50ml比色管，分别加入25ml20g/L可溶性淀粉溶液和5ml0.05mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH6.0)，摇匀。于80±0.2℃的恒温水浴中预热5min～10min。在B管中加入2.0ml上述待测液，摇匀，立即记时。在此温度下准确反应30min后，立即向A、B两管中各加0.2ml200g/L氢氧化钠溶液，摇匀，同时将两管取出，迅速用水冷却，并于A管中补加2.0ml上述待测液(作为空白对照)。
吸取上述A、B两管中的反应液各5.0ml，分别于两个碘量瓶中，准确加入0.1mol/L碘标准液(按GB/T601配制与标定)10.0ml，再加15ml0.1mol/L氢氧化钠溶液，边加边摇匀，并于暗处放置15min，取出。用水淋洗瓶盖，加入2mol/L硫酸溶液2ml，用0.05mol/L硫代硫酸钠标准滴定溶液(按GB/T601配制与标定)滴定蓝紫色溶液，直至刚好无色为其终点，分别记录空白和样品消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积(V_A、V_B)。
嗜热糖化酶活力单位：1ml酶液或1g酶粉在80℃、pH6.0的条件下，1h水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为一个酶活力单位，符号为：U/ml(或U/g)。
酶活力单位按式(1)计算：
X＝(V_A-V_B)×c×90.05×32.2/5×1/2×n×2＝579.9×(V_A-V_B)c×n...........(1)
式中：
X——样品的酶活力单位，单位为酶活力单位每毫升(U/ml)或酶活力单位每克(U/.g)；
V_A——滴定空白时，消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升(mL)；
V_B——滴定样品时，消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升(mL)；
c——硫代硫酸钠标准滴定溶液的准确浓度，单位为摩尔每升(mol/L)；
90.05——葡萄糖的摩尔质量，单位为克每摩尔(g/mol)；
32.2——反应液的总体积，单位为毫升(mL)；
5——吸取反应液的体积，单位为毫升(mL)；
1/2——折算成1mL酶液的量；
n——稀释倍数；
2——反应30min，换算成1h的酶活力系数。
以样品测定结果的算术平均值表示，修约至三位有效数字。
结果的允许差：在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的10％，以大于这两个测定值的算术平均值10％的情况下不超过5％为前提。
结果表明，原始菌菌株黑曲霉668-glaA^dir的嗜热糖化酶酶活为零，因为原始菌种不存在硫磺矿硫化叶菌的嗜热糖化酶基因，而其自身的糖化酶也被敲除。这与我们预期的一致。所测定的10个阳性转化子活力各有不同，其中一个菌株产生的酶活最高，酶活为3000U/ml。
将该菌株命名为黑曲霉(Aspergillus niger)WW1。该黑曲霉(Aspergillus niger)WW1，已于2008年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC No.2841。
上述酶活测定使用的试剂的配制方法如下所述：
0.05mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液(pH6.0)：称取乙酸钠(CH₃COONa·3H₂O)6.7g，用水溶解并定容至1000ml。上述缓冲液的pH值应吸取冰乙酸(约0.5ml-1ml)使用酸度计加以校正。
20g/L可溶性淀粉溶液：称取可溶性淀粉(2±0.001)g，然后用少量水调匀，缓缓倾入已沸腾的水中，煮沸、搅拌直至透明，冷却，用水定容至100ml。此溶液需当天配制。
实施例2、大量制备嗜热糖化酶
1、培养基配制
菌种活化培养基：蔗糖3.0％(质量百分含量)，K₂HPO₄ 0.1％(质量百分含量)，7H2O·FeSO4 0.001％(质量百分含量)，7H2O·MgSO4 0.05％(质量百分含量)，KCl 0.05％(质量百分含量)，10mM乙酰胺和20mM CsCl，其余为水，调节pH至5.5-6.0，121℃灭菌30min。
