腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法 【技术领域】
本发明属于生物技术领域， 具体涉及到一种腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法。 背景技术 腺病毒有三种核心蛋白， 分别为 pVII、 pV 和 mu。 这些核心蛋白与腺病毒基因组 DNA 结合， 在腺病毒感染细胞后， 核心蛋白会随着病毒基因组 DNA 进入细胞核。因此， 如果对腺 病毒的核心蛋白进行荧光蛋白的标记则可以观察到病毒感染细胞的整个过程。
由于腺病毒基因组 DNA 核心蛋白基因区域没有合适的限制性内切酶的位点， 因此 通过同源重组的方法对腺病毒核心蛋白进行成功的彻底的遗传标记非常困难。 目前研究报 道标记核心蛋白的方法是在不删除腺病毒基因组原有的核心蛋白基因的前提下， 在腺病毒 基因组 E3 区域插入 CMV 启动子启动的核心蛋白 - 荧光蛋白基因表达元件， 通过这种方法研 究获得了荧光标记核心蛋白的腺病毒。 经过该方法标记的腺病毒基因组同时编码野生型核 心蛋白和荧光标记的核心蛋白， 这两种蛋白要竞争结合到腺病毒基因组 DNA 上， 荧光标记 后的核心蛋白由于分子量和蛋白体积变大， 很难与野生型核心蛋白竞争， 因此荧光蛋白标 记的核心蛋白结合到病毒基因组 DNA 上的效率很低， 这样得到病毒大部分是未经标记或部 分标记的病毒颗粒。
发明内容
本发明所要解决技术问题在于克服上述荧光蛋白标记的核心蛋白结合到病毒基 因组 DNA 上效率很低的缺点， 提供一种能快速、 腺病毒核心蛋白完全能够标记的腺病毒核 心蛋白遗传标记载体的构建方法。
解决上述技术问题采用的技术方案它是由下述步骤组成 ：
1、 构建向腺病毒基因组核心蛋白 DNA 序列 3’ 端引入一个酶切位点的穿梭载体
采用酶切连接的方式将合成的 DNA 片段连入 pUC19 质粒载体， pUC19 质粒载体为 市场上销售的商品， 由英国 NEB 公司生产， 获得的阳性克隆命名为 pUG19M， 采用聚合酶链式 反应扩增核心蛋白 DNA 序列上下游序列， 将获得的核心蛋白上下游 DNA 片段连入 pUC19M 载 体； 将含有一个酶切位点的筛选基因连入含有核心蛋白上下游序列的 pUC19M 载体， 获得向 腺病毒基因组核心蛋白 DNA 序列 3’ 端引入一个酶切位点的穿梭载体。
2、 引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体
将步骤 1 中获得的腺病毒基因组核心蛋白 DNA 序列 3’ 端引入一个酶切位点的穿 梭载体经双酶切回收后与重组腺病毒载体质粒共转化 Bj5183 感受态细胞， 经过鉴定后获 得引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体。
3、 构建标记基因标记核心蛋白穿梭载体
采用聚合酶链式反应获得标记基因的 DNA 序列， 将标记基因序列连入含有核心蛋 白上下游序列的 pUC19M 载体， 经过鉴定获得标记基因标记核心蛋白的穿梭载体 ；4、 构建标记基因标记核心蛋白腺病毒质粒载体
将步骤 3 中获得的标记基因标记核心蛋白的穿梭载体经双酶切回收后与经过线 性化的引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体共转化 Bj5183 感受态细胞， 经过鉴定后获得 标记基因标记核心蛋白的腺病毒质粒载体。
5、 标记基因标记核心蛋白腺病毒的包装及纯化
将线性化的标记基因标记核心蛋白腺病毒质粒载体转染 HEK293 细胞， 扩增、 分 离、 纯化， 得到标记基因标记核心蛋白的腺病毒， 在冰箱内 -80℃保存。
本发明的穿梭载体为任何含有核心蛋白开放阅读框上下游 800bp ～ 10kb DNA 序 列的任何载体。
本发明的筛选基因包括抗性基因或 β- 半乳糖苷酶基因。
本发明的标记基因包括荧光蛋白基因或荧光素酶基因。
本发明的核心蛋白 DNA 序列 3’ 端引入的酶切位点为重组腺病毒载体本身所不含 有的任何酶切位点。
本发明的重组腺病毒载体为下列载体中的任意一种 ：
(1) 用数均分子量为 4000 ～ 8000 的聚乙二醇化学修饰或不修饰的重组腺病毒载 体； (2) 腺病毒载体衣壳蛋白的遗传修饰或不修饰的重组腺病毒载体 ；