一级种子培养基：豆饼粉3％(质量百分含量)，玉米浆2.5％(质量百分含量)，玉米淀粉15％(质量百分含量)，高温淀粉酶(诺维信利可来耐高温淀粉酶Supra批号：NBSG4213)12U/克玉米淀粉80℃处理30min，聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚(Polyoxyethylene Polyoxypropylene PentaerythritolEther-PPE)0.05％(质量百分含量)，其余为水，121℃灭菌30min。
发酵培养基：玉米淀粉20％(质量百分含量)，豆饼粉5％(质量百分含量)，玉米浆3％(质量百分含量)，硫铵0.8％(质量百分含量)，氯化钙0.05％(质量百分含量)，高温淀粉酶(诺维信利可来耐高温淀粉酶Supra批号：NBSG4213)12U/克玉米淀粉80℃处理30min，聚氧乙烯聚氧丙烯季戊四醇醚(Polyoxyethylene Polyoxypropylene Pentaerythritol Ether-PPE)0.05％(质量百分含量)，其余为水，121℃灭菌30min。
2、发酵制备嗜热糖化酶
种子培养：将黑曲霉(Aspergillus niger)WW1接种到菌种活化培养基(查氏培养基)活化，从平板上挑单菌落，接入到一级种子培养基(100ml/500ml三角瓶)中，30℃，150r/min培养2d，镜检并涂平板检测是否污染。
高密度发酵：种子在一级种子培养基培养后，按体积比为10％的接种量接到装有2.5L发酵培养基的5L发酵罐中，30℃，200转/分(发酵罐为上海保兴生物设备工程有限公司，型号：BIOTECH-5BG)的搅拌速度进行发酵培养，约16小时后，开始用质量百分浓度为25％的氨水调节pH，使发酵液的pH控制在4.2-4.5。通过调节转速、罐压和空气流量，速度使溶氧大于20％，培养120小时左右。培养过程中定时取样观察细胞生长情况以及酶活。酶活测定方法按照实施例1的步骤二中步骤2的步骤3)所述的嗜热糖化酶活性测定方法进行。结果表明，黑曲霉(Aspergillus niger)WW1CGMCC No.2841嗜热糖化酶酶活为3000U/ml。
实施例3、糖化酶的酶学性质研究
1、最适pH的检测
用工程菌黑曲霉(Aspergillus niger)WW1CGMCC No.2841的发酵上清液进一步初步研究重组酶活性与pH的关系，取阳性转化子发酵140h的培养液上清液，改变缓冲液的pH值(pH2.3～pH7.0)，测定酶活，酶活测定其余条件按照实施例1的步骤二中步骤2的步骤3)所述的嗜热糖化酶活性测定方法进行，将酶活最高者的相对酶活定为100％，其余的酶活与最高酶活比值为其相对酶活。
结果如图3所示，由图3可见重组酶的最适pH为6.0。目前酒精工业生产中淀粉液化时使用的高温淀粉酶的最适pH值也为pH6.0，如在糖化时使用该酶可省去调pH一步，节省了成本。
2、酶反应温度的检测
将摇瓶培养的阳性转化子140h的培养上清液，在不同的反应温度下测定酶活，酶活测定其余条件按照实施例1的步骤二中步骤2的步骤3)所述的嗜热糖化酶活性测定方法进行，将酶活最高者的相对酶活定为100％，其余的酶活与最高酶活比值为其相对酶活。
结果如图4所示，重组酶最适温度的检测结果表明(图4)：重组酶的最适温度为90℃，100℃时仍有活性。其最适温度与目前工业常用的来源于地衣芽孢杆菌的耐高温淀粉酶相近，如使用该重组酶用于酒精工业在糖化工艺时可以不用降温，节省了能源。
3、酶稳定性检测
取摇瓶培养的阳性转化子140h的培养上清液，在60℃、80℃和100℃下分别保温0、10、20、30、60min，迅速冷却到室温，按照实施例1的步骤二中步骤2的步骤3)所述的嗜热糖化酶活性测定方法进行测定残余酶的活性，以未保温的酶液的酶活为100％。其余的酶活与以未保温的酶液的酶活的比值为相对酶活。
重组酶最适温度的检测结果表明如图5所示：重组酶在80℃时，酶活力半衰期在60min以上；100℃酶活降低较快，保温10min后酶活力仍高于60％，保温60min后残余酶活力为28％。从该糖化酶基因上来看，该酶存在有糖基化位点，而且在该古生菌中存在有糖基化酶，因此该酶可能存在糖基化。故而更适于在真菌表达系统中表达优化。
序列表
<160>2
<210>1
<211>1026
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1

<210>2
<211>3369
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2