(3) 条件复制型重组腺病毒载体 ；
(4) 携带至少一个治疗基因或小干扰 RNA 的条件复制型的重组腺病毒载体 ；
(5) 携带至少一个治疗基因或小干扰 RNA 的非复制型的重组腺病毒载体 ；
本发明的核心蛋白为腺病毒的核心蛋白Ⅶ或核心蛋白Ⅴ或核心蛋白Ⅹ。
本发明采用一种新的标记腺病毒核心蛋白的方法， 该方法实现了对腺病毒核心蛋 白真正意义的遗传水平上的荧光标记， 这种标记方法删除了腺病毒基因组中的原有的核心 蛋白基因， 因此采用本发明的方法标记腺病毒核心蛋白， 可以获得的 100％被荧光蛋白标记 的病毒颗粒。
附图说明
图 1 是用于组装核心蛋白 pVII 上下游同源臂的穿梭质粒载体示意图。
图 2 是核心蛋白 pVII 上下游同源臂连入穿梭质粒载体后的结构示意图。
图 3 是通过同源重组获得的引入特异 SfuI 酶切位点的腺病毒骨架载体结构示意 图。
图 4 是核心蛋白 pVII 被红色荧光蛋白 mCherry 标记后的腺病毒载体的结构示意 图。
图 5 是核心蛋白 pVII 被绿色荧光蛋白 eGFP 标记后的腺病毒载体的结构示意图。
图 6 是核心蛋白 pVII 被荧光素酶 Luciferase 标记后的腺病毒载体的结构示意 图。 具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明， 但本发明并不限于这些实施例。 实施例 1
以红色荧光蛋白 (mCherry) 标记核心蛋白 pVII 腺病毒载体的构建过程为例其构 建方法步骤如下 ：
1、 构建向腺病毒基因组核心蛋白 DNA 序列 3’ 端引入单一酶切位点的穿梭载体
通过酶切连接方式将合成的 DNA 序列连入 pUC19 质粒载体， pUC19 质粒载体为市 场上销售的商品， 由英国 NEB 公司生产， 通过质粒提取酶切鉴定以及测序获得阳性克隆， 将 阳性克隆命名为 pUC19M， 载体结构如图 1 所示， 由图 1 可见， 合成的 DNA 序列包含以下酶切 位点 ： XbaI-BamHI-SfuI-XhoI-ClaI。
以腺病毒基因组 DNA 为模板设计两对引物分别用来扩增用于同源重组的核心蛋 白 DNA 序列上下游 1500bp 的 DNA 序列， 上游 DNA 序列包含腺病毒的核心蛋白Ⅶ本身的 DNA 序列。P1-P4 为两对引物的序列 ：
P1 ： ATCTAGACATTCCCGCACTGTTGGATGTGGACGCCTA
P2 ： TGGATCCACCTCCACCTCCGTTGCGCGGGGGGCGGGTGCG
P3 ： ACTCGAGATTGCAAGAAAAAACTACTTAGACTC
P4 ： TATCGATTGCGCCTGCAAGGCCACGGATGCAATT
聚合酶链式反应的条件是 ： 94℃ 30 秒， 98℃ 10 秒 55℃ 5 秒 72℃ 2 分钟， 30 个循 环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为 1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的 聚合酶链式反应产物与 pGEMT-easy 载体连接。连接条件为 ： pGEMT-easy 载体 0.5μl， 聚合 酶链式反应回收产物 4μl， 2×T4DNA 快速连接酶缓冲液 5μl， T4DNA 快速连接酶 0.5μl， 25℃反应 1 个小时后转化感受态的 DH5α 细胞， 并涂布于含有 100μg/ml 的氨苄青霉素的 LB 平板中。挑取菌落接种到含有 100μg/ml 的氨苄青霉素的 LB 培养液中， 14 ～ 16 小时 后， 经碱性裂解法提取质粒 DNA， 通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆。将所获得的阳性克隆 分别命名为 pGEMT/pVII no stop up 和 pGEMT/pVII HRdown。将 pVII no stop up 片段从 pGEMT/pVII no stop up 载体上经 XbaI 和 BamHI 双酶切下来， 经 1％的琼脂糖凝胶电泳回收 后连入同样经 XbaI 和 BamHI 酶切过的穿梭载体中。连接条件是 ： 4μl 酶切纯化片段， 5μl 2×T4DNA 连接酶缓冲液， 0.5μl 酶切载体， 0.5μl T4 DNA 连接酶。 连接产物采用同样的方 法转化、 提取质粒 DNA、 酶切鉴定获得阳性克隆， 命名为 pUC19M pVII up shuttle。将 pVII HR down 片段从 pGEMT/pVII HR down 载体上经 XhoI 和 ClaI 双酶切下来， 经 1％琼脂糖凝 胶电泳回收后连入同样经 XhoI 和 ClaI 双酶切的 pUC19M pVII up shuttle 载体中。连接 条件是 ： 4μl 酶切纯化片段， 5μl 2×T4DNA 连接酶缓冲液， 0.5μl 酶切载体， 0.5μl T4 DNA 连接酶。连接产物采用同样的方法转化、 提取质粒 DNA、 酶切鉴定获得阳性克隆， 命名为 pUC19M pVII up down shuttle， 该载体的结构如图 2 所示， 由图 2 可见， 核心蛋白 pVII 基 因及其上下游基因序列连入 pUC19M 载体中。
将两端酶切位点为 BamHI 和 SfuI 位点的 β- 半乳糖苷酶基因 (LacZa) 表达元件 连入经过 BamHI 和 SfuI 双酶切的 pUC19M-pVII up down shuttle 载体， 该 β- 半乳糖苷酶 基因 (LacZa) 表达元件也可采用氨苄青霉素、 卡那霉素、 氯霉素等筛选基因中的任意一种 替换。连接条件是 ： 4μl 酶切纯化片段， 5μl 2×T4DNA 连接酶缓冲液， 0.5μl 酶切载体， 0.5μl T4 DNA 连接酶。连接产物采用同样的方法转化、 提取质粒 DNA、 酶切鉴定获得阳性
克隆， 命名为 pUC19M-pVII up down/LacZa shuttle。
2、 引入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体
将 pUC19M-pVII up down/LacZa shuttle 经 XbaI 和 ClaI 双酶切， 经 1％琼脂糖 凝胶电泳回收大片段后与用数均分子量为 4000 ～ 8000 的聚乙二醇化学修饰的重组腺病 毒质粒载体 pAd5EB214 共转化 Bj5183 感受态细胞， 也可用不经数均分子量为 4000 ～ 8000 的聚乙二醇化学修饰的重组腺病毒载体， 涂布于含有 100μg/ml 的氨苄青霉素的 LB 平板并 加入 50μl 的 40mg/ml 的 X-gal 进行蓝白斑筛选。经摇菌、 提取质粒 DNA、 酶切鉴定获得阳 性克隆， 命名为 pAd5EB214/LacZa， 该腺病毒骨架质粒载体中被引入单一 SfuI 的酶切位点， 该载体的结构如图 3 所示， 上述的单一 SfuI 的酶切位点， 也可采用 PacI、 SwaI 中的任意一 个。由图 3 可见 ： 穿梭载体的 pVII up down/LacZaDNA 序列与腺病毒骨架质粒同源重组后 将 SfuI 位点引入腺病毒骨架质粒载体中。
3、 构建红色荧光蛋白 (mCherry) 标记核心蛋白 pVII 穿梭载体
根据 mCherry 基因序列设计一对引物扩增 mCherry 基因， P1-P2 为 mCherry 基因 扩增引物 ：
P1 ： AAGATCTGGAGGTGGCGGAATGGTGAGCAAGGGCGAG P2 ： TGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCAT
聚合酶链式反应的条件是 ： 94℃ 30 秒， 98℃ 10 秒 55℃ 5 秒 72℃ 2 分钟， 30 个循 环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为 1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的 聚合酶链式反应产物与 pGEMT-easy 载体连接。连接条件为 ： pGEMT-easy 载体 0.5μl， 聚合 酶链式反应回收产物 4μl， 2×T4DNA 快速连接酶缓冲液 5μl， T4DNA 快速连接酶 0.5μl， 25℃反应 1 个小时后转化感受态的 DH5α 细胞， 并涂布于含有 100μg/ml 的氨苄青霉素的 LB 平板中。挑取菌落接种到含有 100μg/ml 的氨苄青霉素的 LB 培养液中， 14 ～ 16 小时 后， 经碱性裂解法提取质粒 DNA， 通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为 pGEMT/mCherry。
将 mCherry 基因片段从 pGEMT/mCherry 载体上经 BglII 和 SalI 双酶切回收后连 入经 BamHI 和 XhoI 双酶切的 pUC19M pVII up down shuttle 载体中。 连接条件是 ： 4μl 酶 切纯化片段， 5μl 2×T4DNA 连接酶缓冲液， 0.5μl 酶切载体， 0.5μl T4DNA 连接酶。连接 产物采用同样的方法转化、 提取质粒 DNA、 酶切鉴定获得阳性克隆， 命名为 pUC19M pVII up down/mCherry shuttle。
4、 构建红色荧光蛋白 mCherry 标记核心蛋白 pVII 腺病毒质粒载体
将 pUC19M-pVII up down/mCherry shuttle 质粒载体经 ClaI 和 XbaI 双酶切， 经 1 ％琼脂糖凝胶电泳大片段后与经 SfuI 线性化的腺病毒骨架载体 pAd5 EB214/LacZa 共转化 Bj5183， 涂布于含有 100μg/ml 的氨苄青霉素的 LB 平板并加入 50μl 的 40mg/ml 的 X-gal 用来蓝白斑筛选。经摇菌、 提取质粒 DNA、 酶切鉴定获得阳性克隆， 命名为 pAd5 EB214/mCherry， 此载体即为红色荧光标记核心蛋白 pVII 腺病毒质粒载体， 该载体的结构 如图 4 所示， 由图 4 可见， 红色荧光蛋白基因 mCherry 插入在核心蛋白 pVII 下游， 形成 pVII-mCherry 融合蛋白。
5、 红色荧光蛋白 mCherry 标记核心蛋白 pVII 腺病毒的包装及纯化
将 PacI 线性化的荧光标记核心蛋白 pVII 腺病毒质粒载体 pAd5 EB214/mCherry
转染 HEK293 细胞， 7-10 天后收获病毒， 经过 HEK293 细胞大量扩增后采用氯化铯密度梯度离 心纯化病毒， 获得 mCHerry 标记核心蛋白的腺病毒 Ad5/pVII-mCherry， 在冰箱内 -80℃内保 存。
实施例 2
以绿色荧光蛋白 (eGFP) 标记核心蛋白 pVII 腺病毒载体的构建过程为例其构建方 法步骤如下 ：
1、 腺病毒基因组核心蛋白 DNA 序列 3’ 端引入单一的酶切位点的穿梭载体
以腺病毒基因组 DNA 为模板设计两对引物分别用来扩增用于同源重组的核心蛋 白 DNA 序列上下游 800bp 的 DNA 序列， 上游 DNA 序列包含腺病毒的核心蛋白Ⅶ本身的 DNA 序列。P1-P4 为两对引物的序列 ：
P1 ： ATCTAGACGCGCCCGCCAGCCCCCACCATCACCACCG
P2 ： TGGATCCACCTCCACCTCCGTTGCGCGGGGGGCGGGTGCG
P3 ： ACTCGAGATTGCAAGAAAAAACTACTTAGACTC
P4 ： TATCGATGAGGCAACCGGGGACGTTTGTGTCTCC
聚合酶链式反应的条件是 ： 94℃ 30 秒， 98℃ 10 秒 55℃ 5 秒 72℃ 1 分钟， 30 个循 环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为 1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的 聚合酶链式反应产物与 pGEMT-easy 载体连接。 该步骤中的其他步骤与实施例 1 相同
2、 引入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体
引入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体的构建过程与实施例 1 相同， 获得成功引 入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体 pAd5EB214/LacZa。
3、 构建绿色荧光蛋白 eGFP 标记核心蛋白 pVII 穿梭载体
以绿色荧光蛋白 eGFP 基因序列为模板设计引物扩增 eGFP 基因， P1-P2 为 eGFP 基 因扩增引物 ：
P1 ： AAGATCTGGAGGTGGCGGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG
P2 ： TGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC
聚合酶链式反应的条件是 ： 94℃ 30 秒， 98℃ 10 秒 55℃ 5 秒 72℃ 2 分钟， 30 个循 环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为 1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的 聚合酶链式反应产物与 pGEMT-easy 载体连接。连接条件为 ： pGEMT-easy 载体 0.5μl， 聚合 酶链式反应回收产物 4μl， 2×T4DNA 快速连接酶缓冲液 5μl， T4DNA 快速连接酶 0.5μl， 25℃反应 1 个小时后转化感受态的 DH5α 细胞， 并涂布于含有 100μg/ml 的氨苄青霉素的 LB 平板中。挑取菌落接种到含有 100μg/ml 的氨苄青霉素的 LB 培养液中， 14 ～ 16 小时 后， 经碱性裂解法提取质粒 DNA， 通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为 pGEMT/eGFP。
将 eGFP 基因片段从 pGEMT/eGFP 载体上经 BgIII 和 SalI 双酶切回收后连入经 BamHI 和 XhoI 双酶切的 pUC19M pVII up down shuttle 载体中。 连接条件是 ： 4μl 酶切纯化 片段， 5μl 2×T4DNA 连接酶缓冲液， 0.5μl 酶切载体， 0.5μl T4DNA 连接酶。连接产物采 用同样的方法转化、 提取质粒 DNA、 酶切鉴定获得阳性克隆， 命名为 pUC19M-pVII up down/ eGFP shuttle。
4、 构建绿色荧光蛋白 eGFP 标记核心蛋白 pVII 腺病毒质粒载体
绿色荧光蛋白 eGFP 标记核心蛋白 pVII 腺病毒质粒载体的构建过程与实施例 1 相 同， 获得 eGFP 标记核心蛋白 pVII 腺病毒质粒载体 ： pAd5EB214/eGFP， 该载体的结构如图 5 所示， 由图 5 可见， 绿色荧光蛋白基因 eGFP 插入在核心蛋白 pVII 下游， 形成 pVII-eGFP 融 合蛋白。
5、 绿色荧光蛋白 eGFP 标记核心蛋白 pVII 腺病毒的包装及纯化
绿色荧光蛋白 eGFP 标记核心蛋白 pVII 腺病毒的包装及纯化与实施例 1 相同， 最 终获得 eGFP 标记核心蛋白 pVII 的腺病毒 Ad5/pVII-eGFP。
本实施例中用于标记核心蛋白 pVII 的绿色荧光蛋白基因 eGFP 也可用黄色荧光蛋 白基因 YFP、 蓝色荧光蛋白基因 EBFP、 青色荧光蛋白基因 ECFP 等荧光蛋白基因替换。
实施例 3
以荧光素酶 luciferase 标记核心蛋白 pVII 腺病毒载体的构建过程为例其构建方 法步骤如下 ：
1、 构建腺病毒基因组核心蛋白 DNA 序列 3` 端引入单一的酶切位点的穿梭载体
以腺病毒基因组 DNA 为模板设计两对引物分别用来扩增用于同源重组的核心蛋 白 DNA 序列上下游 10kb 的 DNA 序列， 上游 DNA 序列包含腺病毒的核心蛋白Ⅶ本身的 DNA 序 列。P1-P4 为两对引物的序列 ： P1 ： ATCTAGAAAGGTCAACGCTGGTGGCTACCTCTCCGCG
P2 ： TGGATCCACCTCCACCTCCGTTGCGCGGGGGGCGGGTGCG
P3 ： ACTCGAGATTGCAAGAAAAAACTACTTAGACTC
P4 ： TATCGATTCGGCGAACGGGCAGTGCCGGCGGCGC
聚合酶链式反应的条件是 ： 94℃ 30 秒， 98℃ 10 秒 55℃ 5 秒 72℃ 10 分钟， 30 个循 环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为 1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的 聚合酶链式反应产物与 pGEMT-easy 载体连接。
该步骤中的其他步骤与实施例 1 相同。
2、 引入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体
引入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体的构建过程与实施例 1 相同， 获得成功引 入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体 pAd5EB214/LacZa。
3、 构建荧光素酶 luciferase 标记核心蛋白 pVII 穿梭载体
以荧光素酶 luciferase 基因序列为模板设计引物扩增 luciferase 基因， P1-P2 为 luciferase 基因扩增引物 ：
P1 ： AAGATCTATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGG
P2 ： TTCTAGATTACACGGCGATCTTTCCGCCCTTCTTGG
聚合酶链式反应的条件是 ： 94℃ 30 秒， 98℃ 10 秒 55℃ 5 秒 72℃ 2 分钟， 30 个循 环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为 1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的 聚合酶链式反应产物与 pGEMT-easy 载体连接。连接条件为 ： pGEMT-easy 载体 0.5μl， 聚合 酶链式反应回收产物 4μl， 2×T4DNA 快速连接酶缓冲液 5μl， T4DNA 快速连接酶 0.5μl， 25℃反应 1 个小时后转化感受态的 DH5α 细胞， 并涂布于含有 100μg/ml 的氨苄青霉素的 LB 平板中。挑取菌落接种到含有 100μg/ml 的氨苄青霉素的 LB 培养液中， 14 ～ 16 小时
后， 经碱性裂解法提取质粒 DNA， 通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为 pGEMT/luciferase。
将 luciferase 基因片段从 pGEMT/luciferase 载体上经 BglII 和 XbaI 双酶切回 收后连入经 BamHI 和 XhaI 双酶切的 pUC19M pVII up down shuttle 载体中。连接条件是 ： 4μl 酶切纯化片段， 5μl 2×T4DNA 连接酶缓冲液， 0.5μl 酶切载体， 0.5μl T4DNA 连接 酶。连接产物采用同样的方法转化、 提取质粒 DNA、 酶切鉴定获得阳性克隆， 命名为 pUC19M pVII up down/luciferase shuttle。
4、 构建荧光素酶 luciferase 标记核心蛋白 pVII 腺病毒质粒载体
荧光素酶 luciferase 标记核心蛋白 pVII 腺病毒质粒载体的构建过程与实施例 1 相同， 获得 luciferase 标记核心蛋白 pVII 腺病毒质粒载体 ： pAd5EB214/luciferase， 该载 体的结构如图 6 所示， 由图 6 可见， 荧光素酶基因 luciferasw 插入在核心蛋白 pVII 下游， 形成 pVII-luciferase 融合蛋白。
5、 荧光素酶 luciferase 标记核心蛋白 pVII 腺病毒的包装及纯化
荧光素酶 luciferase 标记核心蛋白 pVII 腺病毒的包装及纯化与实施例 1 相同， 获得 luciferase 标记核心蛋白 pVII 的腺病毒 Ad5/pVII-luciferase。
实施例 4
在以上的实施例 1 ～ 3 的步骤 1 中， 所用的 pVII no stop up 片段用 pVno stop up 片段替换， pVIIHR down 片段用 pV HR down 片段替换， pGEMT/pVII HR down 载体用 pGEMT/pV HR down 载体替换， 该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。 在步骤 2 中， 所用的 pUC19M-pVII up down/LacZashuttle 用 pUC19M-pV up down/LacZa shuttle 替换， 该步骤 的其他步骤与相应的实施例相同。在步骤 3 中， 所用的 pUC19MpVII up down shuttle 载体 用 pUC19M-pV up down shuttle 载体替换， 该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。 在步骤 4 中， 所用的 pUC 19M-pVII up down/mCherry shuttle 质粒载体用 pUC 19M-pV up down/ mCherry shuttle 质粒载体替换， 该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。在步骤 5 中， 所 用的 pVII 腺病毒质粒载体用 pV 腺病毒质粒载体替换， 该步骤的其他步骤与相应的实施例 相同。构建成腺病毒核心蛋白遗传标记载体。
实施例 5
在以上的实施例 1 ～ 3 的步骤 1 中， 所用的 pVIIno stop up 片段用 pXno stop up 片段替换， pVIIHR down 片段用 pX HR down 片段替换， pGEMT/pVII HR down 载体用 pGEMT/pX HR down 载体替换， 该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。 在步骤 2 中， 所用的 pUC19M-pVII up down/LacZa
shuttle 用 pUC 19M-pX up down/LacZa shuttle 替换， 该步骤的其他步骤与相应 的实施例相同。在步骤 3 中， 所用的 pUC19M-pVII up down shuttle 载体用 pUC19M-pX up down shuttle 载体替换， 该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。在步骤 4 中， 所用的 pUC 19M-pVII up down/mCherry shuttle 质粒载体用 pUC19M-pX up down/mCherry shuttle 质 粒载体替换， 该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。在步骤 5 中， 所用的 pVII 腺病毒质 粒载体用 pX 腺病毒质粒载体替换， 该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。构建成腺病毒 核心蛋白遗传标记载体。
实施例 6在以上的实施例 1 ～ 5 的步骤 2 中， 所用的经数均分子量为 4000 ～ 8000 的聚乙 二醇化学修饰或不修饰的重组腺病毒载体用腺病毒载体衣壳蛋白的遗传修饰或不修饰的 重组腺病毒载体替换。其他步骤与相应的实施例相同。构建成腺病毒核心蛋白遗传标记载 体。
实施例 7
在以上的实施例 1 ～ 5 的步骤 2 中， 所用的经数均分子量为 4000 ～ 8000 的聚乙 二醇化学修饰或不修饰的重组腺病毒载体用条件复制型重组腺病毒载体替换。 其他步骤与 相应的实施例相同。构建成腺病毒核心蛋白遗传标记载体。
实施例 8
在以上的实施例 1 ～ 5 的步骤 2 中， 所用的经数均分子量为 4000 ～ 8000 的聚乙 二醇化学修饰或不修饰的重组腺病毒载体用携带 2 个治疗基因的条件复制型重组腺病毒 载体替换， 也可用携带 1 个小干扰 RNA 的条件复制型的重组腺病毒载体替换。其他步骤与 相应的实施例相同。构建成腺病毒核心蛋白遗传标记载体。
实施例 9
在以上的实施例 1 ～ 5 的步骤 2 中， 所用的经数均分子量为 4000 ～ 8000 的聚乙 二醇化学修饰或不修饰的重组腺病毒载体用携带 1 个治疗基因的非复制型重组腺病毒载 体替换， 也可用携带 2 个小干扰 RNA 的条件复制型的重组腺病毒载体替换。其他步骤与相 应的实施例相同。构建成腺病毒核心蛋白遗传标记载体。